PLoS ONE: Autophagosome Proteiner LC3A, LC3B og LC3C har forskellige Subcellulære Distribution Kinetics og Expression i Cancer Cell Lines

Abstrakt

LC3s (MAP1-LC3A, B og C) er strukturelle proteiner af autophagosomal membraner, udbredte som biomarkører for autofagi. Hvorvidt disse tre LC3 proteiner har en lignende biologisk rolle i autofagi uklart. Vi undersøger parallelt subcellulære ekspressionsmønstre for de tre LC3 proteiner i et panel af humane cancercellelinjer samt i normale MRC5 fibroblaster og HUVEC under anvendelse konfokal mikroskopi og western blot-analyse af cellefraktioner. I cytoplasmaet, der var en minimal co-lokalisering mellem LC3A, B og C-farvning, hvilket antyder, at de relevante autophagosomes er dannet af kun en ud af de tre LC3 proteiner. LC3A viste en perinukleær og kernelokalisering, mens LC3B var ligeligt fordelt i hele cytoplasmaet og lokaliseret i de nucleolar regioner. LC3C var placeret i cytoplasmaet og stærkt i kerner (undtagen nucleoli), hvor det i udstrakt grad co-lokaliserede med LC3A og Beclin-1 autofagi initierende protein. Beclin 1 er kendt for at indeholde et signal nuklear handel. Blokering nuklear eksport funktion ved Leptomycin B resulterede i kerneakkumulering af alle LC3 og Beclin-1-proteiner, mens Ivermectin som blokerer kerneimport viste reduktion af ophobning, men ikke i alle cellelinjer. Eftersom endogene LC3 proteiner anvendes som vigtige markører for autofagi i kliniske undersøgelser og cellelinjer, er det vigtigt at kontrollere specificiteten af ​​de anvendte antistoffer, som kinetikken af ​​disse molekyler er ikke identiske og kan have særskilte biologiske roller. De forskellige subcellulære ekspressionsmønstre af LC3s skabe grundlag for yderligere undersøgelser

Henvisning:. Koukourakis MI, Kalamida D, Giatromanolaki A, Zois CE, Sivridis E, Pouliliou S, et al. (2015) Autophagosome Proteiner LC3A, LC3B og LC3C har forskellige Subcellulære Distribution Kinetics og Expression i kræftceller. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10,1371 /journal.pone.0137675

Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, INDIEN

Modtaget: Juli 4, 2015; Accepteret: August 20, 2015; Udgivet: 17 September, 2015

Copyright: © 2015 Koukourakis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. undersøgelsen er finansieret af «videreuddannelse og livslang læring – ARISTEIA» projekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013 GGET beslutning nummer 12.605 /2012/09/26 (URL: https://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Autophagy er en stor intracellulær vej for nedbrydning og genanvendelse af langlivede proteiner og hele organeller [1,2]. LC3s (MAP1-LC3s) er strukturelle proteiner af autophagosomal membraner. Den menneskelige LC3 gen familie har tre medlemmer, LC3A, LC3B og LC3C, mens to varianter af LC3A protein er blevet identificeret [3,4]. Den menneskelige LC3 gen familie har tre medlemmer LC3A, LC3B og LC3C mens i en nylig papir er blevet rapporteret fem medlemmer, LC3A (variant-1, variant-2), LC3B, LC3B2 og LC3C [4]. Formularen LC3-II er en af ​​de vigtigste komponenter i autophagosome membran (LC3A-II og LC3B-II, også LC3C-II, men ikke undersøgt her), der er bosat i både den indre og ydre side af membranen. Den LC3-II er afledt af en proLC3 ~ 30 KDa protein efter spaltning med autophagin Atg4 at danne den aktive cytosoliske formular LC3-I. Dette på sin side aktiveres af Atg7, og derefter overført til Atg3, en anden E2-enzym, bliver en membranbundne form, LC3-II [5]. Efter autophagosome formation, er det LC3-II, der ligger i den ydre stedet frigives til cytosolen og LC3-II beliggende i den indre side nedbrydes af hydrolaser [6]. I denne sidstnævnte form LC3-II lokaliseres på de kugleformede autophagosomal og autolysosomal membraner, der danner en egnet markør af autophagic aktivitet [6,7].

