PLoS ONE: Beta-Catenin /Hur posttranskriptionel Maskiner regulerer Cancer Stem Cell funktioner i Reaktion på Hypoxia

Abstrakt

Hypoxi har været lang tid anerkendt som store kræft-fremme mikromiljø. I en sådan en energi-restriktivt forhold, post-transkriptionelle mekanismer få betydning over energi-dyre gentranskription maskiner. Her viser vi, at den begyndende hypoxi-induceret kræft stamcellelinjer materiale kræver beta-catenin-afhængig post-transkriptionel opregulering af CA9 og SNAI2 genekspression. Som respons på hypoxi, beta-catenin bevæger sig fra plasmamembranen til cytoplasmaet, hvor det binder og stabiliserer SNAI2 og CA9 mRNA’er, i samarbejde med mRNA’et stabiliserende protein Hur. Vi leverer også dokumentation for, at den post-transkriptionel aktivitet af cytoplasmatisk beta-catenin opererer under normoxi i basale-lignende /triple-negativ brystkræft celler, hvor beta-catenin knockdown undertrykker stamcelle-fænotype

in vitro

tumorvækst

in vivo

. I sådanne celler, vi optrævle den generelle inddragelse af beta-catenin-drevne maskiner i stabiliseringen af ​​EGF-induceret mRNA, herunder kræft stamceller regulator IL6. Vores undersøgelse fremhæver den afgørende rolle, som post-transkriptionelle mekanismer i vedligeholdelse /køb af cancer stamceller funktioner og foreslår, at hindring af cytoplasmatisk beta-catenin funktion kan repræsentere en hidtil uset strategi for at målrette brystkræft stamceller /basal-lignende celler.

Henvisning: D’Uva G, Bertoni S, Lauriola M, De Carolis S, Pacilli A, D’Anello L, et al. (2013) Beta-Catenin /Hur posttranskriptionel Maskiner regulerer Cancer Stem Cell funktioner som respons på hypoxi. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10,1371 /journal.pone.0080742

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 16. juli 2013; Accepteret: 7 oktober 2013; Udgivet 15. november, 2013 |

Copyright: © 2013 D’Uva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af: italienske undervisningsministeriums, universiteter og videnskabelig forskning tilskud PRIN 2008KTRN38 “Klinisk, diagnostiske og terapeutiske konsekvenser af undersøgelser om brystkræft stamceller” til MT og MB; Cassa di Risparmio i Bologna Foundation “Ruolo della regolazione della Sintesi proteica nelle cellule staminali del cancro” (n. 135 /2010-0102) til LM og MB. RFO midler ex 60%, Cornelia og Roberto Pallotti Foundation (n. 2011 til 110.512) til MB. Forfatterne takker Fondazione Cassa di Risparmio i Bologna og Fondazione Banca del Monte e Ravenna for at støtte Center for Anvendt Biomedical Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

stamceller er næret i specialiserede nicher, hvor lavt ilt spænding (hypoxi) bidrager til reguleringen af ​​selv-fornyelse og differentiering [1-3]. Faktisk hypoxi fastholder den udifferentierede tilstand af embryonale, hæmatopoietiske, mesenkymale og neurale stamceller /progenitorceller [2]. Hypoxi i tumorer er forbundet med dårlig prognose [4]. Celler i hypoksiske tumor regioner stabilisere hypoxi-inducerbare-faktorer (HIFs) og aktivere adaptive genekspression fører til kræft aggressivitet gennem celle overlevelse og dedifferentiering [1,5]. Desuden HIF-aktivitet i en sjælden delmængde af hypoxiske tumorceller giver stamcelle-lignende egenskaber [1-3].

Beta-catenin er en afgørende regulator af normal og cancer stamceller selvfornyelse [6,7 ]. Som reaktion på forskellige stimuli, beta-catenin inducerer ekspressionen af ​​målgener ved shuttling ind i kernen, hvor den interagerer med TCF /LEF familie transkriptionsfaktorer [6].

