PLoS ONE: Cirkulerende Carnosine dipeptidase 1 Associates med vægttab og dårlig prognose i Gastrointestinal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kræft kakeksi (CC) er knyttet til dårlig prognose. Selvom de mekanismer, der fremmer denne betingelse ikke er kendt, er blevet foreslået flere cirkulerende proteiner til at bidrage. Vi analyserede plasma proteomet i cancerpatienter med henblik på at identificere faktorer, der er forbundet med kakeksi.

Design /Emner

Plasma blev opnået fra en screening kohorte af 59 patienter, nyligt diagnosticeret med mistanke gastrointestinal cancer, med (n = 32) eller uden (n = 27) kakeksi. Prøverne blev udsat for proteomisk profilering ved hjælp 760 antistoffer (rettet mod 698 individuelle proteiner) fra det humane protein Atlas-projektet. De vigtigste resultater blev valideret i en kohorte af 93 patienter med verificeret og avanceret bugspytkirtel kræft.

Resultater

Kun seks proteiner viste forskellen plasmaniveauer i screeningen kohorte. Blandt disse blev Carnosine dipeptidase 1 (CNDP1) bekræftet ved sandwich-immunassay til at være lavere i CC (p = 0,008). I begge kohorter, var lave CNDP1 niveauer associeret med markører for dårlig prognose, herunder vægttab, underernæring, lipid opdeling, lave cirkulerende albumin /IGF1 niveauer og dårlig livskvalitet. Elleve af de emner i opdagelsen kohorten blev endeligt diagnosticeret med non-malign sygdom, men at udelade disse emner fra analyserne havde ikke nogen stor indflydelse på resultaterne.

Konklusioner

I gastrointestinal cancer, reducerede plasmaniveauer af CNDP1 associeret med tegn på katabolisme og dårligt resultat. Disse resultater, sammen med nyligt offentliggjorte data viser lavere cirkulerende CNDP1 hos forsøgspersoner med glioblastom og metastatisk prostatacancer, antyder, at CNDP1 kan udgøre en markør for aggressiv kræft og CC

Henvisning:. Arner P, Henjes F, Schwenk JM , Darmanis S, Dahlman I, Iresjö BM, et al. (2015) cirkulerende Carnosine dipeptidase 1 Associates med vægttab og dårlig prognose i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 10 (4): e0123566. doi: 10,1371 /journal.pone.0123566

Academic Redaktør: Juergen Eckel, GDC, TYSKLAND

Modtaget: December 4, 2014 Accepteret: 19 februar 2015; Udgivet: 21 April, 2015

Copyright: © 2015 Arner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske Heart og Lung Foundation, den svenske Diabetes Association, Novo Nordisk Fonden, den svenske Cancer Foundation, DiabetesWellness, den Swedish Medical Association, det svenske Forskningsråd, det strategiske forskningsprogrammet i Diabetes på Karolinska Institute, Knut og Alice Wallenbergs Stiftelse og SciLifeLab Stockholm. Ingen af ​​de finansieringskilder har deltaget i planlægning, udførelse, analyse af data eller skrive manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cachexi er en betingelse for ufrivillig vægttab observeret i kroniske sygdomme som kræft, inflammatoriske sygdomme, kongestiv hjerteinsufficiens og end-stage nyresygdom [1]. Så mange som halvtreds procent af alle kræftpatienter erfaring cancer kakeksi (CC), som er stærkt forbundet med reduceret overlevelse og dårligt respons på antitumor behandling [2]. Reduceret fødeindtagelse kan bidrage til CC [3], men det gør ikke alene forklare dens udvikling, og kosttilskud ikke vende processen [4]. Trods en stor indsats, de underliggende kausale mekanismer er fortsat uklare, og der er ingen effektiv behandling, selv om flere palliative strategier er blevet foreslået [5,6,7,8].

