PLoS ONE: Påvisning af den heterogene O-Glykosylering Profil af MT1-MMP Udtrykt i kræftceller ved en simpel MALDI-MS Method

Abstrakt

Baggrund

Glycosylering er en vigtig og universel indlæg -translational modifikation for mange proteiner, og regulerer proteinfunktioner. Men for at enkle og hurtige metoder analysere glycaner på individuelle proteiner har ikke været tilgængelige indtil for nylig.

Metoder /vigtigste resultater

En ny teknik til at analysere glycopeptider i en meget følsom måde ved matrix-assisteret laser desorption /ionisering-massespektrometri (MALDI-MS) under anvendelse af flydende matrix 3AQ /CHCA blev udviklet for nylig, og vi optimeret denne teknik til at analysere en lille mængde transmembranprotein separeret ved SDS-PAGE. Vi anvendte MALDI-MS-metode til at evaluere glycosylering status membran-type 1 matrixmetalloproteinase (MT1-MMP).

O

-glycosylation af MT1-MMP er rapporteret at modulere sin proteaseaktivitet og derved påvirke cancercelleinvasion. MT1-MMP udtrykt i humane fibrosarcomceller HT1080-celler blev immunopræcipiteret og opløst ved SDS-PAGE. Efter i-gel tryptisk spaltning af proteinet, blev en enkelt dråbe af fordøjelsen påføres direkte på flydende matrix på en MALDI målplade. Koncentration af hydrofile glycopeptider inden for det centrale område opstået som følge af en gradvis fordampning af prøveopløsningen, mens ikke-glycosylerede hydrofobe peptider forblev på periferien. Denne specifikke separation og koncentration af glycopeptider aktiveret omfattende analyse af MT1-MMP

O

-glycosylation.

Konklusioner /Betydning

Vi viser for første gang, heterogen

O

-glycosylation profil af et protein fra en helt protein-analyse ved anvendelse MALDI-MS. Da cancerceller er rapporteret at have ændret glycosylering af proteiner, denne let-at-bruge fremgangsmåde til glycopeptid analyse åbner op for muligheden for at identificere specifikke glycosyleringsmønstre af proteiner, der kan anvendes som nye biomarkører for maligne tumorer.

Henvisning: Shuo T, Koshikawa N, Hoshino D, Minegishi T, Ao-Kondo H, Oyama M, et al. (2012) Påvisning af den heterogene

O

-Glycosylation Profil af MT1-MMP Udtrykt i kræftceller ved en simpel MALDI-MS metode. PLoS ONE 7 (8): e43751. doi: 10,1371 /journal.pone.0043751

Redaktør: Nikos K. KARAMANOS, University of Patras, Grækenland

Modtaget: April 5, 2012; Accepteret: 27 Juli 2012; Udgivet: 22 august, 2012 |

Copyright: © Shuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) [22.700.375] (til TS), en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (S) [22.220.014] (til MS) og Global COE Program “center for uddannelse og forskning for Avanceret Genome – Baseret medicin – for personlig medicin og kontrol af verdensomspændende smitsomme sygdomme “(til TS og MS) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT) i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. SS, SI, og KT er medarbejdere i Shimadzu Corporation. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Glycosylering er en almindelig og meget varieret co- og posttranslationel protein modifikation [1 ]. Akkumulere data viser, at tilsætning eller ændring af en eller flere sukkerdele kan have forskellige virkninger på proteinfunktion og sådanne modifikationer har været impliceret i forskellige typer af sygdom [2]. Især specifikke ændringer i protein

O

-glycosylation er blevet rapporteret i maligne tumorer [3], [4], [5].

O

-glycosylation initieres ved tilsætning af en

N

-acetylgalactosamine (GalNAc) til en hydroxylgruppe på en serin eller threonin rest efterfulgt af den efterfølgende tilsætning af galactose eller

N

-acetylglucosamine (GlcNAc), som danner kernestrukturen af ​​glycankæden [6]. Core

O

-glycans kan yderligere udvides ved andre kulhydratdele såsom fucose og /eller sialinsyre. Det er blevet rapporteret, at de centrale strukturer

O

-glycans er involveret i den metastatiske kapacitet af cancerceller. For eksempel Iwai

et al

. viste, at tvungen udtryk for β1,3-

N

-acetylglucosaminyltransferase 6, som tilføjer β1,3-linked GlcNAc til GalNAc på de reducerende endestation, i menneskelig fibrosarcomceller FP-10 celler (en meget invasiv variant af HT1080 celler ) resulterede i signifikant reduktion i

in vitro

migration evne og i dannelsen af ​​lungemetastaser

in vivo

i mus [7].