Fysisk interaktion mellem HIF-1alpha, den største aktør i hypoxi respons, og beta-catenin er blevet beskrevet [8]. Desuden, beta-catenin og HIF-1alpha synergistisk lette hypoxi overlevelse i colon cancerceller og selv-fornyelse i neurale stamceller [8,9].

Hypoxi er en energi restriktivt forhold, der markant reducerer total

de novo

transskription og fremmer energibesparende post-transkriptionel regulering af allerede eksisterende mRNA [10-12]. Nylige undersøgelser rapporterer, at beta-catenin modulerer halveringstiden af ​​cytoplasmatiske mRNA [13-17]. Disse data fører til os formode, at den post-transkriptionel aktivitet af beta-catenin spiller en vigtig rolle i tilpasningen af ​​cancerceller for hypoxi. Her analyserede vi rollen af ​​beta-catenin i mRNA’erne produktion og stabilisering af to vigtige brystkræft stamcelle regulatoriske gener, dvs. carbonanhydrase 9 (CA9) og SNAI2. Ekspressionen af ​​CA9 og SNAI2 gener induceres af hypoxi, via HIF1-a-medieret transkriptionel opregulering [18-20]. CA9 ekspression regulerer pH i hypoxiske mikromiljø til at fremme overlevelse og proliferation af cancer stamceller [21,22]. Derfor CA9 er blevet foreslået som en anticancerterapi target [23,24]. SNAI2, også kendt som SLUG, er en vigtig funktionel suppressor af humane bryst- progenitorcelle linjeforpligtelse og differentiering, fremme normale og tumor brystkirtel stamceller /progenitorceller tilstand [25,26].

Vi her anføre, at det cytoplasmatiske akkumulering af beta-catenin som respons på hypoxi aktiverer en post-transkriptionel de-differentiering og overlevelse program, som forbedrer stamceller funktioner i brystcancerceller. Fænomenet er afhængig af evnen af ​​cytoplasmiske beta-catenin til at binde og stabilisere SNAI2 og CA9 mRNA’er. Vi leverer også dokumentation for, at den post-transkriptionel aktivitet af cytoplasmatisk beta-catenin opererer under normoxi i basale-lignende /triple-negative brystkræftceller. Den basale-lignende /triple-negativ brystkræft er et dårligt differentieret og aggressiv brystkræft subtype, kendetegnet ved ekspressionen af ​​en stamcelle-lignende gen profil [27,28], ved den cytoplasmatiske lokalisering af beta-catenin [29-31 ] og ved CA9 og SNAI2 gen overekspression [32,33]. I sådanne celler, beta-catenin knockdown dramatisk formindsket stabilitet og udtryk CA9 og SNAI2 mRNA og blunts stamcelle-fænotype

in vitro

og xenograft-oprettelse kapacitet

in vivo

. Desuden beta-catenin beta-catenin var i stand til at regulere mRNA-stabilitet af flere EGF-inducerede mRNA’er, blandt hvilke den pro-inflammatoriske cytokin interleukin 6 (IL6), en anerkendt cancervækst stamceller faktor [21,34]. De data, her indberettede fremhæve den rolle af post-transkriptionelle mekanismer i reguleringen af ​​kræft stamceller funktioner, og identificere beta-catenin som en central post-transkriptionel spiller i brystkræft stamcelle fænotype. Vi foreslår, at hindring af beta-catenin post-transkriptionel aktivitet her beskrevne repræsenterer en endnu ikke udforsket strategi til at målrette brystkræft spindel /basale-lignende celler. Salg

Materialer og metoder Salg

Cellelinier, kemikalier og hypoxi eksponering

Vi bruges MCF7-celler som en model af veldifferentieret luminale brystcarcinom og MDA-MB-468 og MDA-MB-231-celler som en model af dårligt differentieret basal-lignende brystcarcinoma [35 ]. Alle cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 blev dyrket i RPMI-1640, DMEM /F12 og DMEM hhv. Alle medier blev suppleret med 10% FBS, 1% penicillin og streptomycin og 1% glutamin Euroclone (Milano-Italien). Alle normoksiske cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2-befugtet atmosfære. Hypoxi (1% pO

2, 5% pCO

2, 94% pN

2) blev opnået i en

invivo

300 hypoxi kabinet (Ruskinn Technology, Bridgend, UK) i 48 h. Celledød blev bedømt ved trypanblå-farvning.