Både fedtmasse og mager kropsmasse er opbrugt i avancerede CC [5,9]. Imidlertid har longitudinelle studier vist, at tab af hvide fedtvæv (WAT) masse tidligere end muskelsvind [10,11]. Resultater i de senere år har også vist, at WAT masse reduktion i CC primært er forbundet med øget hydrolyse (lipolyse) [12] og oxidation [13] af adipocyt triglycerider. De mekanismer, der påvirker lipid metabolisme i CC er ikke kendt, men det er muligt, at faktorer frigives i omsætning, enten direkte fra tumoren eller indirekte fra andre væv, kan fremkalde ændringer i fedt celle lipolyse /lipid oxidation [12]. Flere kandidater er blevet foreslået i årenes løb, herunder zink-alpha2-glycoprotein og tumornekrosefaktor-alpha [14], selv efterfølgende undersøgelser har vist, at ingen af ​​dem kan

per se

forklare øget fedttab i CC [10 , 15].

Identifikation af nye cirkulerende proteiner forbundet med CC er blevet hæmmet af flere grunde, ikke mindst det faktum, at plasma /serum er en kompleks matrix, hvor de 20 mest udbredte proteiner udgør ~ 98% af proteinindholdet [16]. Følgelig påvisning af proteiner, der findes på lavere niveauer kræver affinitet proteom tilgange hvor den største hindring har været tilgængeligheden af ​​specifikke affinitetsreagenser. For nylig har flere konsortier igangsat bestræbelser på at løse denne hurdle og producere specifikke affinitet bindere [17]. The Human Protein Atlas (HPA) projektet [18] tager sigte på at skabe mindst et antistof mod hvert menneske protein og i øjeblikket ~ 22.000 antistoffer rettet mod ~ 16.000 proteiner, er repræsenteret med protein lokalisering og udtryk data på en offentligt tilgængelig database (www.proteinatlas .org).

Vi afgøres, om plasma fra kræftpatienter med kakeksi, i sammenligning med vægt-stabil cancerpatienter (WS), have særlig ændringer i protein niveauer, som associeret med legemsvægt /fedtmasse tab og /eller andre kliniske funktioner i CC. Til dette formål blev 760 antistoffer (rettet mod 698 unikke proteiner) fra HPA-projektet anvendes på suspension perle arrays (SBA). Denne fremgangsmåde er identificeret et lille sæt af differentielt udtrykte proteiner blandt hvilke Carnosine dipeptidase 1 (CNDP1), et protein, for nylig vist at blive reduceret i metastatisk prostatacancer og glioblastom [19,20], blev bekræftet af sandwich-immunassay til at blive reduceret i CC. Cirkulerende niveauer af CNDP1 blev derfor sammenlignet med kliniske mål for sygdomstilstand.

Materialer og metoder

Patienter

De kliniske karakteristika for kohorte 1 og 2 er nærmere beskrevet i tabel 1. kohorte 1 bestod af 59 forsøgspersoner med mistanke gastrointestinal cancer, 43 mænd og 16 kvinder, hvoraf 26 har i vid udstrækning blevet beskrevet andetsteds [21]. Tredive-to patienter opfyldte kriterierne for kakeksi, dvs. ufrivilligt vægttab på over fem procent af sædvanligt kropsvægt i de seneste tre måneder eller ti procent i de forudgående seks måneder [21]. Tyve-syv rapporterede ingen signifikant vægttab og blev defineret som vægt-stabil (WS). De CC patienter blev diagnosticeret med adenocarcinom i den gastriske område dvs Cardia /ventrikel (n = 3), kolon (n = 2, hvoraf den ene med levermetastaser), bugspytkirtlen (n = 11), spiserør (n = 9, ud af hvoraf 4 med pladecellecarcinom) og cholangiocarcinom (n = 1). WS patienter blev diagnosticeret med adenocarcinom i spiserøret (n = 4), gastrisk område (n = 2), colon (n = 7, alle med levermetastaser), pancreas (n = 8) eller cholangiocarcinom (n = 1). Elleve forsøgspersoner (seks i CC og fem i WS-gruppen), præoperativt bestemt til at have en ondartet sygdom, blev postoperativt vist sig at have en ikke-tumor relateret diagnose. I CC gruppen den endelige diagnose var godartede pancreas cyster (n = 1), cholecystitis (n = 2), dysplasi i spiserøret (n = 1) og kronisk pancreatitis (n = 2). I WS gruppe de endelige diagnoser var cholecystitis (n = 1) og kronisk pancreatitis (n = 4). Som beskrevet i Resultater, selv om disse emner blev inkluderet i den samlede analyse, udeladelse af disse personer ikke har nogen større indflydelse på sammenhængen mellem CNDP1 og forskellige kliniske parametre. Kohorte 2 bestod af 93 patienter diagnosticeret med inoperabel duktalt pancreas carcinom. Disse prøver blev udvalgt fra en biobank indsamlet under en tidligere beskrevet [22] palliativ pleje program på ambulatoriet for Institut for Kirurgi, Sahlgrenska Universitetshospital mellem 1993 og 2005. Kun patienter, der blev bedømt rimeligt fysisk fit indgik i foreliggende undersøgelse. Ingen af ​​patienterne havde tegn på åbenlys diabetes eller andre yderligere kræftdiagnose eller alvorlig sygdom.