Hvorvidt disse tre LC3 proteiner har en lignende biologisk rolle i autofagi eller anden veje er stadig uklar. I litteraturen, de fleste undersøgelser fokuserer på en samlet LC3 udtryk, uden at rapportere om de særlige anvendte antistoffer baseret på den vilkårlige antagelse, at A og B former er ækvivalente. I den aktuelle undersøgelse undersøger vi, efter ekstensivt validering af antistofspecificitet, ekspressionen parallelt af tre LC3A, B og C-proteiner i humane cancercellelinjer, der viser forskellige mønstre af sub-cellulær lokalisering, hvilket antyder en tydelig biologiske rolle af disse søster proteiner .

Resultater

Identifikation af LC3A og B specifikke antistoffer

specificiteten af ​​de testede mod til de kommercielle tilgængelige humane rekombinante proteiner LC3A og LC3B antistoffer er vist i fig 1A. De anti-LC3A antistoffer (ap1805a og ab62720) er specifikke for proteinet LC3A og anti-LC3B antistoffer (5F10 og NB100-2220) er specifik for proteinet LC3B. Den L8918, kan NB600-1384 og L7543 binde enten til LC3A eller LC3B, men med forskellig følsomhed, mens ab52628 ikke har kunnet påvise nogen af ​​de to isoformer under de samme betingelser.

(A) Specificitet af forskellige anti-LC3 antistoffer testet mod rekombinante LC3A og LC3B proteiner. (B) Den LC3A og LC3B behandling efter 24 timer af bafilomycin (100 nM) behandling i gliom og brystkræft cellelinier, ved hjælp af LC3A specifikke ab62720 og LC3B specifikke 5F10 antistoffer (C) Dobbelt immunofluorecence i A549-cellelinje ved hjælp af ab62720 anerkende udelukkende LC3A proteinet og 5F10 antistof, der reagerer udelukkende med LC3B. Bemærkes en klart adskilt udtryk for LC3A i grønne vakuoler med perinukleære /nukleare lokalisering og LC3B røde vakuoler, der har en diffus, hele cytoplasmaet, lokalisering. Der er ingen autophagosomes sammensat af både LC3A og LC3B proteiner (C1, C2), mens LC3A og LAMP2a show omfattende co-lokaliseringstoppe (C3, C4). Den tydelige identitet LC3A og LC3B autophagosomes blev også bekræftet under sure betingelser (C5) og efter udsættelse for bafilomycin (c6). (D) Dobbelt immunofluorecence i A549-cellelinje ved hjælp af ab62720 udelukkende anerkende LC3A protein og NB600-1384, som reagerer med både LC3A og LC3B proteiner. Bemærkes, at størstedelen af ​​perinukleære /nuklear LC3A (grøn) vakuoler viser dobbelt immunofluorescens (gul), et resultat af dobbelt LC3A /LC3B reaktivitet, der producerer NB600-1384 antistof. (E) LC3A og LC3B siRNA’er specifikt blokerer ekspressionen af ​​LC3A og LC3B proteiner henholdsvis i A549-cellelinje (E1,2,3). I E4 reaktiviteten af ​​LC3A (ab62720 Ab) og LC3B (5F10 antistof) vises, efter lyddæmpning af LC3A eller de LC3B gener i A549-cellelinje.

Vi fokuserede på både LC3A og LC3B proteiner til at analysere autophagic reaktion på bafilomycin i cellelinjer under anvendelse af de to antistoffer, som selektivt genkender disse isoformer. De to isoformer viste forskellige basislinie og reaktion profil ekspression (Fig 1B) Under bafilomycin stress der var akkumulering af LC3A-II og LC3B-II i alle cellelinier, hvilket antyder, at begge proteiner kan anvendes til at vurdere autophagic flux (Fig 1B) . De T98G og BT474 cellelinier har højere autophagic flux (som vurderet enten ved LC3A eller LC3B immunblotting) sammenlignet med U87MG og MDA-MB-231 (fig 1B).

