PLoS ONE: Kritisk rolle Spns2, en Sphingosin-1-fosfat Transporter, i Lung Cancer Cell Overlevelse og Migration

Abstrakt

sphingosin-1-fosfat (S1P) transporter Spns2 regulerer myokardie forløber migration i zebrafisk og lymfocyt handel med mus. Imidlertid har sin funktion i cancer ikke undersøgt. Vi viser her, at ektopisk Spns2 ekspression induceret apoptose og dens knockdown forbedret cellemigrering i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) celler. Metabolisk, Spns2 ekspression øgede ekstracellulære S1P niveau, mens dens knockdown den intracellulære. Farmakologisk hæmning af S1P syntese afskaffet augmented cellemigration medieret af Spns2 knockdown, hvilket indikerer, at intracellulær S1P spiller en central rolle i denne proces. Cell signalering undersøgelser indikerede, at Spns2 udtryk forringet GSK-3β og Stat3 medieret pro-overlevelse veje. Omvendt blev disse veje aktiveres af Spns2 knockdown, hvilket forklarer den øgede celle migration, da de er også afgørende for migration. Ændringer af Spns2 fandtes at påvirke flere enzymer involveret i S1P metabolisme, herunder sphingosin kinaser, S1P phosphataser og S1P lyase 1. Genetisk blev fundet Spns2 mRNA-niveau, der skal reduceres i fremskreden lungecancer (LC) patienter som kvantificeret ved hjælp af en lille skalere qPCR array. Disse data viser for første gang, at Spns2 spiller nøgleroller i regulering af cellulære funktioner i NSCLC celler, og at dens nedregulering er en potentiel risikofaktor for LC

Henvisning:. Bradley E, Dasgupta S, Jiang X, Zhao X, Zhu G, han Q, et al. (2014) Kritisk rolle Spns2, en Sphingosin-1-fosfat Transporter, i Lung Cancer Cell Survival og Migration. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10,1371 /journal.pone.0110119

Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA

Modtaget: Juni 17, 2014, Accepteret: September 8, 2014; Udgivet: 20 okt 2014

Copyright: © 2014 Bradley et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er i kroppen og støtte Information filer af papiret

Finansiering:. Dette projekt er støttet af en Intramural bevilling fra Georgia Regents University og en SDG pris fra American Heart Association (GW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungecancer (LC) er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA og resten af ​​verden [1], [2]. I 2012 er der mere end 220.000 nye tilfælde og mere end 160.000 dødsfald i USA alene [1], [3], [4]. LC er et bemærkelsesværdigt heterogen sygdom. De to store former er ikke-småcellet LC (NSCLC) og småcellet LC, blandt hvilke NSCLC er den mest almindelige form, der tegner sig for omkring 85% af nydiagnosticerede tilfælde [1], [4].

Genetiske abnormiteter har knyttet flere gener og signalveje til NSCLC, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie, signal transducer og aktivator af transkription 3 (Stat3), og phosphoinositid 3-kinase

– Salg Akt-mTOR veje [ ,,,0],1], [2], [4]. Disse opdagelser har ført til entydigt målrettede terapier med specifik inhibitor lægemidler såsom erlotinib og gefitinib for mutationer i EGFR [5] eller crizotinib til gen-translokation resulterer i EML4-ALK onkogen [6]. Epigenetiske variationer er også knyttet til NSCLC [7], [8]. Selv om dens diagnose og behandling er under hastig udvikling, meningsfulde forbedringer i resultaterne for de fleste NSCLC patienter er stadig undvigende [1], [3]. Mange patienter tilbagefald og danner mere aggressive metastatiske tumorer [9]. Således er der et presserende behov for en dybere forståelse af oprindelse og de molekylære mekanismer i metastaser af sygdommen for at forbedre forebyggelse og behandling.