Generering af MS fra primær brystcancer væv og cellelinier

MS fra humane mammae kirtel væv blev opnået som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt blev vævsprøverne placeret i sterilt Epicult medier (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), hakket med sterile skalpeller og inkuberet i 6-12 timer i nærværelse af 1.000 U collagenase /hyaluronidase enzymblanding (StemCell Technologies) og filtreret gennem en 40 um nylonnet (Becton Dickinson), resuspenderes i komplet MEGM og forgyldt i 1 cm

2 lave vedhæftede plader. Sekundær MS generation blev opnået ved inkubering primær eller konsekutive MS i 1 × Trypsin-EDTA-opløsning (Cambrex) i 3 minutter, filtrering gennem en 40-um nylon mesh og enkelt celle resuspension i komplet MEGM. MS blev scoret på dag 7. Clearance blev opnået fra S.Orsola-Malpighi Hospital komité, Bologna-universitetet (Prot. N. 75/2011 til LM og MB og MT). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter, hvis væv blev anvendt i undersøgelsen. MCF7-MS blev genereret ved podning 5000 MCF7-celler i lav vedhæftning 24 godt og scorede på dag 5.

Stabil Beta-catenin og SNAI2 knockdown i MCF7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler

Stabil beta-catenin knockdown i MCF7, MDA-MB-468 og MDA-MB-231-celler blev opnået ved at transducere den pCtoGMB-GFP retroviral vektor, der bærer human beta-catenin specifik 19nt kodende sekvens (GAGCCTCTATACCACCCAC) ved en PCR -baseret kloningsstrategi, som tidligere beskrevet for shSNAI2 vektoren [20]. shBeta og shSNAI2-inficerede celler blev selekteret ved GFP cytofluorimetrisk sortering, som tidligere beskrevet [20].

Immunofluorescens og Konfokal mikroskopi analyse

Dyrkede celler blev podet på dækglas på 60% sammenløb, mens MS blev dyrket i BD reduceret Matrigel

TM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Celler blev fikseret med 2% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100. Celler blev inkuberet med anti-beta-catenin primært antistof (klon E5, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) og sekundært anti-muse FITC konjugeret antistof (Dako Cytomation, Glostrup, DK). Kerner blev modfarvet med propidiumiodid og monteret i anti-fade Pro-lange reagens monteringsmedium (Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, USA). Billeder blev taget med et Zeiss LSM 710 på en Zeiss Observer Z1 eller et Leica DMI 6000B inverteret mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland).

Transient transfektion af siRNA og ekspressionsvektorer

CA9-, HuR-, og SNAI2-specifikke siRNAs og ikke-specifik siRNA kontrol (siSCR) oligonukleotider (Stealth

TM teknologi) med en matchet indhold GC blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmider kodende vildtype beta-catenin (Beta-WT, pCI-neo), dominant negativ pcDNA4-TCF4DN (TCF4DN), og PTER + shBeta-catenin (shBeta) kodning vektor blev opnået fra Dr. Marc Van De Wetering (Hubrecht Institute, Utrecht, Holland) og Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, MD, USA). Plasmid, som koder HIF1-alpha blev opnået fra Eric Huang (Department of Neurokirurgisk, University of Utah, Salt Lake City, Utah). Vildtype EGFR kodning vektor blev opnået fra Pier Paolo di Fiore (Det Europæiske Institut for Onkologi, Milano, Italien); siRNA’er eller plasmider blev transficeret til MCF7-celler (10

