PLoS ONE: En RNA Interference letalitet Screen of Human Druggable genom at identificere Molekylær Sårbarheder i Epithelial æggestokkene Cancer

Abstrakt

målrettede behandlinger er blevet brugt til at bekæmpe mange tumortyper; Men få har faktisk forbedret samlet overlevelse hos kvinder med epitelial kræft i æggestokkene, tigger om en bedre forståelse af denne dødelige sygdom og identifikation af væsentlige drivkræfter for tumorigenese, der kan målrettes effektivt. Derfor brugte vi et tab af funktion screening tilgang til at hjælpe med at identificere molekylære sårbarheder, der kan udgøre centrale punkter for terapeutisk intervention. Vi ansat en fordomsfri high-throughput dødelighed skærm ved hjælp af en 24.088 siRNA bibliotek målrettet over 6.000 druggable gener og studerede deres virkninger på vækst og /eller overlevelse af epitelial kræft i æggestokkene (EOC) cellelinjer. De øverste 300 “hits” påvirker levedygtigheden af ​​A1847 celler blev screenet igen på tværs yderligere EOC cellelinjer og ikke-tumorigen, human immortaliseret ovarieepitelceller cellelinjer. Halvtreds-tre gen kandidater blev fundet at udvise virkninger i alle tumorigene testede cellelinjer. Omfattende validering af disse hits raffineret listen til fire af høj kvalitet kandidater (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

). Mekanistiske undersøgelser viser, at lukke munden på tre gener fører til øget apoptose, mens

HSPA5

lyddæmpning synes at ændre celle vækst gennem G1 cellecyklusstop. Desuden to uafhængige genekspression undersøgelser viser, at

NDC80

,

NUF2

og

PTN

blev væsentligt afvigende overudtrykt i serøse adenokarcinomer. Samlet set vores funktionelle genomics resultater integreret med genomics data giver en vigtig fordomsfri avenue mod identificering af potentielle terapeutiske mål for lægemiddelforskning, der er et presserende og udækket behandlingsbehov for kræft i æggestokkene

Henvisning:. Sethi G, Pathak HB, Zhang H, Zhou Y, Einarson MB, Vathipadiekal V, et al. (2012) En RNA-interferens letalitet Screen of Human Druggable genom at identificere Molekylær Sårbarheder i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 7 (10): e47086. doi: 10,1371 /journal.pone.0047086

Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center på San Antonio, USA

Modtaget: 13 juni, 2012; Accepteret: September 7, 2012; Udgivet: 9. oktober, 2012 |

Copyright: © Sethi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev delvist understøttet af et program projekt tilskud fra æggestokkene Cancer Research Fund (https://www.ocrf.org) og en bevilling fra NCI (CA140323) til AKG. Forfatterne anerkender støtte fra University of Kansas Cancer Center og Kansas Bioscience Authority Eminent Scholar Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er den anden mest almindelige gynækologisk kræft, og en af ​​de mest dødelige, blandt kvinder, med en anslået 22,280 nye tilfælde og 15.500 dødsfald i 2012. [1] blandt de forskellige typer af epitelial kræft i æggestokkene, som omfatter serøs, mucinous, klar celle og endometrie [2], [3], at størstedelen af ​​dødsfald som følge af kræft i æggestokkene forekomme hos patienter med fremskreden fase, high-grade serøs kræft i æggestokkene. [4] Som sådan er der et presserende behov for nye terapeutiske metoder til at bekæmpe denne dødelige sygdom.