Etik Statement

Etiske godkendelser for undersøgelserne blev indhentet fra de regionale bestyrelser etik ( i Stockholm og Gøteborg, henholdsvis) forud for begyndelsen af ​​undersøgelsen, og alle patienter gav deres underskrevet informeret samtykke. Undersøgelsen blev udført i fuld overensstemmelse med udtalelserne i Helsinki-deklarationen.

Klinisk undersøgelse

I kohorte 1, patienterne kom til laboratoriet efter en nats faste. Bortset fra at måle højde og vægt, blev kropssammensætning bestemt af bioimpedans hjælp af en QuadScan 4000 (Bodystat Ltd, Isle of Man, Britiske Øer). Indirekte kalorimetri at bestemme hvile energiforbrug (REE) og respiratoriske kvotient (RQ) blev udført ved hjælp Deltatrac (Datex-Engströms, Helsinki, Finland). Den ernæringsmæssige status blev vurderet ved hjælp af et standardiseret spørgeskema for onkologi betegnes Patient-Genereret subjektive Global Assessment (PG-SGA) [23]. En venøs blodprøve blev anvendt til bestemmelse af cirkulerende faktorer. Kort fortalt blev 20 ml veneblod fra hver donor og koldt centrifugeret til opnåelse plasma som derefter blev alikvoteret i 2 ml Eppendorf-rør og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Leptin niveauer blev bedømt ved ELISA (RD systemer, Abingdon, UK), mens albumin, transferrin, insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF1) og C-reaktivt protein (CRP) blev bestemt ved akkrediteret rutinemæssige kemi laboratorium Karolinska University Hospital . Plasma glycerol blev bestemt ved bioluminescens som beskrevet [24] ved brug af heparin-plasma, prøver blev kørt i duplikater (2×25 pi) og gennemsnit blev korrigeret for total fedtmasse (i kg) som tidligere beskrevet [21]. Forholdet mellem glycerol til den samlede kropsfedt vægt blev betragtet et indeks for

in vivo

lipolyse [21]. Motiver i kohorte 2 blev undersøgt som tidligere [11,22] beskrevet. Kort fortalt blev serum og plasma målinger udført af akkrediterede rutinemæssige kemi laboratorium Sahlgrenska Universitetshospital bortset leptin, som blev fastlagt inhouse af RIA (Linco Research Inc.). Krop sammensætning blev målt ved DXA-skanning (DXA) med en LUNAR DPX-L-scanner (Scanexport Medical, Helsingborg, Sverige). Hele kroppen scanninger blev opnået i hurtig scanning. Kropsfedt og mager kropsmasse blev analyseret ved hjælp af den udvidede forskning tilstanden af ​​LUNAR DPX-L-software (v1.31). REE og fedt oxidation blev målt ved indirekte kalorimetri i morgentimerne efter en nats faste hjælp Deltatrac (Datex-Engströms, Helsinki, Finland). Den korte formular sundhed spørgeskema SF-36 (www.sf-36.org/tools/sf36.shtml) blev anvendt til at måle livskvaliteten i henhold til fysisk funktion (PF), kropslig smerte (BP), rolle-fysisk (RP ), generelt helbred (GH), resuméet fysiske komponent (PCS), vitalitet (VT), social funktion (SF), rolle-emotionelle (RE), mental sundhed (MH) og resuméet mentale komponent (MCS).