LC3A og LC3B udtrykkende autophagosomes

Konfokal mikroskopi med dobbelt LC3A /B immunofluorescens, ved anvendelse LC3-typespecifikke antistoffer, afslørede, at LC3A og LC3B autophagosomes er adskilte, og at der ikke er nogen autophagosomes udtrykker begge proteiner (figur 1C1 og 1C2). Dette fund var universelle i alle undersøgte cellelinjer. Colokalisering analyse viste en procentsats 1%, mens LC3A /LAMP2A colokalisering i kontrol- celler var højere end 20% (Fig 1C3 og 1C4)

Den tydelige identitet LC3A versus LC3B autophagosomes blev også bekræftet efter intensivering af autofagi. under sure betingelser (fig 1C5) og efter autophagy flux blokering efter udsættelse for bafilomycin (fig 1C6). I modsætning hertil viste ikke-specifikke antistoffer til en lang overlejre ekspression, et resultat af dobbelt anerkendelse af LC3A og LC3B af antistoffet (Fig 1D1 og 1D2).

Brug siRNA for LC3A og LC3B, disse specifikt blokeret akkumuleringen af LC3A eller LC3B autophagosomes, (fig 1E1, 1E2 og 1E3). Silencing af LC3A eller LC3B bekræftede tab af identifikationen af ​​de respektive proteiner i western blots (Fig 1E4).

Cytoplasmatisk LC3A og LC3B lokalisering mønstre

Fordelingen af ​​LC3A og LC3B i cytoplasmaet var helt adskilte. LC3A blev hovedsageligt akkumuleret i perinukleære området, mens LC3B jævnt blev fordelt i hele cytoplasmaet. Dette fænomen var tydelig i alle undersøgte cellelinjer og, som vist ved cytoplasmisk ekspression intensitet analyse, perinukleære LC3A nåede op til 90% (interval 60-90%) af det totale protein cytoplasmatisk indhold (fig 2A1-2A7). Lejlighedsvis, små LC3A + autophagosomes inkluderet i LC3B + autophagosomes var tydelige i cytoplasmaet (fig 2A1 og 2A2).

(A) Konfokal dobbelt immunofluorescens for LC3A (grøn) og LC3B (rød) i forskellige cellelinier. Bemærkede LC3A ophobning i perinukleære område, mens LC3B er fordelt over hele cytoplasmaet (A1-7). LC3 aggregater, der tyder på små LC3A + autophagosomes inkluderet i LC3B + autophagosomes, er lejlighedsvis til stede (kasser i A1,2). Western blots bekræfter nukleare tilstedeværelse af LC3A i kerner, hovedsagelig med LC3A-II-formen (A8). (B) nucleoli farves med MIB1 /grøn (B1), den LC3B /rød (B2), men ikke den LC3A /violette antistof (B3); LC3A specifik ap1805a og LC3B specifikke 5F10 antistoffer blev anvendt. Dette bekræftes i dobbelt immunfarvning for LC3A /MIB1 (B4), LC3B /MIB1 (B5) og LC3A /LC3B (B6). Bemærkede, at LC3B farver de interne nucleolar områder, mens MIB1 det perifere. (C) Actinomycin D skader nucleoli og forstyrrer den nucleaolar LC3B og MIB1 lokalisering (C1). Sure betingelser (pH = 6,5; C2) eller hypertermi (40 ° C; C3) ikke ophæver fordelingen af ​​LC3B i nucleoli eller af LC3A i kerner. Lamin bruges også som en kontrol for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​kerner kun i den nukleare fraktion.

Nuklear LC3A og LC3B lokalisering mønstre

LC3A blev tydeligt lokaliseret i kerner af alle kræft cellelinier undersøges, herunder HUVEC s og den humane MRC5 fibroblast linie (fig 2A1-2A7). Western blot-analyse efter tredobbelt fraktionering (nuklear-pille-supernatant) viste tydeligt tilstedeværelse af LC3A proteiner i kerner, mere tydelig som LC3A-II formen, det var mere fremtrædende i glioblastom celler (Fig 2A8).

LC3B blev dårligt udtrykt i kerner, men stærkt udtrykt i de nucleolar regioner, et område, der var negative for LC3A. Nucleolar stærk farvning er tydeligt i 60-95% af celle afhængigt af cellelinjen. F.eks A549 lungekræft cellelinien udviser denne farvningsmønster i 60% af dyrkede celler, mens dette er så højt som 95% i lungecancer H1299 cellelinie. Fig 2B1-2B6 viser et typisk mønster af udtryk i 4-farve konfokal mikroskopi. Ki67 pletter nucleoli og colocalizes med LC3B, men ikke LC3A. Behandling af celler med actinomycin D (Fig 2C1), der skader nucleoli resulterede i manglende LC3B og Ki67 lokalisering i kerner. I modsætning hertil eksponering af celler for sure betingelser (pH = 6,5) eller hypertermi (40 ° C) i 24 timer ikke ophæver fordelingen af ​​LC3B i nucleoli eller LC3A i kerner (fig 2C2 og 2C3). Western blot-analyse i den nukleare fraktion bekræftede tilstedeværelsen af ​​LC3B proteinet (figur 3).