Sphingosin 1-fosfat (S1P) er et potent bioaktiv signalering molekyle, der spiller afgørende roller i forskellige fysiologiske og patologiske processer, såsom immunitet og cancer [10], [11], [12], [13]. Det fremmer kræft ved at regulere celledeling /overlevelse, migration, angiogenese, og lymfangiogenese [10], [14], [15]. Et af de enzymer, der genererer S1P, sphingosin kinase 1 (SphK1) (fig. 1A), betragtes som et onkogent enzym, hvis aktivitet kan stimuleres af en lang række agonister, fx hormoner og vækstfaktorer [16], [17]. Omvendt enzymet som nedbryder S1P, S1P lyase 1 (SGPL1) (fig. 1A), er nedreguleret i prostatacancer [17]. Silencing af SGPL1 øger cellernes overlevelse; og håndhæves SGPL1 udtryk sensibiliserer celle til bestråling eller kemoterapi [17]. Desuden er mange aspekter af S1P signalveje nært beslægtet med tumorgenese (fig. 1A) [10], [18]. Ekstracellulær S1P udøver det meste af sin funktion gennem fem celleoverflade G-protein-koblede receptorer S1P1-S1P5 [10]. Det stimulerer forskellige signaltransduktionsveje i forskellige celletyper, samt inden for den samme celle, afhængigt af receptorerne udtrykkes. For eksempel er S1P1 udelukkende koblet

via

Gi-protein for at aktivere Ras, mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), PI3K /Akt, og phospholipase C pathways [10], [19]. Den intracellulære S1P, på den anden side fremmer udviklingen af ​​kræft i en receptor-uafhængig måde [11], [12], ved enten at mediere calcium frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum, eller ved at interagere med dens intracellulære mål, såsom HDAC og TNF receptor associeret faktor 2 (TRAF2) [20]. Endnu vigtigere er S1P elevation været inddraget som en risikofaktor for LC i en epidemiologisk undersøgelse [21]

(A), Skematisk afbildning af S1P metabolisme og funktion, SGPP, S1P phosphatase.; SphK, sphingosin kinase; SGPL, S1P lyase; ært, phosphoethanolamin. (B), Western blot-analyse af Spns2-EGFP-ekspression detekteres ved et anti-GFP-antistof. β-actin (Actin) blev anvendt som en loading kontrol. A549-celler blev transficeret med Spns2-EGFP og cellelysater indsamlet 48 timer senere. Molekylvægten af ​​Spns2-GFP er omkring 84 kD (58 + 26; pil). (C), Spns2 ekspression øget ekstracellulær niveau af S1P, sphingosin (Sph) og dihydrosphingosin (dhSph). Cellerne blev ændret til medier med delipiderede FBS 24 timer efter transfektion. Yderligere 24 timer senere blev medierne opsamlet og centrifugeret, og supernatanten analyseret ved lipidomics. (D), Time Lapse billeder af Spns2 positive celler. A549-celler blev transficeret med Spns2-EGFP som i A. 12-16 timer senere blev celler anbragt i et klimakammer, som bevarer 37 ° C og 5% CO

2 og tid bortfalder billeder taget ved angivne tidspunkter. Scale bar er 10 um. (E), Konfokal laser scan billeder af celler immuno-farvet med aktiv (spaltet) caspase 3 (Casp3). A549-celler blev transient transficeret, fikseret og farvet med et antistof mod spaltet Casp3. Scale bar er 20 um.

S1P genereres intracellulært ved SphKs og dets cellulære niveau vedligeholdes af en finjusteret ligevægt mellem produktion, konvertering, nedbrydning, og udførsel (fig. 1A). S1P eksporteres ud af cellerne ved transportproteiner (Fig. 1A). Adskillige ATP-bindende kassette (ABC) familiemedlemmer, såsom ABCA1, ABCC1, og ABCG1 er blevet foreslået til at transportere S1P baseret på observationer, at deres knockdown eller farmakologisk hæmning fald S1P frigivelse [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Men dette begreb stadig kontroversielt, da S1P udførslen ikke ændres, når disse proteiner eksogent udtrykkes i celler eller slået ud i mus [18], [27], [28]. For nylig gammeljomfru homolog 2 (Spns2), et medlem af den store formidler superfamilien af ​​ikke-ATP-afhængige transportører, har vist sig at transportere S1P både

in vitro

in vivo

[27 ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Mere interessant, selvom reduceret i plasmaet, er S1P niveauer steg i nogle væv, herunder lunge i Spns2 manglende mus [33], hvilket er i overensstemmelse med en tidligere rapport, der viser, at Spns2 udtrykkes mest rigeligt i den humane lunge [18].

Disse tidligere resultater fik os til at hypotesen, at Spns2 er involveret i LC udvikling. Vi har udført gain-of-funktion og tab af funktion eksperimenter i NSCLC celler. Vi har også påvist Spns2 udtryk niveau i LC patientprøver.