MT1-MMP er et type i transmembrane proteinase, der spiller afgørende roller i tumorcelleinvasion, på grund af sin evne til at spalte et bredt spektrum af ekstracellulære matrix-makromolekyler herunder collagener og lamininer og aktivere proMMP-2 [8]. MT1-MMP har en multi-domæne struktur med en katalytisk domæne (Thr

112-Gly

285), et hængsel domæne (Glu

286-Ile

318), et hæmopexin-lignende domæne ( Cys

319-Cys

508) og en stilk domæne (Pro

509-Ala

541) i den ekstracellulære region [9]. Nylige undersøgelser viser, at MT1-MMP er posttranslationelt modificeret ved

O

-glycan flere steder inden hængslet domæne. Denne modifikation er blevet impliceret i substratgenkendelse [10], proteinstabilitet [11], og omsætningen af ​​enzymet [12]. For eksempel, Wu

et al

. viste, at MT1-MMP

O

-glycosylation påvirker proMMP-2-aktivering på celleoverfladen [10]. Mulige glycosyleringssites af MT1-MMP blev foreslået af aminosyresekvensanalyse og site-directed mutagenese [10], [13] og de glycan dele blev analyseret ved hjælp af lektiner og glycosidaser [10], [11]. MT1-MMP udtrykkes sædvanligvis på lave niveauer (1-2 × 10

5 molekyler /celle), selv i cancerceller [14]. Derfor er disse biokemiske metoder ikke egnede til at analysere den heterogene glycosylering status MT1-MMP, især i kliniske prøver.

MALDI-MS [15], [16] er et uundværligt analytisk redskab til at belyse både peptidet og glycan dele af glycopeptider [17]. Imidlertid er glycopeptider generelt mere ineffektivt ioniseret end glycosylerede peptider, og desuden er mængden af ​​glycopeptid genereret ved protease-fordøjelse af en proteinprøve er normalt ganske små sammenlignet med den for ikke-glycosyleret peptid. Derfor er forudgående separation af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider uundgåeligt kræves til MS-analyse [18]. En nyligt udviklet MALDI teknik under anvendelse af en flydende matrix 3AQ /CHCA, som er sammensat af 3-aminoquinolin og α-cyano-4-hydroxykanelsyre, aktiveret on target adskillelse af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider baseret på forskelle i deres hydrofilicitet efter en dråbe protease-fordøjelse blev påført på den flydende matrix på en MALDI måltavle [19]. Denne on target adskillelse metode blev anvendt til at analysere

N

-glycosylation af ribonuklease B, der anvendes som en model glycoprotein. Her anvendte vi og optimeret den nye MALDI-MS metode til at analysere den

O

-glycosylation profil MT1-MMP udtrykt i cancerceller på et lavt niveau, og forsøgte at påvise heterogene modifikation status.

Resultater

On-target Adskillelse af peptider på en Liquid matrix 3AQ /CHCA

Peptider af forskellige hydrofile kan adskilles på den flydende matrix 3AQ /CHCA spottet på en MALDI måltavle [19] . Den 3AQ /CHCA matrix danner et gulfarvet viskos stedet når den anvendes til målet plade som vist i fig. 1A. En enkelt dråbe af proteolytisk fordøjelse af en proteinprøve indeholdende både glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider derefter spottet på overfladen af ​​den flydende matrix. Prøven spredes ensartet på den flydende matrix og prøveopløsningen fordamper gradvist inden for ca. 12 min (fig. 1B). Under fordampning, er hydrofile bestanddele, som f.eks glycopeptider koncentreret i det centrale område. I modsætning hertil hydrofobe peptider tendens til at blive udelukket fra den fordampende opløsning og efterlades ved periferien af ​​den flydende matrix.