5 celler i en 3 cm

2 brønd) ved en koncentration på 1 ug /brønd i 72 timer eller 24 timer henholdsvis ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Gran Island, NY ), eller Jet-Pei (POLYPLUS, Illkirch, Frankrig) i tilfælde af MS. MCF7-celler stabilt transduceret med en retroviral vektor, der koder en p53 dominerende inaktiverende mini-protein (p53D) er tidligere beskrevet [36].

genpromotor og mRNA 3’UTR luciferase reporter assays

Karboanhydrase -9 luciferase plasmid (CA9-Luc, spanning -170 til +34 regionen CA9 promotor), blev stillet til rådighed af Dott. Jaromir Pastorek; HIF1alpha reagerer luciferase plasmid, HRE-Luc, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Giovanni Melillo (Tumor hypoxi laboratorium, National Cancer Institute, Frederick, MD, USA). SNAI2-Luc plasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. Togo Ikuta (Saitama Cancer Center, Saitama, Japan); TopFlash, var en gave fra Dr. Rolf Kemler (Max Planck Instituttet, Heidelberg, Tyskland); Østrogen Reaktion Element (ERE-Luc) reporter blev leveret af Rakesh Kumar (Institut for Molekylær og Cellulær Oncology, MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas); Thymidinkinase Renilla luciferase reporter plasmid (Promega, Madison, WI) blev anvendt som kontrol i luciferaseanalyse efter 24 timer ved anvendelse af Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens anvisninger. Data er udtrykt som fold ændringer af ildflue end Renilla luciferaseaktivitet. CA9 og SNAI2 3’UTR luciferaseanalyse konstruktioner blev opnået fra Genecopoeia (Rockwell, Maryland, USA). Hver cellelinje blev transficeret med 3’UTR-CA9 /SNAI2 vektor eller med kontrol pEZX-MT01 tom vektor. Data er præsenteret som forholdet mellem 3’UTR-CA9 /SNAI2 løbet styrevektor, ifølge producentens instruktioner.

RNA-ekstraktion og cDNA-amplifikation

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse TRIzol® Reagent ifølge til fabrikantens protokol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Primere og PCR betingelser er angivet i tabel S1.

Real-Time PCR-analyse

Real-Time PCR analyse blev udført af TaqMan tilgang i aiCycler iQ ™ Real-Time PCR DetectionSystem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Sæt primere og fluorogene prober specifikke for CA9, SNAI2, ESR1, IL6 og CD44 mRNA’er blev købt fra Applied Biosystems. Reaktionerne blev inkuberet ved 50 ° i 2 min; 95 ° C i 15 minutter efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative mængde af mål-mRNA’et blev beregnet lig med 2

– (Δ

C

t target mRNA- Δ

C

t kontrol) under anvendelse af human beta-glucuronidase-mRNA som kontrol, bortset fra mRNA immunopræcipitationsassay, mRNA stabilitet assay, og cytoplasmatisk fraktionering assay.

High Throughput Gene Expression Måling med Real Time PCR i en Mikrofluid Dynamic Array (Fluidigm® Real-Time PCR)