Udvikling af nye behandlingsformer, især i en tid med målrettede behandlinger og personlig medicin, typisk drevet ved at forstå den underliggende biologi, molekylærbiologi og biokemi af tumorceller og deres omgivende mikromiljøer rettet mod genetiske ændringer. [5] Dette er et fælles tema i lægemiddelforskning og kan give specificitet, men kan generelt ikke give alsidighed i målretning. Kræftceller kan udvikle sig som mangler de målrettede genetiske ændringer eller som er resistente og kan forårsage progressiv sygdom. [5] Det er derfor vigtigt at udvide vores bevæbning af behandlinger, men endnu vigtigere vores opfattelse af vigtige lægemiddelmål. Den evolutionære karakter af kræft indebærer, i modsætning til konventionelle visdom, at de væsentlige træk ved enhver terapi til konsekvent helbredelse eller kontrol for kræft skal være uafhængig af de særlige veje for tumorceller evolution, og uafhængig af nogen særlige genetiske eller epigenetiske ændringer. Selvom den genetiske og epigenetiske kompleksitet kræft er næsten ubegrænset, er tumorceller evolution begrænset. [6], [7] En ondartet celle vil resultere, hvis og kun hvis, ændringerne forårsager normale cellulære maskineri til at udføre de processer af spredning og invasiv.

Aktuelle lægemiddelforskning indsats tendens til at fokusere på almindeligt muteret signaltransduktionsveje, fx, en serie af vækstfaktorreceptorer og downstream modulatorer (phosphataser og kinaser), der arbejder i fællesskab for at fremme vækst, men som ikke er det centrale maskiner. Derfor udførte vi ikke-forspændt high-throughput letalitet skærme (HTS) af små interfererende RNA’er (siRNA’er) at identificere gener, der er væsentlige for ovariecancer tumorcellevækst og overlevelse. De øverste hits blev udførligt valideret og deres kliniske værdi vurderes. Samlet set fandt vi

NDC80

,

NUF2

og

PTN

som vigtige molekylære sårbarheder, som repræsenterer potentielt vigtige terapeutiske mål i kræft i æggestokkene.

Resultater

HTS af Druggable Genome

den primære high-throughput RNAi screening blev udført (som vist i figur S1A) anvendelse af den humane Druggable Genome Library (Dharmacon) (tabel S1) bestående af 24.088 siRNAs målretning 6.022 gener ved hjælp af A1847 celler, en epitelial ovariecancer (EOC) cellelinje, som konsekvent afkaster reproducerbare transfektion data under HTS forhold. Positive og negative kontrol interne referencedata brønde blev inkluderet på hver plade for at muliggøre beregning af transfektion effektivitet (se Supplerende information S1 for yderligere detaljer). A1847 celler blev transficeret under anvendelse HTS betingelser som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. De normaliserede levedygtighed scoringer (defineret som den (fluorescensintensitet

prøve) /(median fluorescensintensitet

reference-)) opnået gennem HTS vises en Gauss fordeling (figur S1B). Efter statistisk dataanalyse (se supplerende information S1), blev udvalgt i alt 300 gener, der repræsenterer ~ 5% af generne er omfattet af dette bibliotek til optagelse i den næste runde af screening.

HTS af et panel af EOC cellelinier Brug en delmængde af de Druggable Genome

Dernæst bestemmes vi, hvilke af de 300 gener identificeret som hits fra den primære skærm påvirkes gensidigt cellens vækst og overlevelse på tværs af flere EOC cellelinjer ved hjælp af en uafhængig siRNA bibliotek (tabel S2). Denne nye fokuserede bibliotek blev konstrueret ved hjælp af en helt ny pulje af fire siRNA-sekvenser rettet mod hvert gen for at minimere potentielle falsk-positive fra den primære skærm på grund af off-target effekter. Strategien for at bruge et andet sæt af siRNA puljer til de sekundære skærme er blevet vedtaget som en revalidering skridt i sig selv. [8] Transfektionsresultater betingelser for yderligere syv æggestokkene tumorigene cellelinier (A2780, CP70, C30, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 og UPN275) blev derefter optimeret til HTS (Tabel S3). Disse syv nye EOC cellelinjer og A1847-cellelinien blev derefter underkastet HTS, via delmængden bibliotek rettet mod de 300 gener. En levedygtighed score blev udledt for alle 300 siRNA puljer i hver cellelinje (vist grafisk i figur 1A), der varierede fra 0.09-1.20 tværs cellelinierne. “Hits” for hver af de otte cellelinjer blev udvalgt på grundlag af både statistisk signifikans (falsk opdagelse sats (FDR) 0,05) og biologisk betydning (levedygtighed score 0,85) (se Supplerende oplysninger S1 for yderligere detaljer). En varme kort af hits på tværs hver EOC cellelinje dannet ved anvendelse MultiExperiment Viewer [9], [10] og skæringspunktet mellem de hits blandt cellelinjer er vist skematisk i figur 2A. I alt 53 hits blev betragtet som signifikante på tværs af alle otte EOC cellelinier (figur 2A og tabel S4). Den gennemsnitlige korrelationskoefficient (r) for de tekniske gentagelser på tværs af alle de cellelinjer var 0,91 ± 0,03 (figur S2A).