(A) Skematisk afbildning af on target separationsmetode beskrevet i denne undersøgelse. 3AQ /CHCA først spottet på MALDI målplade, og derefter de proteolytiske helt protein fordøjer indeholdende både glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider anvendes på den øvre overflade af den flydende matrix. (B) Tidsforløb overvågning af prøven dråbe på flydende matrix. Fordampning af prøveopløsningen tillader dråben til at skrumpe sådan, at de hydrofile bestanddele gradvist er koncentreret i en fokuseret dråbe.

Påvisning af glycosyleret peptider af endogene MT1-MMP

MT1-MMP er en integreret membran proteinase udtrykt på overfladen af ​​aggressive cancerceller. Vi forsøgte først at detektere MS-spektrum genereres fra glycopeptider af MT1-MMP udtrykt i cancerceller. Endogen MT1-MMP blev immunpræcipiteret fra membran lysater af humane fibrosarkom HT1080-celler under anvendelse af et monoklonalt anti-MT1-MMP antistof fremstillet i vores laboratorium som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Sialinsyrer, som kan modstå ionisering i MS-analyse [20], blev fjernet ved hjælp af sialidase. Prøver blev derefter separeret ved SDS-PAGE (fig. 2A). Fortyndinger af okseserumalbumin (BSA) blev også anvendt til gelen at estimere proteinmængden (data ikke vist). Gelen blev farvet med Coomassie Blue og ca. 150 ng af MT1-MMP-proteinet blev udskåret (Fig. 2A er frekvensbåndet indklammet). Det isolerede gel-fragment blev udsat for in-gel fordøjelse med trypsin og en tresindstyvendedel af fordøjelsen blev påført direkte på 3AQ /CHCA matrix på en MALDI målplade.

(A) Endogen MT1-MMP var immunopræcipiteret med anti-MT1-MMP-antistof-konjugeret harpiks fra membran lysater af vildtype HT1080-celler og blev yderligere separeret ved SDS-PAGE og farvning med Coomassie Blue. Sialidase, der indeholder BSA som en bærer proteinet, blev sat i lyset bane (betegnet med asterisk). Tal på venstre side af panelet repræsenterer molekylmasser i kilodalton (kDa). (B) Polypeptidet bånd svarende til MT1-MMP blev udskåret, spaltet i-gel med trypsin. En alikvot af tryptisk MT1-MMP-fordøjelse afledt fra HT1080-celler blev påført direkte på den flydende matrix 3AQ /CHCA på MALDI målplade. MS-spektrum blev opnået under det centrale område af den flydende matrix (åben cirkel [○]). En stereoskopisk mikroskop billede af prøven stedet er vist i den øverste venstre insert. Nummer repræsenterer den akkumulerede intensitet af den øverste top (arbitrære enheder).

tryptisk MT1-MMP fordøje påføres flydende matrix på en MALDI target plade blev tilladt at fordampe og den centrale del af prøven varerum blev bestrålet under anvendelse af en laserstråle (fig. 2B, indsatte billede). MS-spektret genereret omfattede adskillige toppe (

m /z

2,042.5, 2,245.1, 2,406.9, 2,609.7, 2,771.6, 2,974.0 og 3,135.8), og afstandene mellem toppene svarede nøjagtigt til masserne af typiske monosaccharider: 162 og 203 Da for hexose (Hex) og

N

-acetylhexosamine (HexNAc) henholdsvis (fig. 2B). Derfor blev disse toppe menes at være afledt af et enkelt peptid glycosyleret forskelligt.

Analyse af glycosyleret peptider

For yderligere at undersøge glycopeptid toppe afledt af MT1-MMP ved anden og tredje fase af MS analyser (MS

2 og MS

3), vi anvendte en FLAG-mærket MT1-MMP (MT1-FLAG) udtrykt i HT1080 celler på grund af den grund, at en stor mængde af FLAG-mærkede protein kan oprenses nemt og effektivt. At gengive det native glycosyleringsmønster MT1-MMP i cellerne, blev MT1-FLAG udtrykkes stabilt på et niveau kan sammenlignes med det endogene protein i vildtypeceller. Vi udtrykte MT1-FLAG i en HT1080 derivat, hvor ekspressionen af ​​endogene MT1-MMP blev slået ned ved hjælp shRNA. Niveauer af MT1-MMP-ekspression i cellerne blev bekræftet ved Western blot analyse (fig. S1A). MT1-FLAG, blev oprenset fra membran lysater af de reverterende celler under anvendelse af anti-FLAG-antistof. Ca. 400 ng af MT1-FLAG-protein blev opløst ved SDS-PAGE (fig. S1B) og derefter analyseret ved on target separationsmetode gennem MALDI-MS.