RNA blev isoleret ved hjælp af PerfectPure RNA dyrkede celle Kit med DNAse-1 fordøjelse (5 Prime, Hamburg, Tyskland). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af SuperScriptII første-streng syntese kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). For qPCR af præ-mRNA og mRNA henholdsvis fremadrettede primere blev placeret i den anden intron og exon, og en fælles revers primer (her kaldet universel) blev anbragt i den tredje konstitutive exon. For gener, hvori de universelle primere sekvenser ikke var tilgængelige, blev 2 par af primere designet for at amplificere henholdsvis introniske og exon sekvenser. Hver cDNA prøve blev blandet med puljen af ​​primere for en pre-amplifikationsreaktion på 14 cyklusser med reagens (Fluidigm PN 85.000.735) og TaqMan PREAMP Master Mix, ifølge producentens instruktioner. Den forforstærkede cDNA blev fortyndet 1: 100. Den modificerede 2x TaqMan universal Master Mix blev tilsat til den fortyndede cDNA for at opnå en slutkoncentration på Master Mix 1x i prøverne. Chippen blev primet i NanoFlexTM 4-IFC Controller forud for indlæsning af prøver og assay reagenser ind i fjorde. Data blev analyseret ved anvendelse af Ct-værdier og ΔΔCt værdier. Hver prøve blev i tre eksemplarer og normaliseret enten på GAPDH, B2M og TBP. Primersekvenser er opført i tabel S2.

Western Blot og co-immunopræcipitering assay

Total proteiner blev ekstraheret med RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 145 mM NaCl, 1% NP -40, SDS 0,1%, Na-Deoxycolate 0,5%) tilsat Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel, Schweiz). Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af følgende antistoffer: laminin, Beta-tubulin, anti-beta-catenin (E5), anti-Actin (C4) indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA); anti-Hur (Molecular Probes, Invitrogen) indkøbt fra Molecular Probes; anti-CA9 (AF2188) købt fra R . Cat # 560.890) og CD24 (PE-Cy7;. Cat # 561.646) eller deres respektive isotypekontroller blev tilsat til cellesuspensionen i koncentrationer anbefalet af fabrikanten og inkuberet ved 4 ° C i mørke i 30 min. De mærkede celler blev vasket i vaskebuffer og derefter analyseret på en LSR II flowcytometer (BD Biosciences).

Foci-dannende assay

For at teste evnen af ​​udvalgte cellelinjer at danne foci blev celler udpladet i seks-brønds-plader, holdt ved con indflydelse, erstatte mediet hver 3-4 dage. Foci blev scoret på dag 14

th.

xenograft assay og væv immunhistokemisk

2 * 10

6 MDA-M6B-468 celler blev injiceret i yverfedt-pad af kvindelige nøgne mus. Tumorvækst blev overvåget ugentligt og fjernes derefter efter 10 uger (Weizmann Institute Animal Care og brug Udvalg godkendt dyret eksperiment, IACUC n. 01.990.412-2). 1 * 10

6 MDA-MB-231 celler blev injiceret subkutant i flanken af ​​nøgne mus. Tumorvækst blev overvåget ugentligt og fjernes derefter efter 4 uger. (Animal Etisk Komité universitetet i Bologna godkendt dyreforsøg, prot. N. 8134-X /10). Formalinfikserede /paraffin indlejret væv blev farvet med Hematoxylin-Eosin, og vurderet af immunonistochemistry, med følgende antistoffer: anti-ESR1 (klon ID5, DakoCytomation, Glostrub, Danmark); anti-CDH1 (klon NCH38, Dako Cytomation), anti-SNAI2 (L40C6, Cell Signalering, Beverly, MA), anti-CA9 (klon M-75, venligst stillet til rådighed af J. Pastorek, slovakisk videnskabsakademi, Bratislava).

Statistik og bioinformatik

Bioinformatik analyse på AU-Rich element-holdige mRNA blev udført høring af online database AREsite [38] (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi -bin /AREsite.cgi). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS software. Data er præsenteret som gennemsnit +/- standardafvigelse .; p-værdier, der henviser til

t

testen rapporteres, medmindre andet er angivet (n = 3).