skærme på et panel af EOC og Hio cellelinjer. A. Otte EOC cellelinjer blev omvendt transficeret med siRNA’er rettet mod 300 gener identificeret fra den primære screening af A1847 cellelinje ved hjælp transfektion parametre er optimeret til hver cellelinje (se tabel S3). Hver cirkel repræsenterer en gennemsnitlig levedygtighed score fra tekniske replikater efter dæmpning af et bestemt gen. Den grå stiplede linie repræsenterer afbrød værdi for levedygtigheden score (0,85) til at vælge hits. B. Tre Hio cellelinjer blev transficeret ved hjælp af parametre er optimeret til hver (se tabel S3).

A. Et zonekort repræsentation af levedygtighed scorer for otte EOC og tre HIO cellelinier opnået fra sekundære skærme af siRNA biblioteket målrette 300 gener. Alle levedygtighed score værdier ligger mellem 0,12 og 1,53. Nuancer af grøn repræsenterer reduceret levedygtighed ( 0,80), repræsenterer nuancer af rødt øget levedygtighed ( 0,80), og sort er en levedygtighed score på 0,80. Varmen kort blev genereret ved hjælp MultiExperiment Viewer. Floral diagrammer i gult og blåt viser antallet af hits på tværs enten otte EOC eller tre Hio cellelinier henholdsvis og skæringspunktet af hits inden for hver gruppe. B. En Venn-diagram viser antallet af hits i fælles mellem HIOS og EOCs og antallet hits unik for hver gruppe.

PANTHER biologiske klassifikationssystem [11] viste, at “metaboliske processer” blev den største kategori (~43%), hvortil disse 53 gener tilhørte (fig S3A). Specifikt når funktionel karakterisering af disse gener blev udført under anvendelse Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software, blev det vist, at de 53 hits blev beriget for gener relateret til proteinsyntese involverer ribosomale proteiner og forlængelsesfaktorer (Figur S3B). De seneste rapporter har fremlagt bevis for, at der ud over involvering i proteinsyntese, ribosomale proteiner og forlængelsesfaktorer har en rolle i celle cyklus regulering og overlevelse. [12], [13], [14], [15] lægemidler rettet mod forskellige molekylære komponenter involveret i proteinsyntese maskiner er allerede i kliniske forsøg for forskellige tumor typer, herunder bryst-, tyktarms- og tarmkræft [16], [17], [18], støtter den translationelle potentiale i vores hits. Netværk karakterisering ved hjælp af IPA-software viste, at generne i netværket med den højeste score udstillede deres downstream helbred ved, ERK1 /2 og AKT, centrale overlevelse gener, der har været impliceret som formidlere af større onkogene veje i kræft i æggestokkene (figur S3C) [19 ], [20], [21], [22].

HTS af ikke-tumorigene Hio Lines

Næste, vi afgøres, hvilken af ​​de hits havde den største effekt på EOC cellelinjer og kun lidt eller ingen effekt på den ikke-tumorigen menneske udødeliggjort æggestokkene overflade epitel (HIO) cellelinjer. Vi har derfor screenet de 53 hits for virkninger på levedygtighed tre Hio cellelinier (HIO80, HIO120 og HIO117). Selvom vi var interesserede i screening kun 53 hits, for at opretholde den samme screening format og minimere eventuelle tekniske forskelle i, hvordan siRNA skærmene blev udført for Hio cellelinjer, vi brugt igen den brugerdefinerede siRNA biblioteket målretning alle 300 gener. En levedygtighed point er afledt følgende lyddæmpning af hvert gen (figur 1B). Den gennemsnitlige korrelationskoefficient mellem tekniske gentagelser for de tre Hio cellelinier (figur S2B, gennemsnitlige r = 0,90 ± 0,03) var den samme som de EOC-cellelinjer.