Den opnåede MS-spektret af MT1-FLAG var næsten identisk med det endogene MT1-MMP (fig. 3 versus fig. 2B), undtagen en hydrofil FLAG-tag (DYKDDDDK) -holdige peptid top ved

m /z

1,786.9 i MT1-FLAG. Kollisionen-induceret dissociation af stor protoneret ion [M + H]

+ toppe (

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 og 3,134.2) via MS

2 angivne at fragmentionerne svarer til en serie af tab i monosaccharider fra den glycosylerede peptid

299TTSRPSVPDKPK

310 (fig. 4). De glycoformer af dette peptid indeholdt 2 til 5 Hex og HexNAc. Fragment ion spektre blev også opnået fra et andet glycopeptid

278GIQQLYGGESGFPTK

292 som en sodiated ion [M + Na]

+ toppe på

m /z

1,968.7 (fig. S2A). MS

2 produkt ion ved

m /z

1,024.0 viste sig at være en Hex-HexNAc indeholder peptid

287SGFPTK

292 af MS

3 fragmentering (Fig. S2B). Et resumé af de identificerede glycopeptider er angivet skematisk på strukturen af ​​MT1-MMP (fig. 5). Således har vi været i stand til at opdage glycosylerede peptider af MT1-MMP ved MS-analyse af en hel proteinekstrakt fra en gel. Sådanne glycopeptidforbindelser toppe blev ikke opnået, når den samme prøve blev analyseret ved anvendelse af en konventionel fast matrix DHB [21] som vist i fig. S3. Disse resultater klart angive overlegenhed af den nye metode ved hjælp af flydende matrix 3AQ /CHCA.

En portion af tryptisk MT1-FLAG digest blev påført direkte på den flydende matrix 3AQ /CHCA. MS-spektrum blev opnået under det centrale område af den flydende matrix. De glycan dele og aminosyresekvenserne af peptider, herunder glycosyleringssteder af disse glycopeptider blev tildelt af MS

2 og MS

3. Nummer repræsenterer den kumulative intensiteten af ​​den øverste top (arbitrære enheder).

Ion toppe afledt af MS-spektret af tryptisk MT1-FLAG fordøjer på

m /z

2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 og 3,134.2 (fig. 3) blev udsat for MS

2 analyse. Disse fragment ioner blev tildelt til tabet af enkelte monosaccharider (162 og 203 Da for Hex og HexNAc henholdsvis) fra samme peptid-ion (

299TTSRPSVPD

307).

MT1- MMP er et type i transmembrant proteinase, og har en særlig multidomain struktur med en katalytisk domæne, et hængsel domæne, et hæmopexin-lignende domæne og et skaft domæne i den ekstracellulære region. Understreger indikerer glycopeptider identificeret i denne undersøgelse.

Heterogen Glykosylering Profil af MT1-MMP

For at forberede en standard protein prøve at oprette analysebetingelser i glycopeptid analyse, vi udarbejdet en opløseligt MT1-MMP, som mangler det transmembrane domæne, som blev udtrykt i Madin-Darby hunde nyre (MDCK) -celler. Resultat af MS-analyse af det opløselige MT1-MMP er vist i fig. S4. Kun én stor top glycopeptid blev opdaget for peptid

299TTSRPSVPDKPK

310. På den anden side, blev flere glycopeptidforbindelser toppe detekteret fra det samme peptid af MT1-FLAG udtrykt i HT1080 celler (Fig. 3). Derfor glycosyleringsmønster MT1-FLAG opnået fra HT1080 celler udgør en heterogen glycosyleringsprofil af peptidet, og det er ikke på grund af nedbrydning eller ændring af de carbohydratdelene under prøveforberedelse og sin ansøgning til MS-analyse. Tilsammen har dette on target adskillelse metoden kan blive en kraftfuld nem at bruge værktøj til at analysere heterogene glycosyleringsmønstre af proteiner af valg.