Resultater

Hypoxi fremkalder brystkræft celle dedifferentiation og overlevelse /spredning ved at udløse CA9 og SNAI2 udtryk

In vitro

, brystkræft stængel /progenitor funktioner er overrepræsenteret i mammospheres (MS) [39]. Vores undersøgelse blev foranlediget af den iagttagelse, at eksponering eller præ-eksponering for hypoxi (1% pO

2) øget MS dannende evne MCF7-celler (figur 1A), og af duktalt brystcarcinom væv-afledte celler (T-MS , Figur 1B). Vi observerede derefter at i MCF7-celler, såvel som i T-MS, hypoksi forøgede mRNA-ekspression af to afgørende brystkræft stamcelle regulatoriske gener, nemlig carbonanhydrase 9 (CA9) og SNAI2 (figur 1C), via

de novo

mRNA produktion (fig S1A). Vigtigere, SNAI2 shRNA knockdown reduceret normoxiske MS dannende evne, samt sløvet hypoxi MS ekspansion (figur 1D). Konsekvent, siRNA-medieret SNAI2 knockdown pillet hypoxisk T-MS-dannelse (Figur S1B). Desuden shRNA-medieret SNAI2 knockdown bremsede hypoxi-induceret nedregulering af de epiteliale differentieringsmarkører østrogenreceptor alfa (ESR1), keratin 18 (KRT18) og e-cadherin (CDH1) (figur 1 E og fig S1c) og hypoxia- induceret opregulering af CD44-ekspression (figur 1F), en markør for brystcancer stamceller /progenitorceller [21,40]. Endelig i overensstemmelse med den pro-overlevelse /proliferative rolle CA9 [21,22], siRNA-medieret CA9 silencing forøget celledød og hindret MS-dannelse i hypoxiske MCF7-celler (figur 1G). Disse data viser, at hypoxi inducerer en SNAI2-afhængig de-differentiering program og en CA9-afhængig overlevelse /proliferation program, hvilket fører til en stigning i stamceller /progenitorceller sub-population (Figur 1 H).

A, Mammosphere (MS) dannelse assay i MCF7-celler som respons på hypoxi eksponering (1% pO

2) eller efter forudgående eksponering af adhærente celler til 1% pO

2 (pre-1% pO

2) ; MS danner evne MCF7-celler i normoxi (Nor) rapporteres som basal værdi; B, Tumor MS dannelse assay (T-MS) i Nor /1% pO

2 duktale breast carcinoma væv-afledte celler, n = 5; repræsentative billeder inkluderet; C, CA9 og SNAI2 mRNA i Nor /1% Po

2 MCF7-celler og T-MS; D, MS dannelse assay af Ctrl /SNAI2-specifikke shRNA retroviral vektor (shSNAI2) transficerede MCF7 celler udsat for Nor /1% pO

2; E, Real-Time PCR-analyse af ESR1 og KRT18 mRNA-niveauer i Ctrl /shSNAI2 MCF7 celler udsat for Nor /1% pO

2; F, Real-Time PCR-analyse af CD44 mRNA-niveauer i Ctrl /shSNAI2 MCF7 celler udsat for Nor /1% pO

2; G, celledød og MS assay i scramble (Ctrl) og CA9 siRNA (siCA9) transficeret MCF7 celler udsat for Nor /1% pO

2; H, Skematisk fremstilling af den rolle, CA9 og SNAI2 i reguleringen af ​​kræft stamceller funktioner som reaktion på den hypoxiske mikromiljø. Data er præsenteret som gennemsnit +/- standardafvigelse .; p-værdier henviser til t-test. n = 3, medmindre andet er angivet.

Beta-catenin øger brystkræft stamcelle fænotype som reaktion på hypoxi uafhængigt af dets nukleare transkriptionsaktivitet