Hits for Hio cellelinier blev udvalgt som beskrevet ovenfor (normaliseret levedygtighed score 0,85 og FDR 5%). I alt 74 hits blev identificeret fælles for alle tre Hio cellelinier (figur 2A). En Venn-diagram viser skæringen af ​​hits mellem EOC og Hio cellelinjer i figur 2B. Syvogfyrre hits var fælles mellem de to grupper. Der var imidlertid seks hits unikke for EOC cellelinier (gener, der er ramt levedygtighed alle otte af de EOC cellelinier, men ikke alle tre Hio cellelinier) som vi udvalgt til yderligere validering. Vi valgte også en ekstra gen,

NUF2

, for yderligere valideringsundersøgelser.

NUF2

, selvom ikke en unik hit til EOC cellelinier, viste den laveste Levedygtighed Index score, defineret som forholdet mellem den gennemsnitlige normaliserede levedygtighed EOC cellelinier til den gennemsnitlige normaliserede levedygtighed Hio cellelinier (tabel S4). Disse syv gener (

BCAR3

,

HSPA5

,

NAMPT

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

, og

RPS19

) blev yderligere analyseret for potentiel off-target effekter.

Dekonvolution af siRNA Pools

for at udelukke off-target effekter, vi individuelt vurderet fire siRNAs fra siRNA puljer, der anvendes i de sekundære skærme rettet mod de syv gener. De 28 individuelle siRNA’er i deconvolution skærmen (tabel S5) blev evalueret i panelet af EOC cellelinier. For at acceptere nogen af ​​de syv gener som havende, gyldige effekter på-mål om levedygtigheden af ​​EOC cellelinjer, krævede vi, at mindst to ud af de fire individuelle siRNA’er rettet mod hvert gen resulterede i en levedygtighed score på 0,85 eller derunder med en FDR på mindre end 5% på tværs af alle otte af de EOC cellelinier. [23], [24] Baseret på disse strenge kriterier, fire gener,

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

, var anses for at være on target, validerede hits (figur 3A og tabel 1). Dernæst vi samlet de to mest effektive siRNA arter (fremhævet med grønt, tabel S5) rettet mod hver af de fire gener og kvantificeres niveauet af reduktion i celle levedygtighed for hver cellelinje. Disse optimale siRNA pools resulterede i mere end 30% reduktion i cellelevedygtighed over et flertal af EOC cellelinjer (figur 3B).

A. De syv hits udvalgt til yderligere undersøgelser blev valideret ved at udføre udfoldning skærme, hvor individuelle siRNAs, som oprindeligt var en del af en pulje af fire siRNAs i de sekundære skærme blev evalueret for deres virkninger på cellernes levedygtighed. For hvert hit valideres, er de gennemsnitlige normaliserede levedygtighed scores (± SD) efter gendæmpning hjælp af hvert af de fire arter af siRNAs evalueret i de otte EOC cellelinjer vist. Hits blev anset on target, hvis der blev observeret levedygtighed snesevis af mindre end 0,85 for alle otte EOC cellelinjer i mindst to uafhængige siRNA arter rettet mod et gen. De søjlediagrammer repræsenterer de otte EOC cellelinjer i følgende rækkefølge: A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3, og UPN275. B. De to mest effektive siRNA’er rettet mod hvert gen blev samlet (12,5 nM hver siRNA arter) og virkningen på cellelevedygtighed blev kvantificeret. Søjlerne repræsenterer de otte EOC cellelinier som beskrevet i panel AC QRT-PCR blev udført på alle de otte EOC cellelinjer følgende gendæmpning i 72 timer under anvendelse af en pulje af de to mest effektive siRNAs identificeret fra udfoldning undersøgelser fra panel A for de fire hits, blev bestemt til at være på målet. Stjernen repræsenterer