(A, B, C) 24h inkubation med Leptomycin B ved 10 ng /ml, resulterer i kerneakkumulering af LC3A, LC3C og Beclin-1 i lunge A549, H1299 og glioblastom U87, T98 cellelinier. (D) 24h inkubation med Ivermectin på 100 ug /ml, reducerede nukleare ekspression af LC3A /Beclin-1 i A549 og H1299 cellelinier og øget perinukleære akkumulering af LC3A i H1299-cellelinien. (E) Western blots af den nukleare fraktion celle bekræfte akkumulering af LC3s og Beclin-1 i lunge- og glioblastoma-cellelinier efter inkubation med Leptomycin B. Reduktionen af ​​proteiner efter inkubering med Ivermectin var ikke konsistente i alle cellelinjer.

Angivelse af LC3C

LC3C blev klart udtrykt i cytoplasmaet og mere intensivt i kerner af celler (fig 4A). Western blot analyse viste en klar tilstedeværelse af LC3C i den nukleare fraktion (Fig 4E). Der var ingen tydelig lokalisering i kernelegeme områder og i dobbelt immunofluorescens med LC3B der klart mangel på collocalizaton i nucleoli og i cytoplasmaet (figur 4B). I dobbelt immunfluorescens, LC3C blev grundigt co-lokaliseret med LC3A på det nukleare område (Fig 4C og 4D), mens deres colokalisering var minimal i cytoplasmaet. Den fremtrædende ekspression af LC3C i kerner blev også bekræftet i Western blot-analyse (Fig 4E). Disse fund blev bekræftet i alle undersøgte cellelinjer. Tabel 1 opsummerer de forskellige udtryk mønstre for LC3A, LC3B og LC3C.

(A) Cytoplasmisk og nuklear farvning af LC3C (rød) i U87 cellelinje. (B) Dobbelt LC3C (rød) og LC3B (grøn) immunfarvning i U87-celler, der viser mangel på co-lokalisering mellem de to proteiner, både i cytoplasmaet og de nukleare /nucleolar regioner. (C, D) Dobbelt LC3C (rød) og LC3A (grøn) immunfarvning viser co-lokalisering mellem de to proteiner, primært på det nukleare område (U87 og T98-cellelinjer). (E) Western blot for LC3C i den nukleare (N), pellet (P) og opløselig (S) fraktion af U87 og T98-celler. ‘M’ er den markør og Lamin bruges som en kontrol for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​kerner kun i den nukleare fraktion.

LC3 nucleo-cytosolisk handel

Celler var inkuberet i 24 timer med Leptomycin B, et specifikt og potent hæmmer af CRM1 /exportin en sti af nuklear eksport. Ved 10 ng /ml for 24 h inkubation blev akkumulering af LC3A i kerner steg, hvilket antyder en blokering af LC3A ekstrudering kinetik fra kernerne (Fig 3A). Af interesse, LC3A kerneakkumulation udviste en intens co-lokalisering med autofagi signalering protein Beclin-1, og lignende kinetik under Leptomycin B eksponering (figur 3B). Lignende kinetik og co-lokaliseringstoppe mønstre med Beclin-1 blev bekræftet for LC3C protein (figur 3C).

Ivermectin, på den anden side, er en potent hæmmer af importin

α-service /

β Hotel (Imp

α-service /

β

1) kerneimport afhængig transport. Celler blev inkuberet i 24 timer med Ivermectin i forskellige koncentrationer. Efter en 24 h inkubation ved 100 ug /ml, ophobning af LC3s og Beclin-1 i kerner blev reduceret, mens cytoplasmatisk farvning blev forøget (fig 3D og 3E). Resultaterne dog varierede blandt cellelinjer, som faldet udtryk ikke blev bekræftet for alle proteiner i alle cellelinjer.