Vi undersøgte derefter rolle beta catenin i reguleringen af ​​CA9 og SNAI2-afhængig brystkræft stamcelle-fænotype. MCF7-celler, der bærer beta-catenin specifikke shRNA retroviral vektor (shBeta) udviste en dramatisk reduktion af SNAI2 og CA9 proteinekspression (figur 2A), kombineret med reduceret normoxiske MS dannelse og forringet hypoxiske MS ekspansion (figur 2B). Brystkræft stamceller /stamceller er også overrepræsenteret i CD44

høj /CD24

lav delpopulation [40]. I overensstemmelse med data på MS, MCF7-shBeta celler Regnskabsoplysninger indskrænket andel af CD44

høj /CD24

lave celler i normoxi, og stumpe CD44

høj /CD24

tyndt befolkede ekspansion under hypoxi (Figur 2C ). I langsigtede hypoxi-eksponerede MCF7-shBeta celler, vi også observeret nedsat evne til at danne foci (Figur S2A). Desuden shRNA medieret beta-catenin knockdown bemærkelsesværdigt reduceret blød agar-kolonidannelse kapacitet (fig S3A), denne sidstnævnte er en stringent

in vitro

assay til påvisning af celle malign transformation. Disse data førte os til at ræsonnere, at beta-catenin knockdown hæmmer stængel /stamcelle selvfornyelse. Interessant, beta-catenin knockdown hindres også hypoxi-induceret nedregulering af ESR1 (figur 2D), afslører evnen til beta-catenin at spille en afgørende rolle i hypoxi-induceret de-differentiering program, der paralleller gevinsten af ​​stamceller funktioner i brystcancerceller. Vi derefter observeret, at hypoksi fremkaldte betydelig delokalisering af beta-catenin fra cellemembranen til cytoplasmaet, dette faktum bliver parallelt med en reduktion i celle-til-celle kontakter (Figur 2E). Interessant, hypoksi udløste hverken beta-catenin kernelokalisering eller beta-catenin /TCF transkriptionsaktivitet i MCF7-celler og i T-MS (fig 2F, G). Disse data førte os til at forestille sig, at beta-catenin letter CA9 og SNAI2 udtryk og den efterfølgende stamcelle fænotype i hypoxi-eksponerede brystkræftceller, uafhængigt af dets nukleare transkriptionsaktivitet.

A, Western analyse (WB) af beta-catenin, SNAI2 og CA9 protein niveauer i Ctrl /shBeta MCF7 celler efter Nor /1% Po

2 betingelser; B, MS danner assay i stabil beta-catenin tavshed (shBeta) MCF7-celler på Nor /1% pO

2 betingelser; C, cytofluorimetrisk analyse af CD44

høje /CD24

lav stilk /stamfader befolkning ctrl /shBeta MCF7-celler på Nor /1% Po

2 betingelser; D, Real-Time PCR-analyse af ESR1 mRNA-niveau i Ctrl /shBeta MCF7-celler på Nor /1% Po

2 betingelser; E, Immunofluorescens (IF) analyse af beta-catenin i Nor /1% pO

2 MCF7-celler; F, WB analyse af beta-catenin in Nor /1% pO

2 MCF7-celler cytoplasmatiske og nukleare fraktioner (lamin B og beta-tubulin blev anvendt som fraktioneringstrin kontroller); G, beta-catenin /TCF transkriptionelle reporter (TOPFLASH) assay i MCF7-celler og T-MS under Nor /1% pO

2. Data er præsenteret som gennemsnit +/- standardafvigelse .; p-værdier henviser til t-test. n = 3, medmindre andet er angivet.

Hypoxi inducerer CA9 og SNAI2 udtryk via HIF1-alpha afhængig mRNA transskription og beta-catenin afhængig mRNA stabilisering