PTN

mRNA-niveauer, som ligger under niveauet for påvisning efter siRNA behandling (dvs. komplet knockdown af mRNA). D. Western blot analyse blev udført efter gendæmpning for enten 72 timer (

HSPA5

,

NDC80

, og

PTN

) eller 120 h (

NUF2

) for at bestemme indholdet af knockdown på proteinniveauet i A1847 celler. Immuno blots blev kvantificeret ved hjælp AlphaView software-version 3.3 (Cell Biosciences).

Som en ekstra kontrol på evnen siRNA’er til korrekt at målrette deres mRNA, brugte vi den optimale pulje af de to mest effektive siRNAs (figur 3B) og udførte kvantitativ RT-PCR til at bestemme niveauet af mRNA knockdown efter transfektion af de puljede siRNA’er for hver cellelinje (figur 3C). Messenger RNA niveauer af

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

på tværs af alle de otte EOC cellelinjer viste sig at blive reduceret med en gennemsnit på 67%, 87%, 77% og 96%, hhv. Western blot analyse efter transfektion af en EOC cellelinje, A1847, blev afsluttet som et supplerende middel til at demonstrere specificiteten af ​​de siRNA puljer ved at evaluere de cellulære niveauer af de respektive proteiner til mRNA’erne bliver målrettet. Alle fire siRNA puljer nedreguleret protein niveauer i deres respektive mRNA mål ved -50% eller mere i denne cellelinje (figur 3D).

Virkninger på apoptose og cellecyklusprogression

Vores endepunkt parameter for cellelevedygtighed, som vi bruges til at identificere de hits i HTS studier giver begrænsede oplysninger om den mekanisme af nedsat cellelevedygtighed /vækst fremkaldt af gendæmpning. Vi har derfor undersøgt de funktionelle effekter af målretning hver af de fire validerede hits på apoptose og cellecyklusprogression anvendelse af to EOC cellelinier, A1847 og A2780. Transficerede vi disse cellelinier med en pulje af de to mest effektive siRNA-sekvenser (12,5 nM hver siRNA, den samme siRNA pool anvendes til kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og Western blots analyse) for hver af de fire validerede hits (

HSPA5, NDC80, NUF2

PTN

) og målt virkningerne på apoptose og cellecyklusprogression 72 timer efter transfektion i 96-brønds plader. I A2780 celler, knockdown af alle fire gener resulterede i en stigning i apoptotiske celler som målt ved positiv annexin V-farvning ved anvendelse af et Guava flowcytometer forhold til celler transficeret med

GL2

-targeting kontrol siRNA (figur 4A). I gennemsnit var der en 2,5 gange stigning i apoptotiske celler. Men i disse celler, var der ingen signifikant virkning på cellecyklussen efter knockdown af disse fire hits (figur 4B).

A1847 og A2780-celler blev transficeret med

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

eller

GL2

siRNAs. Tooghalvfjerds timer efter transfektion blev cellerne høstet og forarbejdet til analyse af apoptose eller cellecyklusprogression. A. C. Fraktionen af ​​apoptotiske celler blev målt ved annexin V-farvning efterfulgt af tælling under anvendelse af en Guava flowcytometer (Millipore). Fold-change i apoptotiske celler er vist (middelværdi ± SD, n = 3). B D. Fraktionen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev målt ved propidiumiodidfarvning efterfulgt af tælling under anvendelse af Guava instrumentet. Den fold-ændring for hver celle cyklus fase vises (gennemsnit ± SD, n = 3).