Materialer og metoder

Materialer

Antistoffer mod phospho-GSK-3β (Ser 9), GSK-3β, phospho-Stat3, Stat3, kløvet caspase 3, og Survivin var fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA). Antistoffer mod AIF og β-actin var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffet mod LC3B var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoffet mod SphK2 var fra Exalpha Biologicals (Dublin, OH). Den fluorescerende mærkning af inhibitorer af caspaser (FLICA) kit var fra Immunochemical Technologies (Bloomington, MN). SphK inhibitor Ski-1 var fra BioVision (Milpitas, CA). Pan caspaseinhibitor Z-VAD var fra Promega (Madison, WI). PI3K-inhibitoren LY294002 var fra Cayman (Ann Arbor, MI). Og Jak inhibitoren Jaki var fra Millipore (Billerica, MA). Humane LC real time PCR arrays var fra Origene (Rockville, MD).

Metoder

Plasmid kloning.

Menneskelig SPNS2 blev PCR amplificeret fra en BAC ved anvendelse af primere hSpns2forward: AAG CTT ATG TGC CTG GAA TGC GCC TCG, og hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC TTT CAC AGA TGC GGG CGG; og blev subklonet i pGEM Teasy-vektor (Promega, Madison, WI). Fragmentet blev fordøjet brug af enzymer HindIII og Kpnl og klonet ind i pEGFP-N1 vektor (Clontech, Mountain View, CA), hvilket resulterer i pSPNS2-EGFP konstruere. For HA mærkede Spns2 blev primere indeholdende HA-mærket designet. PCR-produktet blev klonet ind pCDNA3.1 (Life Tech., Carlsbad, CA, USA) ligner pSPNS2-EGFP.

Celledyrkning og behandling.

Den humane NSCLC cellelinjer A549 og H1299 (ATCC, Manassas, VA) var generøse gaver fra Dr. Zhonglin Hao, Cancer center, Georgia Regents Universitet. De primære humane brachial epitelceller (HBEpC) var fra ATCC (Manassas, VA). A549-celler og H1299-celler blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Cellgro, Herndon, VA, USA) indeholdende 10% FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, TX) og Pen /Strep (Life Tech.). HBEpC blev opretholdt efter producentens anvisninger. Transfektion af Spns2 siRNA’er blev udført ved enten Lipofectamine 2000 i overensstemmelse med producentens instruktioner (Life Tech.) Eller elektroporeret under anvendelse af et Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).

Direkte celle tid bortfalder billeddannelse, immunocytokemi, og konfokal laser mikroskopi.

levende celler udførtes ifølge tidligere offentliggjorte fremgangsmåder [35], [36], [37], [38]. Kort beskrevet blev celler transficeret med Spns2-GFP. Seksten timer senere blev kulturen sat i en levende celle imaging kammer og fase kontrast mikrografier taget hver 30-60 minutter med et Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY, USA. For immuncytokemi og laser konfokal mikroskopi, den fikserede celler blev immunfarvet med antistoffer, der er anført og billeder taget med et Zeiss LSM510 konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med en to foton argon laser ved 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3), og 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), henholdsvis . LSM 510 Meta 3.2 software blev anvendt til billedoptagelse. Adobe Photoshop CS4 blev anvendt til reduktion og redigering baggrund. Billeder opnået med sekundært antistof kun blev anvendt som negative kontroller repræsenterer baggrunden intensitet i en bestemt laserkanal. Antigen-specifik immunfarvning blev kvantificeret ved at tælle celler, der viste signaler dobbelte eller mere over baggrundsfluorescens.

RNA-ekstraktion, RT-PCR, og qPCR.