CA9 og SNAI2 er hypoxi-inducerbare -faktor-1-alfa (HIF-1alpha) transkriptionelle mål [8,20]. For nylig er det blevet foreslået, at beta-catenin fremmer CA9 ekspression, ved at virke som HIF-1alpha transcriptional co-faktor i colon cancerceller [8]. Foranlediget af disse data, forsøgte vi at undersøge effekten af ​​beta-catenin på HIF-1alpha-afhængig transskription, samt på CA9 og SNAI2 promotoraktivitet. Overraskende luciferasen drevne responsiv reporter assay viste, at beta-catenin overekspression hæmmer HIF1-alpha transkriptionel aktivitet ved hypoxi eksponering eller efter HIF1-a transient overekspression (figur 3A). Konsekvent, beta-catenin knockdown udløst HIF1-alpha transkriptionel aktivitet (figur 3B). Tilsvarende beta-catenin undertrykte hypoxi-induceret CA9 og SNAI2 gener promotoraktivitet (figur 3C). Disse resultater peger på indtræden af ​​antagonistisk aktivitet mellem beta-catenin og HIF1-a-medieret transkription i hypoksi-eksponerede brystcancerceller. I overensstemmelse med disse resultater, transfektion af den dominerende negative isoform af TCF4 (TCF4-DN), som standser beta-catenin transkriptionel aktivitet [6], var ikke i stand til at mindske CA9 og SNAI2 mRNA-ekspression i hypoxi-eksponerede MCF7-celler (figur S3B). Dokumentation for, at beta-catenin paradoksalt reducerer CA9 og SNAI2 promotoraktivitet, men øger ekspressionsniveauerne af sammenhørende mRNA, fik os til at undersøge mRNA-stabilitet som et nyt lag af beta-catenin-afhængig funktion. For at bevise denne hypotese, vi brugte actinomycin D, en inhibitor af Polymerase 2 (Pol2), som forringer

de novo

mRNA transkription. I tråd med vores hypotese, stabil beta-catenin lyddæmpning forkortet CA9 og SNAI2 mRNA halveringstid i hypoxi udsat MCF7-celler (figur 3D). Disse data antyder, at hypoxi-induceret de-differentiering celle program i brystcancerceller afhængig af HIF1alpha-afhængige produktion af CA9 og SNAI2 mRNA, efterfulgt af beta-catenin afhængig stabilisering af disse mRNA’er (Figur 3E) /stamceller.

A, HIF-1alpha transkriptionel reporter (HRE-Luc) assay i MCF7-celler transficeret med vildtype-beta-catenin (Beta-wt) under Nor /1% PO

2 betingelser eller i kombination med HIF1 -alfa (HIF1A) kodning vektor; B, HRE-Luc-analysen i 1% pO

2-eksponerede ctrl /shBeta MCF7-celler; C, CA9-Luc og SNAI2-Luc-analysen i ctrl /Beta-wt transficeret og i ctrl /shBeta MCF7 celler under Nor /1% Po

2 betingelser; D, CA9 og SNAI2 mRNA-stabilitet assay for hæmmere af Polymerase 2 transkriptionsaktivitet ved actinomycin D (100 ng /ml) i ctrl /shBeta MCF7-celler eksponeret for 1% pO

2; E, Skematisk afbildning af HIF1-alpha /beta-catenin samspil i brystcancerceller som reaktion på hypoxia: HIF1-alpha fremmer transkription og cytoplasmatisk beta-catenin forøger stabilisering af SNAI2 og CA9 mRNA’er; den negative effekt af beta-catenin på HIF-1alpha-induceret transskription også afbildet. Data er præsenteret som gennemsnit +/- standardafvigelse .; p-værdier henviser til t-test. n = 3, medmindre andet er angivet.

grundlæggende aktiv beta-catenin post-transkriptionel aktivitet i basal-lignende /triple-negative brystkræftceller

Når vi sammenlignet MCF7 afledte MS til beslægtede adhærente celler til CA9 og SNAI2 udtryk, fandt vi højere CA9 og SNAI2 promotor-aktivitet og mRNA udtryk, der blev stoppet i shBeta normoxiske MS (figur 4A-B). Omend fænomen blev modsvaret af stigningen i beta-catenin cytoplasmatisk lokalisering (figur 4C), tilsvarende niveauer af total beta-catenin protein og transkriptionel aktivitet var til stede i adhærerende og MCF7 afledt MS (figur 4D). Disse data peger på, at den post-transkriptionel aktivitet af beta-catenin kan være involveret i opretholdelsen af ​​stilken /progenitorcelle status, selv i normoxi.