I A1847 celler, knockdown af tre gener (

NDC80

,

NUF2

PTN

) resulterede i en 1,7 gange stigning i apoptotiske celler i forhold til celler transficeret med

GL2

-targeting kontrol siRNA (figur 4C). Knockdown af

HSPA5

resulterede ikke i nogen væsentlig stigning i apoptose (figur 4C). Vi imidlertid konstatere, at dens knockdown førte til en 2 gange stigning i populationen af ​​celler i G1-fasen af ​​cellecyklussen og en tilsvarende 2-fold fald i G2 /M-fasen (figur 4D). Knockdown af

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

i A1847 celler resulterede i en lille stigning i antallet af celler i S-fasen (figur 4D). Men denne stigning var i gennemsnit mindre end 1,5 gange og syntes ikke at være meget statistisk signifikant. Knockdown af disse fire gener ikke har en målbar effekt på overlevelse af de ikke-tumorigene HIO80 celler (figur S4).

Vurdering af Valideret Hits i kliniske prøver

serøs adenocarcinom er den største undertype af epitelial ovariecancer. For at måle den potentielle kliniske betydning af de fire validerede hits, vi undersøgte The Cancer Genome Atlas (TCGA) æggestokkene serøs adenocarcinom database. [25] Gene udtryk data om de fire validerede hits fra 494 serøse adenocarcinomer blev opnået fra TCGA portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp). Angivelse af

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

er opreguleret med ≥1.5 gange i 98%, 99% og 37% af de tumorprøver, henholdsvis (figur 5); dog kun 1% af prøverne viste ≥1.5 gange overekspression for

HSPA5

med ca. 87% af prøverne viser reduceret ekspression i forhold til normal (figur 5). Ingen af ​​disse gener er muterede i mere end 1% af prøverne (data ikke vist). Vi analyserede næste kopi nummer variation (CNV) og DNA methylering for

NDC80

,

NUF2

og

PTN

bruge TCGA databasen. CNV analyse viste kopi lavt niveau nummer gevinster ( 1,2 gange) i 12%, 39% og 36% af prøverne for

NDC80, NUF2 og PTN,

henholdsvis og en kopi nummer tab i 41% af prøverne for

HSPA5

gen. Der var en svag, men statistisk signifikant korrelation mellem genekspression og antal kopier for de tre gener på tværs af 494 prøver (Figur S5A). Desuden for disse tre gener fandt vi, at i gennemsnit prøverne med kopi nummer gevinst udstillet en 1,6 gange stigning i genekspression i forhold til prøver uden kopi nummer gevinst (p-værdi 0,0001, 0,0001, og 0,25). i ≥94% af tumorprøver dog vi fandt ikke nogen statistisk signifikant sammenhæng mellem udtryk og promoter methylering for nogen af ​​disse gener i TCGA datasæt (data ikke vist).

TCGA datasæt på 494 æggestokkene serøs adenokarcinomer blev forespurgt at bestemme mRNA ekspressionsniveauerne (log

2 (tumor /normal ratio)) af

NDC80

,

NUF2

,

PTN,

HSPA5

. Disse data er vist som søjlediagrammer med grå stiplede linjer angiver den procentdel af prøver med 1,5 gange, 3 gange, 5 gange og 10 gange overekspression sammenlignet med uovertruffen normale prøver i TCGA datasæt.

Validering af klinisk betydning for en uafhængig Kohorte

for yderligere at etablere den potentielle sammenhæng med patogenesen af ​​denne sygdom, undersøgte vi ekspressionen af ​​de øverste fire validerede hits i en uafhængig gen profilering datasæt af primære æggestokkene tumor prøver . [26] genekspressionsprofiler af mikrodissekeret, sent tidspunkt, høj kvalitet æggestokkene serøse carcinomer (n = 53) og mikrodissekeres humanovarie overflade epithelial (slange) prøver (n = 10) blev evalueret. Normaliserede ekspressionsniveauer for alle tumorprøver er vist i figur 6A. Vi fandt, at 48/53 (90%) af tumorprøverne blev overekspression

NDC80

1,5 gange eller mere. Ligeledes 53/53 prøver (100%) for

NUF2

24/53 prøver (42%) for

PTN

viste sig at være overudtrykt af ≥1.5 gange. Disse data korrelerer godt med TCGA data om ekspression i æggestokkene tumorprøver.