RNA blev ekstraheret under anvendelse af TriZol reagens (Invitrogen). Første streng cDNA blev genereret af iScript cDNA-syntese kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Real time qPCR blev udført ved hjælp af SYBR grøn /Rox qPCR Master Mix på en PTC-200 Gradient Cycler udstyret med et kromosomerne 4 kontinuerlig fluorescerende detektor (BioRad). Primerne for qPCR var: menneskelig hSpns2 fremad: TTA CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 omvendt: TGA TCA TGC CCA GGA CAG; hPOLR2A frem: GGGTGGCATCAAATACCCAGA; hPOLR2A omvendt: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA; hSphK1 frem: GGC TGC TGT CAC CCA TGA A, hSphK1reverse: TCA CTC TCT AGG TCC ACA TCA G; hSphK2 frem: AGC GTG GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 omvendt: GAG CAG TGT ACC GAT GCC A; hSGPP1 frem: ATC ATC ATC GGG CTT CAT TTA GC, hSGPP1reverse: GTG CTC CAG GTG TCA AGA GT; hSGPP2 fremad, TCA C CG CAC TCC TCA TCG T, hSGPP2 omvendt: CCG GGT TGG GCT GTA GTA ATC; hSGPL1 frem: FTT AGC ACA GAC CTT CTG ATG T, hSGPL1 omvendt: ACT CCA TGC AAT TAG CTG CCA; hABCA1 frem: TTA AAC GCC CTC ACC AAA GAC, hABCA1reverse: AAA AGC CGC CAT ACC TAA ACT; hABCC1 frem: TTA CTC ATT CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA TTA GGG TCG TGG AT; hABCG1 frem: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GAT GTC ACA GTG; hABCG2 frem: TGA GCC TAC AAC TGG CTT AGA, hABCG2 omvendt:. CCC TGC TTA GAC ATC CTT TTC AG

Cell levedygtighed og celledødsassays

celleproliferation og apoptose blev udført med A549. og H1299-celler transficeret med hSPNS2-EGFP eller HA-Spns2 som tidligere beskrevet [39], [40], [41]. Antallet af levende celler blev målt ved en mikropladelæser ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc, som er baseret på den dehydrogenaseaktivitet i levedygtige celler). Kort fortalt CCK8 opløsning blev tilsat til den behandlede cellekultur, inkuberet i 2-4 timer, og deres absorption ved bølgelængden 450 nm aflæses af en mikropladelæser. Absorptionen ved 450 nm blev korreleret til levende celletal stede i brønden. Den FLICA assay blev udført med Spns2-EGFP plasmid-transficerede A549-celler under anvendelse af sulforhodamin-mærket fluormethyl keton peptidinhibitor (rød) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 48 timer efter transfektion med Spns2-EGFP plasmider blev FLICA reagens tilsat til mediet, og cellerne inkuberet i 1 time ved 37 ° C under 5% CO

2. Cellerne blev vasket en gang med vaskeopløsning og derefter fikseret med 4%

s

-formaldehyde i phosphatbufret saltvand til yderligere analyse ved mikroskopi.

Flowcytometrianalyse.

Spns2 GFP transficerede A549-celler blev opsamlet, fikseret med 4% paraformaldehyd og immuno-mærket med caspase 3-antistof efterfulgt af Alexa Fluor 555 sekundært antistof. De mærkede celler blev analyseret ved en Becton Dickinson FACSCalibur 4-farve analysatorer udstyret med 4 lasere (BD Biosciences, San Jose, CA).

cellemigrering assays.

Cell migration blev målt ved sår healing assays som tidligere offentliggjort [42]. Kort beskrevet blev celler transficeret med Spns2 siRNAs eller scrambled kontrol fra lipofectamin 2000. Celler blev dyrket i 72 timer, på hvilket tidspunkt de var blevet sammenflydende. Et hul på ca. 400 um blev genereret af en pipettespids. Bredden af ​​spalten blev målt på forskellige tidspunkter. For Ski-I behandling, 10 uM Ski-I blev suppleret 24 timer efter siRNA transfektion. Celler blev dyrket i yderligere 48 timer og derefter udføres assayet.

sphingolipid og S1P måling. Salg

Celler transficeret med Spns2 eller Spns2 siRNA blev dyrket i 48 timer og derefter både cellepellets og medier blev opsamlet . Cellepellets blev vasket tre gange med kold PBS. Dyrkningsmedier blev centrifugeret i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse flydende celler og cellerester. S1P niveauer i celler og dyrkningsmedier blev målt til Lipidomics Core fra Medical University of South Carolina (under tilsyn af Dr. Jacek Bielawski) ifølge offentliggjorte protokoller om en ThermoFisher TSQ Quantum tredobbelt kvadrupolmassespektrometer, der opererer i en Multiple Reaction Monitoring (MRM) positiv ionisering funktion ved hjælp modificeret version [43]. Kort fortalt cellepellets eller medier, der svarer til omkring 2-3 × 10