antistoffer

Alle antistoffer udnyttes i den indledende screening og profilering stammer fra ressourcerne i affinitetsreagenser genereres inden det humane protein Atlas (www.proteinatals.org). Protokoller for antigen udvælgelse, kloning, ekspression, oprensning og immunisering af kaniner, efterfulgt af affinitetsrensning til opnåelse monospecifikke polyklonale antistoffer, og deres karakterisering med western blots og antigen- mikroarrays blev anvendt som tidligere [25] beskrevne. Alle proteinfragmenter anvendt til immunisering blev fremstillet med en His6-albumin-bindende protein-tag og et målprotein del af 80-120 aminosyrer. Antistofferne blev samlet i sæt af 380 af praktiske eksperimentelle grunde og to sådanne sæt blev udnyttet. Inklusionskriterierne var kun baseret på kvalitetssikring og tekniske parametre som positiv validering på protein microarrays og inden for en bred panel af væv i immunhistokemi, samt koncentration af antigen-renset polyklonale antistoffer. Ud over dette, blev der ikke overvejelser gjort med hensyn annotation eller funktion af de målrettede proteiner. Den endelige opgørelse var drevet af hvorpå antistoffer tilfældigvis blev produceret og valideret på tidspunktet for udvælgelsen.

Antistof suspension perle arrays

Antistoffer blev koblet til farvekodede magnetiske perler (MagPlex mikrosfærer, Luminex Corp .) ifølge producentens protokol og som beskrevet tidligere [20]. Koblingseffektiviteten for hvert antistof blev bestemt via R-phycoerythrin-mærket anti-kanin-IgG-antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories). En 384-plex perle blanding blev skabt med 380 antigen-renset polyklonale HPA antistoffer og fire perle identiteter anvendt som kontroller. Sidstnævnte bestod af IgG fra et ikke-immuniserede kanin og antistof-fri buffer som negative kontroller, mens anti-albumin og anti-humane IgG-antistoffer (Dako) blev betragtet som positive kontroller. Blandingen indeholdt lige store mængder af perler, hvor hver population af en distinkt farve-koden blev der bærer en bestemt antistof. Plasmaprøver blev mærket og analyseret i overensstemmelse med tidligere undersøgelser med mindre ændringer. De prøveplader (Abgene) blev centrifugeret (2 minutter ved 2.000 rpm), og 3 pi af hver prøve blev tilsat til 22 pi sterilfiltreret PBS med en væskehåndteringsudstyr (SELMA, Cybio). N-hydroxysuccinimidylester af biotinoyl tetraoxapentadecanoic syre (Pierce) blev derefter tilsat ved ti gange molært overskud til opnåelse af en samlet 01:10 prøveopløsning, efterfulgt af en 2-timers inkubation ved 4 ° C i en mikrotiterplade rysteapparat (Thermomixer, Eppendorf) . Reaktionen blev standset ved tilsætning af et 250-fold molært overskud af Tris-HCI, pH 8,0 i løbet af biotin og inkuberet i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur (RT) før en endelig opbevaring ved -20 ° C. Alle prøver blev efterfølgende anvendt uden at fjerne ikke-inkorporeret biotin og fortyndet 1:50 i en assaybuffer bestående af 0,5% (vægt /volumen) polyvinylalkohol og 0,8% (w /v) polyvinylpyrrolidon (Sigma) i 0,1% casein i PBS suppleret med 0,5 mg /ml kanin IgG (Bethyl Laboratories). Prøverne blev varmebehandlet i en thermocycler i 30 min ved 56 ° C og 10 minutter ved 23 ° C. Derefter blev 45 pi tilsat til 5 pi bead blandinger i en halv-område fladbundet plade med 96 brønde (Greiner), og inkubation foregik natten over på en orbitalryster ved 650rpm ved stuetemperatur. Perlerne vaskedes i brønde med 3 x 100 pi PBST (1 PBS, pH 7,4, 0,05% Tween 20) på magnet bruger pladevasker (EL406, BioTek) efterfulgt af 10 min fiksering med 50 pi 0,4% paraformaldehyd i PBS. Perlerne blev vasket igen før 50 pi 0,5 pg /ml R-phycoerythrin-mærket streptavidin (Invitrogen) i PBST blev tilsat og inkuberet i 20 min. Endelig blev perlerne vasket og målt i 100 ul PBST hjælp af en dedikeret instrument (FlexMap3D, Luminex Corp.).