Diskussion

Hos mennesker den LC3 gen familien har fem medlemmer, LC3Av1 ( variant 1, NM_032514), LC3Av2 (variant 2; NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) og LC3C (NM_001004343). Den geneloc for LC3A er 20.q11.22 mens for MAP1LC3B er 16q24.2 og MAP1LC3C er 1q43. Både LC3A og LC3B udtrykkes forskelligt i normale væv [3,4,7,8]. Endvidere er LC3C (tredje isoform af LC3 familie) menes at være dårligt eller ikke udtrykkes i de fleste normale væv [3,4,7]. Det er dog kun den LC3A (variant 1), LC3B og LC3C har været show at have stillingen oversættelse modifikation og generere form-II [4]. Endvidere går tilbage til litteraturen [3,7,8] stillingen oversættelse site for MAP1LC3B kun ikke bevaret. For eksempel He et al. 2003 [3] rapporterede, at væsentlige site for den særskilte post-translation modifikation af MAP1LC3B er Lys-122 i stedet for den bevarede Gly-120, som rapporteret for MAP1LC3A og MAP1LC3C. På den anden side Tanida et al. 2005 [8], at carboxylterminus af MAP1LC3B spaltes for at blotlægge Gly (120) for yderligere ubiquitylering-lignende reaktioner. I disse to publikationer det sømme, at MAP1LC3B producere LC3B-II, mens den post-translationel modifikation websted ikke er bevaret.

I litteraturen den bedst studerede endogene autophagic markør er LC3B. Det understreges dog, at de fleste af studierne udførte bruge anti-LC3 antistoffer formodes at være anti-LC3B og ikke anti-LC3A, uden at have valideret deres specificitet [9,10,11]. Der er en høj identitet mellem LC3A og LC3B isoform, hvilket indikerer, at de epitoper anvendes til udvikling af specifikke antistoffer er afgørende. Ifølge vores resultater nogle antistoffer er ikke specifikke, erkender begge isoformer med en varierende følsomhed, mens andre er i stand til at opdage de specifikke isoformer af LC3A og LC3B. Under alle omstændigheder ville angive LC3-typen undersøgt være unødvendig, hvis faktisk de forskellige LC3 proteiner havde samme ekspressionsmønster og biologi i normale og cancer væv. Dette er imidlertid ikke tilfældet, som vist i den aktuelle undersøgelse.

I en tidligere undersøgelse af vores [12], undersøger autophagic flux i musevæv efter forskellige belastninger, viste, at LC3A protein følger diskrete mønstre immunoblotting arbejde af LC3A-i og LC3A-II ændringer i lever, lunge, nyre og hjerte væv fra mus. Det understregede, at LC3A er også understrege inducerbare og har specifikke mønstre af udtryk for sin opløselige og autophagosome bundet formular. Heri, i konfokal mikroskopi hjælp valideret specifikke anti-LC3 antistoffer vi bekræftet, at LC3A og LC3B autophagosomes er forskellige, aldrig komponeret af begge proteiner og har tydelig subcellulære fordeling. Den LC3A fremherskende perinuklear udtryk i kontrast til den temmelig homogen fordeling af LC3B hele cytoplasmaet, hvilket tyder på en klar biologisk rolle mellem de to autophagosome typer. Af interesse, i et papir fra Bai et al. 2012 [4]. LC3A og LC3B ofte co-lokaliseret i samme puncta i sult betingelser (67%), mens i basale betingelser co-lokaliseringen var på 13% i Saos-2-celler. Vi bemærkede også, i konfokal mikroskopi, en sporadisk colokalisering af LC3A og LC3B, giver indtryk af en stor LC3B + autophagosome fordøje en LC3A + én.