6 celler, blev beriget med de interne (ISS: C

17 basis D-erythro-sphingosin (17CSph), C

17 sphingosin -1-phosphat (17CSph-1P), N-palmitoyl-D-erythro-C

13 sphingosin (13C16-Cer) og heptadecanoyl-D-erythro-sphingosin (C17-Cer)), og ekstraheret med ethylacetat /iso-propanol /vand (60/30/10 vol /vol) opløsningsmiddelsystem. Efter inddampning og rekonstituering i 100 pi methanol prøver blev injiceret på HP1100 /TSQ Quantum LC /MS-system og gradient elueres fra BDS Hypersil C8, 150 x 3,2 mm, 3 um partikelstørrelse-søjle, med 1,0 mM methanolisk ammoniumformiat /2 mM vandig ammoniumformiat mobil fase system. Toppe svarende til målanalytterne og interne standarder blev indsamlet og behandlet under anvendelse af Xcalibur software system. Kvantitativ analyse var baseret på kalibreringskurverne genereret ved at tilsætte en kunstig matrix med de kendte mængder af analysanden syntetiske standarder og et tilsvarende beløb af de interne (ISS). Målanalytten /IS toparealer forhold blev plottet mod analytkoncentrationen. Målanalytten /IS toparealforhold fra prøverne blev tilsvarende normaliseret til deres respektive ISS og sammenlignet med kalibreringskurver under anvendelse af en lineær regressionsmodel. Andre sphingolipider, såsom ceramid og sphingosin, blev også analyseret.

Statistik.

Midler og standardafvigelser blev beregnet af Microsoft Excel. Den statistiske signifikans blev beregnet ved hjælp af en envejs ANOVA og Tukey post hoc test eller gentagen foranstaltning ANOVA med GraphPad Prism. P 0,05 betragtes som signifikant

Resultater

Ektopisk Spns2 udtryk fremkalder celledød i NSCLC celler

For at studere Spns2 funktion i LC, vi brugte NSCLC celler.. Vi forsøgte først at etablere en Spns2-EGFP stabil-udtrykkende A549-cellelinje, men ingen sådan linje blev opnået (data ikke vist). Således vi fokuseret på forbigående ekspression af Spns2. Western blot-analyse under anvendelse af et anti-GFP-antistof viste, at Spns2 blev udtrykt i ~84 kD fusionsprotein (58 kD + 26 kD, pil, fig 1B.). For at sikre, at ektopisk udtrykte Spns2 var funktionelle, målt vi, om det transporterede S1P. Lipidomics data viste, at S1P niveau i dyrkningsmediet blev forøget med 5,6 ± 0,55 gange (fig. 1C), i overensstemmelse med tidligere rapporter [29], [31], [32], [33], [34] og bekræfter, at det transficerede Spns2 var fuldt funktionsdygtig. Interessant nok blev ekstracellulære niveauer af sphingosin (Sph) og dihydrosphingosin (dhsph) også steg med 1,5 og 2,8 fold, (fig. 1C), hvilket indebærer, at Spns2 kunne transportere disse to sphingolipider samt. Forskellige arter af ceramid blev analyseret, men ingen viste signifikant forskel ved sammenligning med kontrol (fig. S1A).

Næste undersøgte vi de cellulære funktioner Spns2 i A549-celler. Levende celler viste, at Spns2 celler gennemgik dramatiske morfologiske ændringer og frigjort fra celle dyrkningsskåle (pile i fig. 1D), hvilket tyder apoptotisk celledød. Således vi immuno-mærkede cellerne med et antistof detektion aktiveret (spaltet) caspase 3 (Casp3) (fig. 1E). Dobbelt-blindet kvantitativ analyse viser, at 34,2 ± 9% af Spns2 positive celler var Casp3 positive (fig. 1E og 2A). Denne induktion af Casp3 blev bekræftet ved Western blot-analyse og flow-cytometri; og blokeret af en pan caspaseinhibitor Z-VAD (fig. 2B, S1B, og S1c). Induktion af Casp3 blev reproduceret ved ekspression af HA-Spns2 som har mindre tag (ikke vist). I overensstemmelse med Casp 3-aktivering, blev den anti-apoptose genet Survivin signifikant reduceret (fig. 2B) [36], [44]. Apoptoseinducerende faktor (AIF) og spaltes LC3B blev også målt, men ingen blev forøget med Spns2 ekspression (fig. 2B), hvilket antyder, at Spns2 ikke inducerer caspase-uafhængig apoptose eller autofagi.