Påvisning af ikke-glycosylerede peptider på det samme mål Plate

MS spektre af glycopeptider blev fortrinsvis opnået fra det centrale område af prøven-loaded matrix. Dette resultat indikerer, at vi har opnået adskillelse af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider på flydende matrix. For at bekræfte yderligere adskillelsen af ​​de ikke-glycosylerede peptider på matrixen, analyserede vi periferien af ​​prøven-loaded område på flydende matrix laserstrålingen. Faktisk blev mange ikke-modificerede peptider afledt fra MT1-MMP digest opdaget (fig. S5, toppe markeret med stjerner), mens glycopeptider ikke blev påvist inden for dette område.

Samlet set opnåede vi ca. 50% sekvens dækning af den ekstracellulære region af MT1-MMP hjælp af denne metode (fig. S6). Således blev en hel protein analyse af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider opnået efter konventionel SDS-PAGE, i-gel fordøjelse, og direkte anvendelse af en enkelt dråbe af en prøve fordøje på den flydende matrix 3AQ /CHCA på MALDI måltavle.

Nedre grænse for protein beløb til den Assay

Vi endelig bestemt MS spektre genereret fra glycopeptider inden for et mindre beløb af prøven protein. Forskellige mængder af MT1-FLAG-protein blev underkastet SDS-PAGE og gelen blev farvet med Coomassie Blue. Mængden af ​​MT1-FLAG blev estimeret under anvendelse af BSA som en standard protein (fig. 6A). Dele af gel indeholdende prøven proteiner blev udskåret og analyseret på lignende måde (fig. 6B). Selvom topintensiteter MS spektre faldt efter prøven beløb, kunne vi opdage glycopeptidforbindelser toppe selv fra den mindste mængde af prøven og mængden af ​​protein læsset på den flydende matrix i dette tilfælde blev anslået til at være ca. 1,6 ng.

(A) MT1-FLAG blev seriefortyndet og derefter separeret ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie Blue. Sialidase, der indeholder BSA som et bærerprotein, blev lagt i langt-venstre bane (betegnet med asterisk). Tal på venstre af panelerne repræsenterer molekylmasser i kilodalton (kDa). (B) polypeptidet bånd svarende til MT1-FLAG blev udskåret, i-gel fordøjet med trypsin, og analyseres ved MS ved anvendelse af flydende matrix 3AQ /CHCA. Glycopeptider er indeholdt i hele proteinet fordøje opnået fra MT1-FLAG (ca. 1,6 ng baseret på sammenligning med en BSA-standard) blev påvist i centrum af den flydende matrix. Tallene angiver den kumulative intensitet af de øverste toppe (arbitrære enheder). Pilespidser indikerer glycopeptid ioner (se fig. 3).

Diskussion

Mange biokemiske værktøjer til rådighed til at analysere

N

-glycosylation af proteiner, mens dem, for

O

-glycosylation er begrænsede. Derfor analyse af

O

-glycosylation status af proteiner ved hjælp af små mængder af prøven har været teknisk udfordrende. En on-target separationsmetode, der gør brug af den flydende matrix 3AQ /CHCA for MALDI-MS, blev udviklet for nylig og anvendt til at analysere

N-

glycosylering af ribonuclease B. Vi anvendte denne metode til at analysere

O

-glycosylation af MT1-MMP udtrykt i lave niveauer i cancerceller.