Det cytoplasmatiske biologi LC3 medieret autofagi er godt undersøgt. Rolle LC3s i kerner uklart. Karim et al først opdaget LC3-II-protein form kerner af rottehepatocytter [13], hvilket er i overensstemmelse med vores ikke offentliggjorte erfaring med BALB /c mus hepatocytter. Drake et al rapporterede, at selvom LC3A og B deler ingen kendt kernelokaliseringssignal, kan en nuklear signal eksport eksisterer, beliggende ved rester 63 til 73 af humant LC3 [14]. EGFP-LC3 protein blev tydeligt lokaliseret i kernerne i COS-7-celler. I den aktuelle undersøgelse, anvendelse af en bred vifte af cancercellelinjer, samt normale humane fibroblaster og endotelceller, bekræftede vi den nukleare tilstedeværelse af alle tre LC3 proteiner. Der var imidlertid en slående differentiel lokalisering af LC3B protein, fortrinsvis lokaliseret i de nucleolar regioner, mens A- og C-former blev lokaliseret i den ekstracellulære nucleolar nukleare område. Rolle denne LC3B nucleolar udtryk stadig et mysterium, ligesom rolle LC3A og LC3C i resten af ​​kernen. Han et al foreslog, at nuklear LC3 kan være involveret i styringen af ​​celleproliferation i promyelocytleukæmi [15].

Vi undersøgte, om kendte veje nukleare transport er involveret i nucleo-cytosoliske handel med LC3s. Det nukleare protein import og eksport vej medieret af nukleare pore komplekser (NPC) blev undersøgt ved hjælp af agenten Leptomycin B, et svampemiddel antibiotikum, der specifikt og potent hæmmer CRM1 /exportin en sti af nuklear eksport ved direkte binding af CRM1 protein [16 , 17]. Efter 24h inkubation af lunge- og glioblastoma-cellelinier, en væsentlig akkumulering af LC3A, LC3C og Beclin-1-proteiner var tydeligt ved konfokal mikroskopi, hvilket også blev bekræftet på Western blot-analyse. Dette står i kontrast med konstateringen af ​​Drake et al [14], hvor en kort 3h inkubation af COS-7 og HeLa-celler med Leptomycin ikke resulterede i EGFP-LC3 nukleare akkumulation. Beclin-1 indeholder en leucin-rige nuklear eksport signal og afbrydelse af CRM1 funktion resulterer i kerneakkumulering af Beclin-1 [18]. Af interesse, Beclin-1 co-lokaliseres i kerner med LC3A og LC3C, mens ingen fremtrædende co-lokalisering blev bemærket i cytoplasmaet. Hvorvidt Beclin-1 binding til LC3 er nødvendig for nuklear indgangen til en komplekse krav yderligere undersøgelse.

Ivermectin, på den anden side, er en potent hæmmer af importin

α-service /

β Hotel (Imp

α-service /

β

1) kerneimport afhængig transport, uden effekt på proteiner indeholdende kernelokaliseringssignal (NLS) anerkendt af alternative veje import nukleare [19] Inkubation af cancercellelinier med Ivermectin resulterede i nedsat ekspression af LC3s og Beclin-1 i kerner, et resultat dog, at varierede blandt cellelinjer og proteiner undersøgte.

Eftersom endogene LC3 proteiner er vigtige markører for autophagy, er det vigtigt at kontrollere specificiteten af ​​de anvendte antistoffer, når du udfører eksperimenter for LC3A eller LC3B forarbejdning i respons på forskellige typer af stressfaktorer. Disse molekyler er ikke identiske og kan have forskellige biologiske roller, ikke godt afklarede endnu. Den nucleolar LC3B lokalisering og den nukleare LC3A, LC3C og Beclin-1 akkumulation findes i den aktuelle undersøgelse som grundlag for yderligere undersøgelser af særskilte biologiske rolle disse proteiner kan have i normale og cancer væv.

Materialer og metoder Salg

cellelinjekulturer Salg

Lung cancercellelinier A549 (human lunge-adenocarcinom, CLS GmbH, Tyskland), og H1299 (human ikke-småcellet lungekræft, ATCC), glioblastoma-cellelinier U87MG ( humant glioblastom-astrocytoma, CLS GmbH, Tyskland) og T98G (human glioblastoma multiforme, ATCC), brystcancer cellelinjer (HER2 + BT474, HER negative MDA-MB-231, DA3; ATCC), såvel som embryonale MRC5 fibroblaster cellelinier ( CLS Cell linje service, Tyskland) blev dyrket under anvendelse af DMEM basalt medium (31885-023, Gibco). HUVEC celler (CLS cellelinje service, Tyskland) dyrket i specifikke medium (EBM ™ -2 Basal Medium med EGM ™ -2 SingleQuots ™ af vækstfaktorer, Lonza) blev også undersøgt. Naeringsoploesning blev tilsat 10% FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (15.140-122, Gibco) og 2 mM L-glutamin (25030, Gibco). Celler blev holdt ved standardbetingelser, 37 ° C, 5% CO2 i befugtet atmosfære og blev brugt efter at have nået 70-90% sammenløb.