(A), Kvantificering af Casp3 positive celler vist i D. Vehicle (pEGFP) transficerede celler blev anvendt som kontrol (Con). N 100 celler tælles fra tre separate forsøg. (B), Western blot-analyser for celledød markører. A549-celler blev transient transficeret som i A. Cellelysater blev opsamlet og blottet med antistofferne angivet. Vehicle (pEGFP) transficerede celler blev anvendt som en negativ kontrol og Actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), Repræsentative billeder af FLICA farvning af Spns2 positive celler. Levende A549-celler blev inkuberet med FLICA i 1 time 48 timer efter transfektion. Cellerne blev fikseret og mikrografiske billeder taget. Scale bar er 10 um. (D), Kvantificering af FLICA positive celler er vist i C. N 100 celler fra tre separate forsøg blev talt dobbelt blindt. (E), Spns2 ekspression reduceret antal levedygtige celler i A549-celler. Celler blev transficeret som i A. 48 timer senere blev den relative levende celleantal målt ved en CCK-8 kit under anvendelse af en mikropladelæser. N = 4. (F), Spns2 udtryk reduceret celleantal i H1299 celler. Lev H1299 celle nummer blev målt som i I. N = 4. I B, E, H, I, J, fejl søjler repræsenterer SD, *, p 0,05, **, p 0,01

for yderligere at validere, at Spns2 induceret apoptose, vi udførte FLICA (fluorescerende mærket hæmmer af pan caspaser) analyser på levende celler. Figur 2C viser typiske mikrografiske billeder af assayet. Dobbelt-blindet kvantificering viste, at 70 ± 15,9% af Spns2 positive celler var FLICA positive (fig. 2D).

En slutresultatet af celledød er reduktion i den samlede levedygtige celler nummer. Unbiased celletælling under anvendelse af en mikropladelæser (CCK-8) viste, at Spns2 ekspression resulterede i 59 ± 1,2% reduktion af levedygtige A549 celler i 48 timer (Fig. 2e). Disse resultater blev reproduceret i en anden NSCLC cellelinje H1299 (fig. 2F).

Samlet set ovenstående data viser, at ektopisk Spns2 udtryk inducerer caspase-afhængig apoptose i NSCLC celler.

Spns2 udtryk modulerer S1P stofskifte

Vi viste, at Spns2 udtryk transporteres S1P uden for cellerne (fig. 1C). Interessant nok blev de cellulære niveauer af S1P, sphingosin, og forskellige ceramid-arter, der ikke signifikant ændret ved Spns2 ekspression, undtagen dhSph og langkædede ceramid C20:1were steget med ca. 2,0 og 1,4 gange, respektivt (fig. 3A og ikke vist).

(A), havde Spns2 ekspression ikke ændre den intracellulære niveau af S1P. A549 Cellerne blev ændret til medier med delipiderede FBS 24 timer efter transfektion. Yderligere 24 timer senere blev cellerne opsamlet, vasket og lipidniveauer analyseret ved lipidomics. (B), Spns2 ekspression ført til en akut stigning på SphK1 i A549-celler. Celler blev transficeret mRNA opsamles og tidstro QRT-PCR udført for at måle SphK1. (C), Spns2 ekspression ført til en akut stigning på SphK2. A549-celler blev behandlet som i B, bortset fra at QRT-PCR udført for at måle SphK2. (D), Spns2 ekspression førte til reduktion af SGPP1 i A549-celler. Celler blev behandlet som i B, bortset fra at QRT-PCR udført for at måle SGPP1. (E), Spns2 ekspression reduceret S1P-receptorer. Cellerne blev behandlet som i B, bortset fra at QRT-PCR udført for at måle S1P1, S1P2, og S1P3. N = 3. Fejl søjler repræsenterer SD. *, P 0,05, **, p 0,01. Data, blev normaliseret til GAPDH.

For at afgrænse sin underliggende metaboliske mekanisme, vi analyserede de vigtigste enzymer i sphingolipid metabolisme ved real time kvantitativ PCR (qPCR). Både SphK1 og SphK2 mRNA var signifikant forhøjet inden for 24 timer Spns2 transfektion, og vendte tilbage til det normale niveau i 48 timer (fig. 3B og 3C). Forhøjelse af SphK2 ekspression blev bekræftet ved Western blot-analyse, bortset fra at dens proteinniveauet forblev på et relativt højt niveau, selv 48 timer efter Spns2 transfektion (fig. S1D). Dette er rimeligt, da proteiner normalt tager længere tid at nedbryde end mRNA. S1P phosphatase 1 (SGPP1), det enzym, der dephosphorylerer S1P, blev dramatisk reduceret til 8,5% af kontrolniveauet inden for 24 timer, og forblev lave indtil 48 timer efter transfektion (fig. 3D og S1E). SGPP2 og S1P lyase 1 (SGPL1) blev ikke signifikant påvirket af Spns2 udtryk (fig. S1E-S1F). Disse data indikerer, at celler ændrer ekspressionsniveauerne af flere nøgleenzymer for at kompensere for S1P udførsel medieret af Spns2 ekspression, herunder fremme generation (stigning i SphKs) samt standsning konvertering (reduktion i SGPP1).