Sandwich Immunoassay

Bead-baserede sandwich immunoassays blev udført som beskrevet tidligere [26 ]. To forskellige perle assays blev skabt, en indeholdende flere mono- og polyklonale antistoffer rettet mod CNDP1 samt kontrol proteiner [26], mens den anden indeholdt en antistof (HPA008933) rettet mod CNDP1 samt kontroller. I begge tilfælde BAF2489 (R 0,05. I opdagelsen kohorten blev ingen magt beregning udføres. Statistiske beregninger blev udført ved hjælp af standard software-pakker.

Resultater

Kliniske karakteristika af opdagelsen kohorte

I kohorte 1, CC og WS emner var af tilsvarende alder og køn fordeling selv om begge undergrupper bestod overvejende af mænd (tabel 1). Som forventet rapporteret CC patienter mere udtalt vægttab og vises tegn på katabolisme som det fremgår af lavere BMI, lavere plasma albumin og transferrin niveauer samt dårligere ernæringstilstand demonstreret ved højere PG-SGA scoringer. Det vægttab observeret i kakektiske gruppe skyldes primært tab af fedtmasse, eftersom muskelmassen (LBM) var ens i de to grupper. I konkordans med tidligere offentliggjorte data, de kakektiske emner vises nedre respiratoriske kvotient (RQ), et indirekte mål for fedtsyre oxidation, samt tegn på øget

in vivo

lipolysen fremgår af markant forhøjede plasma glycerol niveauer (korrigeret for total fedtmasse). Tilsammen den kakektiske gruppe i kohorte 1 vises primært WAT massetab samt alle de klassiske funktioner og kliniske kendetegn for forstyrret lipidmetabolismen tidligere rapporteret i CC.

Affinity proteomisk analyse af cirkulerende faktorer

for at identificere cirkulerende faktorer i forbindelse med CC, blev plasmaprøver fra kohorte 1 analyseret af proteomisk profilering hjælp suspension perle arrays (SBA, detaljer om antistoffet udvælgelsesprocessen er beskrevet i afsnittet Metoder). Ud af de ~ 700 screenede proteiner, seks viste signifikante forskelle mellem CC og WS-grupper; tre var lavere; (CNPD1, APOA4, DACH1), mens tre var højere (BCI3 NARS2, ATP13A4) i CC fag (tabel 2). DACH1 er en transkriptionsfaktor, BCI3 er en transkriptionel co-aktivator, der CNDP1, NARS2, ATP13A4 foreslåede enzymer og APOA4 er et lipoprotein. CNDP1 og APOA4 er kommenteret som udskilles ekstracellulære faktorer, mens de resterende fire er intracellulære proteiner. Endvidere CNDP1 og APOA4 er blevet vist, skal ændres i plasma /serum fra cancerpatienter. Således er der rapporteret reduceret CNDP1 niveauer i forskellige aggressive kræftformer [19,20], mens APOA4 har vist sig at blive forøget i pædiatriske former for høj risiko akut leukæmi [27], men lavere hos voksne kvinder med kræft i æggestokkene [28,29] . Vores undersøgelser blev derfor fokuseret på CNDP1 og APOA4 hvor det første skridt var at validere vores SBA resultater efter sandwich-immunassay (SIA). Mens reduktionen i APOA4 ikke kunne bekræftes af SIA (S1 Fig, p = 0,21), blev CNDP1 reduceret i CC til en sammenlignelig grad i SBA (Fig 1A) og SIA (Fig 1B). Desuden blev de individuelle CNDP1 værdier opnået ved hjælp af SBA eller SIA højt korreleret (Fig 1C, ρ = 0,78 ved Spearman rang korrelation, s 0,001) og pålideligheden af ​​sidstnævnte assay blev yderligere bekræftet af to uafhængige bæredygtighedsvurderinger ved hjælp af forskellige antistoffer, som afslørede fremragende intra- og inter-assay korrelationer (vifte af ρ = 0,93-0,99, grafer ikke vist). CNDP1 niveauer målt ved SIA var ikke forbundet med hverken alder eller køn (Fig 1D og 1E, henholdsvis).