Kemikalier

De cellekulturer blev behandlet separat, som angivet i 24 timer inkubationstid med Leptomycin B (L2913, Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 20 ng /ml og Ivermectin (I8898, Sigma-Aldrich) ved en slutkoncentration på 100 ug /ml.

Identifikation af LC3A, B og C specifikke antistoffer

for at teste specificiteten af ​​kommercielt tilgængelige antistoffer med hensyn til deres specificitet for LC3A eller LC3B følgende antistoffer blev brugt mod den kommercielle tilgængelige menneskelige rekombinante proteiner LC3A (H00084557-P01, Abnova) og LC3B ( H00081631-P01, Abnova):

polyklonalt kanin til LC3A (1: 30.000, ab62720, Abcam, et syntetisk peptid PSDRPFKQRRSFADR konjugeret til KLH ved en cysteinrest linker, svarende til aminosyrerne 2-15 af humant MAP1LC3A)

polyklonalt kanin til LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, en syntetisk mellem 97 ~ 120 aminosyrer fra den C-terminale spaltningssted af human spaltet-LC3A anvendelse som en epitop)

kanin monoklonale til LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam)

polyklonalt kanin til LC3B (1: 5.000, NB600-1384, Novus, et syntetisk peptid fremstillet til den N-terminale region af den humane LC3, isoform B protein),

polyklonalt kanin til LC3B (1: 5.000, L7543 Sigma-Aldrich, et syntetisk peptid svarende til aminosyrerne 2-15 af human LC3B, konjugeret til KLH)

kaninen polyklonale til LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, et syntetisk peptid fremstillet til en N-terminal del af det humane LC3B proteinsekvens mellem resterne 1-100)

kanin polyklonale til LC3 ( 1: 5.000, L8918, Sigma-Aldrich, et syntetisk peptid svarende til aminosyrerne 36-49 af humant LC3A isoform a, konjugeret til KLH via C-terminale cysteinrest)

det monoklonale muse-antistof mod den. LC3B. (1: 5000, 5F10, Nanotools, et syntetisk peptid lavet til en N-terminale del af den menneskelige LC3B protein)

med hensyn til anti-LC3C anibody, brugte vi kaninen polyklonale (18.726-1-AP, Proteintech Europa) antistof. Specificiteten af ​​anti-LC3C antistof, der anvendes er tidligere blevet rapporteret (https://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).

Udsættelse for bafilomycin

LC3A og LC3B blev analyseret i cellelinjer under eksponering for autofagi forstyrre middel bafilomycin A [8]. Bafilomycin A er en specifik inhibitor af vakuolær type H (+) – ATPase (V-ATPase) i celler, inhiberer forsuring af organeller, der indeholder dette enzym (såsom lysosomer og endosomer) og desuden hæmmer fusion af autophagososomes med lysosomer [8]. Vurderingen blev udført 24 timer efter inkubation af celler med 100 nM bafilomycin.

SDS-PAGE og Immunoblotting

Celler blev vasket med PBS to gange og lyseret i en sucrose-baserede lysepuffer (0,25 M saccharose , 25 mM Tris-HCI, pH 7,4) indeholdende proteaseinhibitorer (komplet mini proteaseinhibitorcocktail, Roche Diagnostics GmbH) og phosphataseinhibitorer (phosphatase inhibitor cocktail, Cell Signaling Technology). En differentiel centrifugering af helcellelysater førte til nuklear, supernatant (cytoplasmatisk-vandopløselige proteiner) og pellet (membranproteiner) fraktioner. Protein kvantificering blev udført ifølge den Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (# 23225, Thermo Scientific).