on target separation under anvendelse af det flydende matrix er meget let og hurtig at analysere en blanding af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider sammenlignet med konventionel MS-analyse under anvendelse DHB. Da glycosylerede peptider svagt ioniseret forhold til ikke-glycosylerede dem, ikke kunne detekteres glycopeptid signaler, når den samme MT1-FLAG fordøjelsesprodukt blev påført på DHB matrix (fig. S3). Derfor kan DHB ikke bruges til glycopeptid analyse uden forudgående forarbejdning til separation af sidstnævnte. I modsætning hertil er forudgående separation af glycosylerede og ikke-glycosylerede peptider ikke nødvendig for MS-analyse ved brug 3AQ /CHCA. Da et yderligere separationstrin efter proteolytisk fordøjelse ikke er nødvendig, kun en lille mængde proteinprøve var tilstrækkelig til at opnå klare resultater som demonstreret i fig. 6. Endvidere flydende matrix 3AQ /CHCA er kompatibel med ikke kun analyser af Coomassie blåfarvede proteinprøver men også af sølv-farvede dem (data ikke vist). Sølvfarvning tillader påvisning af de fleste proteiner, da det er mere følsom end farvning med Coomassie blue. Betragtes samlet, MALDI-MS-metoden under anvendelse 3AQ /CHCA gøre det muligt at undersøge glycosylering af et protein, der er udtrykt i små mængder og /eller til stede i specifikke overfladeareal såsom lipidklumper hvor oprensningen er mere kompleks.

i denne undersøgelse vi primært brugt MT1-FLAG protein udtrykt i HT1080 celler til at evaluere den alsidighed af den nye anvendelse af den flydende matrix til at analysere glycoproteiner af MS. Det er simpelthen fordi vi har studeret MT1-MMP udtrykt i cancerceller og ønskede at bruge det som en standard transmembrant protein udtrykt på et lavt niveau. Vi har detekteret glycosylerede MT1-MMP peptid toppe afledt

278GIQQLYGGESGFPTK

292 og

299TTSRPSVPDKPK

310 (fig. 3). Derfor Thr og Ser-rester inden for disse peptider repræsenterer mulige

O

-glycosylation sites. Thr

291, Thr

299, Thr

300, og Ser

301 blev foreslået at være steder af

O

-glycosylation ved mutation analyse [10], [13]. Desuden fandt vi, at Ser

304 også glycosyleret i HT1080-celler ved at detektere et glycopeptid signal fra

303PSVPDKPK

310 af MS

2 analyse af sodiated ion [M + Na]

+ toppe på

m /z

2,791.9 som i fig. 3 (data ikke vist). Selv om disse resultater er stort set bekræftende, analysen afslørede også det heterogene

O

-glycosylated peptid toppe fra

299TTSRPSVPDKPK

310 (fig. 4). Således er en hel protein MS-analyse ved hjælp af flydende matrix er et kraftfuldt værktøj til at analysere heterogenitet glycosyleringen. Fremgangsmåden er let at bruge, selv for kliniske prøver, hvor specifikke antistoffer er tilgængelige for immunoaffinitetsoprensning af målproteiner fra celler, væv, sera, og urin. Siden ændrede glycosylering af proteiner er blevet forbundet med kræft progression [3], [4], [5], on target adskillelse metode under anvendelse 3AQ /CHCA vil accelerere analyse af heterogenitet af

O

-glycosylation for forskellige cancer-relaterede proteiner. Hvis der er kræft-specifikke variationer, de identificerede

O

-glycans kan repræsentere ny kandidat biomarkører for maligne tumorer. Derudover er der en stigende interesse for bioteknologi-baserede lægemidler, der er fremstillet under anvendelse af levende celler. Glycosyleringen status for disse biologiske produkter har vist sig at være vigtigt at dets farmakologiske egenskaber [22]. Den nuværende MALDI-MS-metode kan blive et værdifuldt redskab til glycoanalysis af kliniske prøver samt vurdering af kvaliteten af ​​biologiske lægemidler.

Materialer og metoder

Cell Culture

Humane HT1080 fibrosarcomceller (American Type Culture Collection, Manassas, VA) blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 10 uM MMI270 (en syntetisk hydroxamsyre matrixmetalloproteinaseinhibitor, en slags gave Novartis Pharma AG, Basel, Schweiz), og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator.

lentivirusvektorer for MT1-MMP Expression og Knockdown

Den shRNA sekvens anvendes til knockdown af MT1-MMP var 5′-CACCGCAGCCTCTCACTACTCTTTCCGAAGAAAGAGTAGTGAGAGGCTGC-3 ‘. Et DNA fragment, der koder sekvensen blev subklonet ind pENTR /U6 TOPO (Invitrogen) og overføres derefter via rekombination ind i lentivirusvektor pLenti6 blokere det (Invitrogen). En konstruktion, der koder humant MT1-MMP mærket med FLAG-epitopen (DYKDDDDK) blev beskrevet tidligere [23]. En cDNA-klon af FLAG-mærket MT1-MMP (MT1-FLAG) blev amplificeret ved PCR under anvendelse af følgende primere: 5’-CACCATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3 ‘og 5′-TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3’. Det amplificerede MT1-FLAG-sekvens blev subklonet ind pENTR /D-TOPO og overføres derefter via rekombination i den lentivirale pLenti6 /V5-DEST ekspressionsvektor (Invitrogen). Disse lentivirusvektorer blev dannet og anvendt ifølge producentens anvisninger.