Registrerede protein niveauer er vist for A. skærmen ved hjælp af Sandwich Bead Arrays (SBA) og B. validering af Sandwich Immunoassays (SIA) og udtrykt som gennemsnit intensitet fluorescens (MIF). C. Der var en fremragende korrelation mellem resultater opnået ved SBA og SIA. CNPD1 niveauer målt ved SIA blev ikke påvirket af D. alder eller E. køn. F. Fordeling af cirkulerende CNDP1 koncentrationer bestemmes af SIA i Kohorte 2. WS = Vægt stabil, CC = Cancer kakeksi. P- og rho-værdier er angivet.

CNDP1 niveauer korrelerer negativt med faktorer i forbindelse med CC

Cirkulerende CNDP1 niveauer blev sammenlignet med forskellige kliniske parametre i kohorte 1 (tabel 3). Der var positive relationer med BMI, fedtmasse (udtrykt i procent eller absolutte værdier) samt med cirkulerende niveauer af albumin, transferrin og IGF1. Omvendt CNPD1 var negativt associeret med procent vægttab, PG-SGA score og

in vivo

lipolyse (udtrykt som P-glycerol /fedtmasse kg). Foreningerne mellem CNDP1 og BMI, fedtmasse (kg), procent vægttab, serum-IGF1 /transferrin og

in vivo

lipolyse forblev statistisk signifikant efter udelukkelse af de elleve emner, der blev diagnosticeret med ikke-malign sygdom indlæg -surgery.

Reduceret CNDP1 niveauer er forbundet med dårlig prognose i en validering kohorte

SBA og SIA resultater blev opnået i en forholdsvis lille kohorte, diagnosticeret med forskellige gastrointestinale kræftformer, og hvor ingen udfald data er tilgængelige. For at validere, men også til bedre at definere sammenhængen mellem reducerede CNDP1 niveauer og prognose, cirkulerende CNDP1 blev bestemt ved SIA i en separat, mere homogen, validering kohorte herunder kun emner med fremskreden kræft i bugspytkirtlen (Kohorte 2, tabel 1 og Fig 1F) . Hos disse patienter blev CNDP1 værdier negativt forbundet med procent vægttab og foranstaltninger af fedt oxidation, mens der var et positivt forhold til plasma albumin, IGF1 og fysisk helbredsrelateret livskvalitet foranstaltninger (SF-36) (tabel 4). På trods af en manglende sammenhæng mellem CNDP1 niveauer og etablerede tumormarkører (CEA, CA 125 og CA19-9), var der en signifikant positiv sammenhæng mellem CNDP1 og overlevelse (målt som dagen for overlevelse efter diagnose). I modsætning til resultaterne i kohorte 1, var der ingen sammenhæng mellem CNDP1 og BMI, total fedt masse eller

in vivo

lipolyse.