Spns2 ekspression fører til reduktion af S1P-receptorer og flere pro-overlevelse pathways

Som nævnt tidligere, S1P er generelt en pro-overlevelsesfaktor. For at forstå hvorfor apoptose blev induceret, når det ekstracellulære S1P blev forøget efter Spns2 transfektion, vi har registreret niveauerne af S1P-receptorer og fandt, at mRNA-niveauer af receptorer S1P1, S1P2, og S1P3 var alle signifikant nedreguleret efter Spns2 ekspression (fig. 3E ).

for yderligere at bekræfte denne observation, vi bestemt cellen signalveje nedstrøms for disse S1P receptorer. Spns2 udtryk førte til drastiske reduktioner af phospho-GSK-3β (pGSK-3β, serin 9) i både A549 og H1299 celler (fig. 4A og 4B). For at validere denne observation, vi analyseret GSK-3β s upstream aktivator Akt [35], [45]. 4A og 4B viste, at Pakt niveauet blev nedsat med Spns2 ekspression, hvilket indikerer, at Spns2 forringer PI3K /Akt pathway. Jak /Stat3 vej, en anden signalvej neden for S1P-receptorer, spiller afgørende roller i celle overlevelse, migration og immunrespons [46], [47]. Vi afgøres, om Spns2 påvirker denne vej ved at måle Stat3 aktivitet. Western blot analyserne viste, at phospho-Stat3 (pStat3) niveauer spænder blev reduceret med Spns2 ekspression i begge cellelinjer (fig. 4A og 4B). Casp3 blev aktiveret ved Spns2 i H1299 celler, som er i overensstemmelse med oplysningerne fra A549-celler (fig. 4B). Dernæst vi immuno-mærket Spns2-EGFP transficerede celler med antistoffer mod pGSK-3β og pStat3 og fandt, at deres fluorescenssignaler blev signifikant reduceret i alle celler i den samme kultur, hvad enten Spns2 positiv eller ej, sammenlignet med kontrolpatienter GFP transficerede celler ( con) (fig. 4C og 4D). Dette skyldes sandsynligvis ekstracellulær akkumulering af sphingolipider, såsom Sph. Mere interessant var det fluorescerende signal for pGSK-3β yderligere reduceret i Spns2-GFP-celler end ikke-transficerede celler (pile i fig. 4C). Disse data bekræfter, at disse pro-overlevelse veje blev kompromitteret, da Spns2 blev ektopisk udtrykt.

(A), Western blot-analyser på A549 celleprøver. A549-celler blev transient transficeret og lysater opsamlet 24 og 48 timer senere og blottet med antistofferne angivet. pGSK, phospho-GSK-3β; tGSK, total GSK-3β; Pakt, phospho-Akt; pStat3, phospho-Stat3; tStat3, total Stat3; Actin blev anvendt som en loading kontrol. (B), Western blot-analyser på H1299 celleprøver. H1299-celler blev transient transficeret som nævnt tidligere. Cellelysater blev opsamlet 48 timer senere og blottet med antistofferne angivet. (C), Konfokal laser scan billeder af celler farvet for pGSK-3β. A549-celler blev transficeret med Spns2-GFP og dækglas opsamlet efter 48 timer. (D), Konfokal laser scan billeder af A549-celler farvet for pStat3. Celler blev fremstillet som i C.

Spns2 Knockdown stiger intracellulær S1P niveau

Ovenstående data viser, at Spns2 regulerer S1P metabolisme og dens ektopisk udtryk fører til apoptose i NSCLC celler. For yderligere at dissekere Spns2 rolle i LC, vi bankede ned Spns2 af siRNA. Figur 5A og 5B viser, at siRNA Spns2i-A signifikant reduceret Spns2 mRNA-niveau med mere end 80%. bruges således vi Spns2i-A i vores videre studier. Scrambled RNA (SCR) og Spns2i-C (herefter SPC), som ikke undertrykke Spns2 ekspression, blev anvendt som negative kontroller.