HSPA5

blev overudtrykt i 8/53 (15%) af prøverne. Stigningen i de gennemsnitlige mRNA-niveauer på tværs af tumor prøver i forhold til de normale HOSE prøverne var statistisk signifikant for alle fire gener (p 0,005) (Figur 6B). Vi vurderede også den prognostiske værdi af disse gener ved at udføre Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af målingerne intensitet fra microarray data for de fire gener med de tilsvarende kliniske data fra hver patient. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for

NUF2

foreslog, at et højt niveau af mRNA-ekspression var relateret til dårlig prognose hos disse patienter (Figur S6A). Analyse for de øvrige tre gener var ikke statistisk signifikant. (Data ikke vist). En lignende prognostisk værdi på

NUF2

mRNA niveauer blev fundet fra overlevelse analyse af TCGA data (figur S6B).

A. Vist er de genekspressionsniveauer for 53 serøse adenocarcinomer normaliseredes til middel genekspressionsniveauer målt i normalt ovarievæv (n = 10). B. Vist er de gennemsnitlige genekspressionsniveauer tværs af de serøse adenokarcinomer for

NDC80

,

NUF2, PTN

HSPA5.

En to-halet t-test viser, at stigning i genekspression i tumorprøverne er statistisk signifikant i forhold til det normale væv. *** = P 0,0005; ** = P 0,005; * = P. 0,05

Diskussion

De høje nedslidning satser lægemiddeludvikling projekter for målrettede behandlinger [27], nødvendiggør identifikation og validering af nye druggable molekylære mål, med deres rolle i kræft i æggestokkene klart defineret for at minimere svigt af lægemidlet under udviklingspipelinen. Ved hjælp af en integreret RNAi screening tilgang til at målrette over 6.000 druggable gener vi identificeret 53, der var nødvendige for vækst og overlevelse på tværs af et panel af EOC-cellelinjer; syv af disse var overvejende aktive i tumorigene celler og blev anset for yderligere udfoldning og valideringsundersøgelser. Fire kandidater ud af de syv (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, og

PTN

) i sidste ende viste sig at være gyldige hits for EOC celler med minimale virkninger på ikke-tumorigene Hio celler.

de tab-of-funktion screening undersøgelser rapporteret i dette papir har givet os en funktionel genomisk øjebliksbillede af nye molekylære sårbarheder i epitelial ovariekræft uden for rammerne af almindeligt målrettet molekylære signalveje. Vi har undersøgt de fire validerede targets (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

PTN

), alle med en rolle i vækst eller overlevelse EOC-celler, ved hjælp af

in vitro

cellebaserede assays. Resultaterne viser, at æggestokkene tumorigene celler i gennemsnit er forholdsvis mere sårbare over for kandidatlandene mål sammenlignet med ikke-tumorigene celler antyder en mulig terapeutisk vindue for overfølsomhed. Alle fire gener er tidligere blevet beskrevet som rammer i RNA-interferens skærme. [28], [29], [30] Alle fire mål kode for proteiner kan underkastes terapeutisk intervention og tidligere har været rapporteret til at deltage i cellecyklus veje eller overlevelse veje i andre tumortyper. [31], [32], [33] Genomforskning data fra TCGA og Birrer lab yderligere at understøtte den opfattelse, at mindst tre af målene (

NDC80

,

NUF2

,

PTN

) der bør være selektiv sårbarhed over for lægemidler i tumorceller i forhold til normale celler givet den betydelige opregulering i serøse adenokarcinomer. [34] I øjeblikket er de mest lovende hæmmere målrettet disse kandidater omfatter INH11 [35], som er rettet mod NDC80 /NUF2 vej, de neutraliserende anti-PTN antistoffer [36], som funktionelt hæmme tumorvækst fremme aktiviteter af PTN, og epigallocatechingallat som hæmmer HSPA5. [37] Derudover har siRNA-baserede lægemidler også vist sig at være gennemførlige muligheder for

in vivo

terapi [38], [39], [40] giver os muligheder for at gå videre med prækliniske studier til at måle effektiviteten målrette vores fire hits hjælp ortotopisk, xenograft musemodeller for kræft i æggestokkene.