Diskussion

Til vores viden, har det cirkulerende proteom i CC ikke blevet karakteriseret før. Ved hjælp af vores tidligere beskrevet antistof suspension bead array-teknologi [30], udførte vi en screening af ca. 700 proteiner. Vi fandt, at kun et begrænset sæt faktorer, svarende til mindre end 1% af de screenede proteiner, viste signifikante differentiel plasmaniveauer i CC-patienter sammenlignet med vægt-stabil cancerpatienter. Dette kunne muligvis afhænge af det faktum, at de emner i denne screening kohorte bestod af nydiagnosticerede kræftpatienter og blev analyseret på et tidligt stadium af CC eller at faktisk få cirkulerende proteiner associerer med CC. Det er også muligt, at vi kan have overset nogle relevante proteiner på grund af det faktum, at mange signaler i en proteomisk skærm kan være i støjen rækkevidde og /eller at skærmen inkluderet antistoffer rettet mod kun et begrænset sæt af proteiner. Blandt de differentielt udtrykte proteiner, har fire faktorer (CNDP1, APOA4, DACH1 og BCI3) tidligere blevet undersøgt i forskellige aspekter af kræft, men kun APOA4 og CNDP1 udgør udskilte proteiner. De to sidstnævnte er tidligere blevet undersøgt i cirkulationen af ​​kræft fag, om end ikke i forbindelse med kakeksi. Sandwich immunassay bekræftede lavere plasmaniveauer af CNDP1 i CC og lave CNDP1 der er forbundet med en række foranstaltninger af CC. De vigtigste resultater kan valideres i en separat kohorte demonstrerer, der reducerede CNDP1 korreleret med vægttab, mere avancerede sygdomstilstande, og nedsat overlevelse. Ganske vist nogle af de foreninger afveg mellem de to kohorter. Medens BMI, fedtmasse og

in vivo

lipolysen korreleret med cirkulerende CNDP1 i kohorte 1, disse relationer var ikke signifikant i Cohort 2. Dette kunne muligvis afhænge af den omstændighed, at fag i kohorte 2 havde en mere avanceret sygdomsstadium.

Elleve af patienterne i kohorten 1 blev i sidste ende diagnosticeret med ikke-malign sygdom. Vi anser ikke dette for at have nogen væsentlig indflydelse på vores resultater vedrørende CNDP1, delvist baseret på det faktum, at udelade disse personer fra analyserne ikke havde nogen væsentlig indflydelse på de betydelige foreninger med forskellige kliniske parametre. Vigtigere er imidlertid, lignende korrelationer med CNDP1 blev fundet i kohorte 2, som kun bestod af personer med bekræftet bugspytkirtelkræft.

CNDP1

gen koder for et 57 kDa glycoprotein af M20 metallopeptidase familien. Hos mennesker er det primært udtrykkes i centralnervesystemet og (i mindre grad) i leveren, hvorfra det udskilles som en homodimer. [31]. Selv sekvensidentiteten af ​​

CNDP1

er stærkt konserveret mellem arter, er det ikke-humane gen næsten udelukkende udtrykkes i nyren, men fordi det mangler et N-terminalt signalpeptid det ikke påvises i omløb [31] . Funktionen af ​​CNDP1 er ikke fuldt defineret, men den viser carboxy-og dipeptidase aktivitet og dets vigtigste substrater synes at være den dipeptider carnosin (β-alanyl-histidin) og homocarnosine (γ-aminobutyryl-L-histidin) [31,32,33 ]. Carnosin er primært til stede i muskler og hjernevæv og er blevet impliceret i flere patofysiologiske processer, herunder en beskyttende rolle i atheroscleroisis [34], leversteatose [35], diabetisk nefropati [36,37,38,39] og i cancer [40] , hvor dets antiproliferative egenskaber på forskellige maligne celler har ansporet særlig interesse [41,42,43]. er fundet lave CNDP1 niveauer at være forbundet med lymfeknudemetastaser i en stor kohorte af prostatacancerpatienter [20]. Endvidere en nylig proteomisk analyse under anvendelse af en ikke-immun-baserede (væskekromatografi-tandem-massespektrometri) tilgang foreslået, at CNDP1 er en af ​​adskillige proteiner nedreguleret i plasma af ti patienter med glioblastom sammenlignet med raske kontroller [19]. Det er derfor muligt, at reducerede CNDP1 niveauer kan være en fællesnævner i flere mere aggressive kræftformer. Ganske vist kan det virke ulogisk, at Carnosine foreslås at have anti-tumor effekt, mens reducerede niveauer af en Carnosine enzym associeret med fremskreden kræft stadier. Dog kunne det hypotese, at CNDP1 nedregulering, hvilket resulterer i øgede Carnosine niveauer, kan udgøre en kompensatorisk /defensiv ordning aktiveres i forhold med høj celle omsætning. Hvorvidt plasma Carnosine niveauer er ændret i kræft er ikke kendt, og vi havde ikke tilstrækkeligt materiale til at bestemme forholdet mellem CNDP1 og Carnosine i kredsløbet. Derfor er den uklare funktion CNDP1