(A), (B), Karakterisering af Spns2 siRNAs. 20 nM af Spns2 siRNA A, B og C blev transficeret individuelt i A549-celler. 48 timer senere blev totalt RNA opsamlet og RT-PCR (A) og QRT-PCR (B) udføres for at måle Spns2. Scrambled RNA (SCR) blev anvendt som en negativ kontrol. (C), Spns2 knockdown af Spns2i-A signifikant forøget intracellulær S1P niveau. A549-celler blev transficeret med Spns2 siRNA som i A, 24 timer efter transfektion blev celledyrkningsmedier ændret til medier med delipideret FBS. Yderligere 24 timer senere blev cellepellets opsamles og S1P analyseret ved lipidomics. N = 3. (D), Spns2 knockdown ændrer niveauet af SGPP1, SGPP2, og SGPL1. A549-celler blev behandlet som i A, bortset fra QRT-PCR blev udført for at måle SGPP1, SGPP2, og SGPL1. N = 4. qPCR data blev normaliseret til GAPDH.

For at karakterisere effekten af ​​Spns2 knockdown på sphingolipid metabolisme i NSCLC celler, vi bestemt niveauerne af sphingolipid og dem af deres relaterede enzymer. Lipidomics data viser, at Spns2 knockdown af Spns2i-A signifikant øget det intracellulære S1P niveau, mens reduceret Sph niveau, i A549 celler i forhold til Scr og SPC (fig. 5C og S2A). Niveauerne af forskellige ceramid arter blev ikke ændret ved Spns2 knockdown (fig. S2B). Dette er i overensstemmelse med en tidligere rapport, at S1P mangel i mus fører til øget niveau af S1P i lungerne [33]. For at analysere den mekanisme af forøget cellulær S1P målte vi niveauerne af store enzymer i S1P metabolisme. Figur 5D viser, at niveauet af flere enzymer blev ændret efter Spns2 knockdown af Spns2i-A: SGPP1 var signifikant forhøjet ved 8 fold; SGPP2 blev reduceret med -50%; og SGPL1 blev reduceret med mere end 80%. Stigning i SGPP1 vil accelerere S1P konvertering til at reducere cellulær S1P niveau, som vil blive modvirket af reduktion i SGPP2 og forøgelse SGPL1. Men SGPL1 var meget mere rigeligt udtrykt end SGPP1 i A549-celler (22 gange højere) (fig. 5D). Dette forklarer, hvorfor S1P blev forøget efter Spns2 knockdown. Andre enzymer, såsom SphKs, blev ikke signifikant påvirket af Spns2 knockdown (fig. S2C og S2D).

Spns2 knockdown forbedrer NSCLC celler migration

Funktionelt, vi først undersøgt Spns2 knockdown rolle på celle overlevelse /udbredelse siden ektopisk Spns2 ekspression induceret apoptose. Levende celletælling assays fandt, at Spns2 knockdown med Spns2i-A ikke resulterede i en signifikant stigning i antallet af levedygtige celler i enten A549 eller H1299 celler (ikke vist), hvilket indikerer, at Spns2 nedregulering ikke påvirker celleoverlevelse eller proliferation i NSCLC celler.

Vi undersøgte derefter rolle Spns2 knockdown på cellemigration da intracellulær S1P er afgørende for lunge celle migration og motilitet [48]. Sårheling scratch assays blev udført med både A549-celler og H1299-celler. Fire hundrede um huller blev genereret i sammenflydende kulturer og mikrografiske billeder taget ved 8 og 24 timer efter ridser. Figur 6A viser typiske billeder af assayet i A549-celler. Dobbelte blindede kvantitative analyser viste, at kontrol A549-celler (SCR) migrerede med en hastighed på 8,0 ± 1,5 pm /h og 5,4 ± 0,8 um /h for 8 og 24 timers periode, henholdsvis (SPC celler har et tilsvarende resultat) (fig. 6B). Imidlertid Spns2 Knockdown celler migrerede ved en hastighed på 14,9 ± 3,1 um /h og 10,0 ± 0,3 um /time i den samme tidsperiode, svarende til en 1,86 og 1,85 gange stigning, (fig. 6B). Denne observation blev gentaget i H1299 celler (fig. 6C).