MT1-MMP Knockdown og revertant cellelinie

MT1-FLAG blev udtrykt i lentivirus-inficerede HT1080-celler (reverterende celler), hvor ekspressionen af ​​endogene MT1-MMP blev først forarmet ved at udtrykke shRNA målretning det endogene MT1-MMP (knockdown-celler). MT1-FLAG blev udtrykt på et niveau svarende til den for vildtype-protein baseret på Western blot-analyse.

helcellelysat Fremstilling

35 cm

2 celle-dyrkningsskåle indeholdende subkonfluerende vildtype, MT1-MMP knockdown og MT1-FLAG revertant HT1080 celler suppleret med 10 pM MMI270 blev vasket med PBS og lyseret ved kogning i 200 pi Laemmlis prøvebuffer [24] indeholdende 5% β-mercaptoethanol. En 10 pi alikvot af lysatet blev anvendt til Western blot-analyse.

Membran Lysate Forberedelse

Alle procedurer blev udført ved 4 ° C. Seksten 150 cm

2 celle-dyrkningsskåle indeholdende subkonfluente kulturer af vildtype eller MT1-FLAG revertant HT1080 celler supplementated med 10 pM MMI270 i medierne blev vasket med PBS og skrabet i 32 ml saccharose /Hepes-puffer (0,25 M saccharose /20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) indeholdende proteaseinhibitorer (proteaseinhibitorcocktail sæt I, Calbiochem, San Diego, CA). Cellerne i bufferen var Dounce-homogeniseret (10 gange). Homogenatet blev centrifugeret ved 1.000 x g i 7 min. Pelleten blev igen homogeniseret i 16 ml saccharose /Hepes-puffer, og suspensionen blev centrifugeret 1.000 x g i 7 min. Supernatanterne blev kombineret og centrifugeret ved 2.000 x g i 30 min. Supernatant fra denne centrifugering blev ultracentrifugeret ved 105.000 x g i 1 time. Pellets blev resuspenderet i 1 ml lysepuffer (1% Triton X-100/20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) indeholdende proteaseinhibitorer og derefter centrifugeret ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten betegnes som membranen lysatet, hvilket resulterer i en proteinkoncentration på ca. 10 mg /ml. Proteinkoncentrationen i lysatet blev bestemt ved anvendelse af et Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) med BSA som en referencestandard.

Endogen MT1-MMP Isolation

et monoklonalt antistof for endogen MT1-MMP isolation blev fremstillet i vores laboratorium af en genetisk immunisering metode [25] under anvendelse af en fuld-længde human MT1-MMP ekspressionsplasmid. Dette antistof genkender en region i en stamme domæne af MT1-MMP (et papir under udarbejdelse). En 70 ug portion af MT1-MMP-specifikt antistof blev covalent bundet til 10 mg af epoxy-funktionaliseret magnetiske perler efter billede protokol (Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen). For immunopræcipitation blev 1 ml af membran lysater fremstillet fra vildtype HT1080-celler inkuberet 24 timer ved 4 ° C med 10 mg af anti-MT1-MMP antistof-konjugerede perler. Efter inkubation blev harpiksen opsamlet med en magnet og vasket med lyseringspuffer. Det bundne MT1-MMP blev elueret med 0,1 M glycin-HCI (pH 3,0), og derefter neutraliseret med 1 M Tris-HCI (pH 8,0). Eluatet blev koncentreret til 20 pi (ca. 7,5 ng protein /pi) ved diafiltrering under anvendelse af en Amicon Ultra indretning (afskæring: 10 kDa, Millipore, Billerica, MA).