in vivo

, samt udformningen af ​​vores undersøgelse, ikke tillader os at etablere en årsagssammenhæng mellem reducerede CNDP1 niveauer og CC.

De mekanismer styrer de cirkulerende niveauer af CNDP1 er ikke kendt, og vi kan ikke udelukke, at vævet /cellulære kilde CNDP1 kan variere mellem raske forsøgspersoner og kræftpatienter. Endvidere hvorvidt CNDP1 reduktion forekommer i andre former for vægttab er ikke kendt. Som vi tidligere har genereret globale transkriptom data fra WAT ​​af kohorte 1 [44], vi undersøgte, om

CNDP1

genekspression var påvirket af CC. At der ikke forskelle blev observeret (data ikke vist) tyder på, at ændringer i cirkulerende CNDP1 observeret i denne undersøgelse, kan ikke forklares med ændret

CNDP1

udtryk i WAT. En mere omfattende kortlægning af CNDP1 ekspression i andre betingelser er nødvendigt for at belyse, hvordan og i hvilke væv, organ vægttab primært virkninger på genekspression og proteinsekretion. En advarsel nævnt ovenfor, hvilket udelukker mekanistiske undersøgelser af CNDP1 i dyremodeller, er, at den murine ortholog ikke secerneres ind i kredsløbet. Selv om SIA udviklet i nærværende arbejde skal teoretisk genkende musen CNDP1 (baseret på sekvenshomologi) vi ikke var i stand til at observere nogen påviselige niveauer i serum /plasma af flere forskellige musestammer (data ikke vist).

CNDP1 gennemgår posttranslationelle modifikationer herunder homodimerisering og glycosylering. Det er på nuværende uklart, hvordan glykosylering status påvirker aktivitet og funktionelle rolle CNDP1. Selv om det kan påvirke antistof affinitet, det faktum, at CNDP1 niveauer korreleret kraftigt mellem assays under anvendelse fire forskellige antistoffer, tyder på, at forskelle i glykosylering status er ikke sandsynligt, at forklare de differentierede niveauet i CC og WS grupper.

I konklusion, profilering af ~ 700 cirkulerende proteiner i gastrointestinal cancer viser, at CNDP1 niveauer reduceres i kakeksi og at lave serumkoncentrationer korrelerer med flere CC parametre forbundet med dårligt resultat. Det forhold, at kun et begrænset sæt af plasmaproteiner ændres i CC tyder på, at få cirkulerende faktorer er potentielle CC markører, i det mindste i de tidlige faser af sygdommen. Hvorvidt CNDP1 har kan ikke etableres i det nuværende pilotundersøgelsen en prognostisk værdi og skal valideres i meget større kohorter. Desuden den primære væv /cellulære kilde, de mekanismer, der styrer sine cirkulerende niveauer samt den funktionelle rolle CNDP1 fortsat uklare, og vil være i fokus i fremtidige studier.

Støtte Information

S1 Fig. . APOA4 niveauer i validering assay

Registrerede protein niveauer er vist for APOA4 hjælp sandwich immunoassay og udtrykt som betyder intensitet fluorescens (MIF)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123566.s001

(EPS)

Tak

Vi er taknemmelige for Kerstin Wahlen, Eva Sjölin, Gaby Åström, Yvonne Widlund, Katarina Hertel og Britt-Marie Leijonhufvud for deres kvalificerede tekniske og klinisk assistance.