Proteinprøver blev separeret på diskontinuerlige SDS-geler under anvendelse af 10% adskillende gel for Beclin-1, mens for LC3A, LC3B og LC3C 12,5% separationsgel blev anvendt. Desuden blev 5% stacking gel anvendes. Fyrre nanogram af prøver analyseret på gelen. Immunoblotting blev udført under anvendelse af PVDF-PSQ membraner (Millipore Corp.). Derefter blev membraner blokeret med 5% fedtfri tørmælk i 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (TBS) og 0,1% (v /v) Tween-20 ved stuetemperatur i 2 timer efterfulgt af hybridiseringen natten over ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranerne blev derefter hybridiseret i 2 timer ved stuetemperatur med det sekundære antistof, ged polyklonale til kanin-IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1.706.515, USA) eller ged polyklonale til muse-IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1.706.516, USA). Bånd blev udviklet ved hjælp Chemidoc MP Imaging System (Biorad, USA)

De primære anvendte antistoffer var: i.) Kanin polyklonale til LC3A (1: 1.000, ab62720, Abcam, et syntetisk peptid PSDRPFKQRRSFADR konjugeret til KLH ved en cysteinrest linker, svarende til aminosyrerne 2-15 af humant MAP1LC3A), ii) monoklonalt antistof fra mus til LC3B (1: 1.000; LC3B 5F10 Nanotools), iii) kanin-polyklonale antistoffer mod MAP1LC3C (1: 1.000, ProteinTechLab) og iv) kanin polyklonalt antistof mod Beclin-1 (1: 2.000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., USA)

Hver af disse blots blev derefter strippet, tørret natten over, re-hybridiseres med monoklonalt muse-antistof til actin beta. (1: 5000, NB600-501, Novus Biologicals)

siRNA

LC3A siRNA’er blev samlet som (5′-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 ‘), (5’GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3′ ), (5’-CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3 ‘), (5′-GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3′), og LC3B siRNA blev hver kombineret som (5’-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 ‘), (5′-CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3’), (5’GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 ‘). Disse blev skik syntetiseret fra Shanghai GenePharma Co., Ltd (Kina). Disse blev anvendt ved 20-50 nM til transfektion celler under anvendelse HiPerfect (QIAGEN) i 24 timer, mens silencing effektivitet siRNA’er blev bekræftet både ved konfokal mikroskopi og western blot efter 24 timer.

Konfokal immunofluorescens og Billedanalyse

i immunfluorescensfarvning blev celler dyrket på No. 1,5 dækglas, fikseret i 3,7% paraformaldehyd /PBS pH 7,4 i 20 minutter ved 37 ° C og derefter permeabiliseret i PBS /0,1% vol /vol Triton X- 100 pH 7,4 i 5 minutter ved stuetemperatur. Desuden blev cellerne blokeret i PBS /5% vægt /volumen BSA pH 7,4 i 20 minutter og farvet med forskellige primære antistoffer: anti-Ki67 (MIB1) muse-monoklonalt (1: 150; DAKO), anti-LC3A kanin polyklonale (1 : 500; Abcam), anti-LC3C kaninpolyklonalt (1: 200; Proteintech Europa), anti-LC3B monoklonalt muse (1: 200; Nanotools) og anti-Beclin-1 polyklonalt kanin (1: 100, ab62557, Abcam) for . 1 time ved stuetemperatur

Celler blev vasket i PBS pH 7,4, inkuberet med passende CF 488 og 564 sekundære antistoffer ved stuetemperatur, og DNA blev modfarvet med Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Efter afsluttende vaske dækglas blev monteret i hjemmelavet Mowiol montering medium. Imaging blev udført på en tilpasset Andor Revolution Spinning Disk Konfokal System bygget op omkring et stativ (IX81, Olympus) med en 60x linse og et digitalt kamera (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-DUTH). Billede købet blev udført i Andor IQ 2-software. Optiske snit blev registreret hvert 0,3 um. Alle konfokale mikroskopi billeder præsenteres i dette arbejde er 2D maksimal intensitet fremskrivninger af z-stack billeder og billedanalyse for de opnåede datasæt er blevet udført ved hjælp ImageJ 1.47v (National Institute of Health, USA). Co-lokalisering analyse billeder og beregning af Pearsons koefficient for de analyserede billeder blev udført ved hjælp af en kombination af en lokalisering Finder og Coloc 2 plugins i ImageJ.

Etik

Undersøgelsen er godkendt af Demokrit University i Thrakien Research etiske komité.

Tak

undersøgelsen er finansieret af «videreuddannelse og livslang læring-ARISTEIA» projekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013 GGET beslutning nummer 12.605 /2012/09/26