HSPA5

(tabel 1) er et gen, hvis produkt er en central regulator til endoplasmatisk reticulum homeostase, som er afgørende for overlevelse af eukaryote celler. [41] HSPA5 er et stress-inducerbart ER chaperone, der er stærkt induceret i en lang række tumorer gennem faktorer som hypoxi og acidose i mikromiljø dårlig perfusion tumorer. [41] I en tidligere undersøgelse, antistoffer rettet mod celleoverflade HSPA5 induceret apoptose i SKOV3-celler. [42] I den aktuelle undersøgelse, nedregulering af HSPA5 inducerede betydelig apoptose i A2780 celler og viste en signifikant cellecyklusstandsning af A1847 celler i G1-fasen. Genekspression data fra TCGA tyder på, at reduceret udtryk er mere almindeligt, at dette gen, som er i modstrid med vores screening resultater. CNV analyse viser, at

HSPA5

er tabt i 41% af prøverne og mutationsanalyse af TCGA data viser, at

HSPA5

er muteret i mindre end 1% af prøverne. I betragtning af den reducerede udtryk, gendeletion, og mangel på mutationer i tumor prøver fra patienter med ovariecancer, er yderligere undersøgelser nødvendige for at opnå en bedre forståelse af virkningsmekanismen og den kliniske betydning af dette hit for kræft i æggestokkene.

i overensstemmelse med vores screening data,

NDC80

NUF2

er overudtrykt i næsten 100% af prøverne og

PTN

er overudtrykt i ~ 40% af den prøver til to uafhængige grupper af patientprøver. De proteinprodukter af

NDC80 Hotel (

HEC1

,

KNTC2

) og

NUF2 Hotel (

CDCA1

) er en del af en mitotiske kompleks involveret i kinetochore interaktioner og den spindelkonstruktion checkpoint i mitose. [43] mitosen dysregulering er en almindelig årsag i carcinogenese. [44] I en tidligere undersøgelse, har siRNA medieret knockdown mod

NDC80

og

NUF2

vist sig at forårsage unormal mitotisk exit og inducere apoptose i kolorektal cancer og gastrisk cancer cellelinjer. [32] I en anden undersøgelse silencing af

NDC80

i en EOC cellelinie, SKOV3.ip1, foreslået, at en stigning i apoptose-relaterede celledød. [45] Både

NDC80

og

NUF2

har vist sig at være op reguleret i hjerne, lever, og brystkræft. [46] Over-ekspressionen af ​​

NDC80

og

NUF2

er blevet relateret til dårlig klinisk prognose hos patienter med brystkræft og ikke-småcellet lungekræft [43], [47]. Afbrydelse af NDC80 og NUF2 kompleksdannelse under anvendelse af et lille molekyle inhibitor, INH1, har vist sig at reducere proliferation i brystcancerceller og reducere tumorvækst i et xenotransplantat musemodel. [35] Kinetochore komponenter, især NDC80 og NUF2, er blevet foreslået som potentielle mål for kræftmedicin. [48] ​​Vores undersøgelse er den første rapport om NDC80 og NUF2 som potentielle lægemiddelkandidater til behandling af kræft i æggestokkene.

PTN

(pleiotrophin,

HARP

) er et andet interessant gen identificeret hvis produkt er en vækstfaktor kendt for at fremkalde nedstrøms overlevelse signalering veje gennem flere receptorer nemlig ALK, SDC3, SDC1 og PTPRb /z. [49] Det er blevet vist at spille en afgørende rolle i tumorigenese i pancreas, hjerne og bryst tumormodeller. [50] Det er involveret i transformation celle, vækst, overlevelse, migration og angiogenese.

PTN

gen er stærkt udtrykt under embryogenese men viser meget begrænset udtryk i voksne væv, hvor det er begrænset til hjernen. [51], [52], [53], [54] Vi har vist ved anvendelse af ELISA analyser, PTN-værdien er signifikant forhøjet i konditioneret medier af de æggestokkene kræft celle undersøgte linier (G. Sethi og A.K. Godwin, upublicerede data).