FLAG-mærket MT1-MMP Isolation

Isolering af MT1-FLAG blev udført ved anvendelse af anti-FLAG M2 magnetiske perler (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev 1 ml af membran lysater fremstillet fra MT1-FLAG revertant HT1080-celler inkuberet 16 timer ved 4 ° C med 20 pi af harpiksen. MT1-FLAG blev elueret med 3 x FLAG-peptid i TBS indeholdende 0,1% CHAPS. Eluatet blev koncentreret til 20 pi (ca. 25 ng protein /pl) som beskrevet ovenfor.

Opløselig MT1-MMP Fremstilling

En MT1-MMP transmembrane deletionsmutant blev oprenset fra de konditionerede medier af Madin-Darby hunde nyre (MDCK) celler som beskrevet tidligere [26].

sialidase Behandling

for desialylering blev 500 ng af analyt behandlet med 5 mU sialidase /neuraminidase F (EF 3.2 .1.18. fra

Streptococcus

, Seikagaku Co., Tokyo, Japan) ved 37 ° C i 16 timer i 20 pi TBS indeholdende 0,1% CHAPS.

SDS-PAGE

prøver i Laemmlis prøvebuffer indeholdende 5% β-mercaptoethanol blev kogt i 5 min og derefter centrifugeret ved 20.000 x g i 5 min ved 25 ° C. Supernatanterne blev underkastet diskontinuert Tris-glycin-SDS-PAGE under anvendelse af en 4% stacking gel og en 10% separationsgel.

Western Blot

Efter elektroforese materialer i SDS-PAGE geler var elektrooverført på PVDF-membraner (Millipore), og membranerne blev blokeret med 5% skummetmælk i PBS. Immunreaktive materialer blev påvist ved farvning med de angivne antistoffer under anvendelse af kemiluminescens-substrat Western Lightning (Perkin Elmer Inc., Waltman, MA). Følgende antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse: et monoklonalt anti-MT1-MMP-antistof (222-1D8, en generøs gave fra Dr. Kazushi Iwata, Daiichi Fine Chemical, Takaoka, Japan), et polyklonalt anti-FLAG-antistof (Sigma-Aldrich ), et monoklonalt anti-β-tubulin-antistof (E7, Udviklingsstudier Hybridoma Bank, University of Iowa, USA), peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse-IgG-antistof og anti-kanin IgG-antistof (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ).

Densitometri

intensiteten af ​​Coomassie Blue-farvet protein blev kvantificeret ved hjælp ImageJ 1,43 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

3AQ /CHCA Liquid Matrix

Koncentreret 3AQ /CHCA blev fremstillet ved at opløse 35 mg af 3-aminoquinolin (Fluka Analytiske, Sigma-Aldrich) i 150 pi af en mættet opløsning af α-cyano-4-hydroxykanelsyre (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Frankrig) i methanol. Den koncentrerede 3AQ /CHCA opløsning blev fortyndet 10 gange ved hjælp af 100 mM ammoniumphosphat, og henviste som den flydende matrix 3AQ /CHCA. En mættet CHCA opløsning blev fremstillet ved at opløse 10 mg CHCA i 540 pi 50% acetonitril /0,1% trifluoreddikesyre og 60 pi 100 mM ammoniumphosphat.

DHB Matrix

DHB (2 , 5-dihydroxybenzoesyre) matrix-opløsning blev fremstillet ved at opløse 10 mg DHB (LaserBio Labs) i 1 ml 50% acetonitril /0,1% trifluoreddikesyre. For DHB matrix analyse blev en 0,5 pi alikvot af tryptisk MT1-MMP-fordøjelse, som var blevet blandet med et tilsvarende volumen af ​​DHB matrix opløsning plettet på en målplade og fik lov at tørre.

Tryptisk In-gel fordøjelse

i-gel fordøjelse blev udført ifølge fremgangsmåden af ​​Shevchenko

et al

[27]. En region af gelen indeholdende MT1-MMP-proteinet farvet med kolloidt Coomassie Blue G-250 (SimpleBlue SafeStain, Invitrogen) blev udskåret og skåret i små stykker. MT1-MMP gelstykker blev affarvet med 50 mM ammoniumbicarbonat i 50% methanol og derefter tørret under vakuum centrifugering.