PLoS ONE: lad-7b og miR-126 Er nedreguleret i tumorvæv og korrelerer med mikrokardannelse Density og Overlevelse Outcomes i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Angiogenese er en kritisk hændelse i udvikling, progression, og spredning af forskellige humane cancere, herunder lungekræft. Molekylære mekanismer, der ligger bag den komplekse regulering af angiogene processer er dårligt forstået. Men en stigende mængde af beviser tyder miRNA som vigtige regulatorer af tumor angiogenese. Tang biopsier blev opsamlet fra tumorvæv, omgivende væv og ikke-tumorvæv fra 50 NSCLC-patienter. Lung vævsprøver fra individer med ingen kliniske tegn på en cancersygdom fungerede som kontroller. Immunohistokemisk farvning for faktor VIII blev anvendt til at evaluere mikrokar densitet (MVD). TaqMan® primer-probe-sæt blev anvendt i kvantitative real-time RT-PCR-reaktioner for at bestemme ekspressionsniveauerne af lad-7b, MIR-126, MIR-9, og MIR-19a. Vi demonstrerede signifikant højere MVD og nedsat ekspressionsniveauer af lad-7b og MIR-126 i tumorvæv og omgivende væv i sammenligning med tilsvarende ikke-tumorvæv eller lungevæv fra kontrolgruppen. Derudover blev der ikke observeret nogen forskelle i MVD og ekspressionsniveauer af begge miRNA mellem tumorvæv og omgivende væv fra NSCLC-patienter. Lav ekspression af begge miRNA korreleret med høj MVD og værre progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse. Disse observationer tyder stærkt lignende molekylære vekslen inden tumorvæv og omgivende væv, der omfatter en bestemt mikromiljø. Lav ekspression af lad-7b og MIR-126 synes at have en mulig antiangiogen rolle i lunge tumorvæv og signifikant korrelerer med ringere overlevelse resultater for patienter med lungecancer. Desuden kunne reguleringen af ​​Lad-7b og miR-126-ekspression have terapeutisk potentiale, fordi det kan reducere tumor angiogenese og derfor undertrykke tumorvækst i patienter med lungecancer

Henvisning:. Jusufović E, Rijavec M, Keser D, Korošec P, Sodja E, Iljazović E, et al. (2012) lad-7b og miR-126 Er nedreguleret i tumorvæv og korrelerer med mikrokardannelse Density og Overlevelse Outcomes i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (9): e45577. doi: 10,1371 /journal.pone.0045577

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: April 5, 2012; Accepteret: August 22, 2012; Udgivet: September 24, 2012 |

Copyright: © Jusufović et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft, den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, ofte diagnosticeret i sin fremskredne; derfor kemoterapi kombineret med thorax strålebehandling repræsenterer grundpillen i behandlingen. Men en behandling, der påvirker specifikke molekylære mål rummer store forbedre de kliniske resultater i lungekræft behandling [1], [2].

Udviklingen, progression, og metastase af forskellige humane cancere er stærkt afhængige af angiogenese, en fysiologisk proces, der involverer dannelsen af ​​nye blodkar fra allerede eksisterende kar. En udvikling fast tumor er generelt i en oxygen-sultede eller hypoxiske tilstand, der udløser den differentielle ekspression af mediatorer, der enten fremmer eller undertrykker angiogenese [3]. Angiogene faktorer (f.eks familien af ​​vaskulære endotel vækstfaktorer [VEGF’erne] og deres receptorer) styrer denne komplekse proces har været i fokus for bestræbelserne på at identificere nye terapeutiske mål og udvikle behandlingsstrategier for at hæmme angiogenese og undertrykke den ukontrollerede spredning af at udvikle tumorer [2]. Derfor belyse de molekylære mekanismer, der regulerer angiogenese kunne være af stor betydning at reducere kræft dødelighed [3], [4].

MikroRNA’er (miRNA) er korte (i gennemsnit 19 til 25 nukleotider lange) regulatoriske RNA molekyler med en primær funktion i silencing af genekspression, som er hovedsageligt baseret på posttranskriptionel undertrykkelse af mål-mRNA’et ved at undertrykke translation og /eller ved at fremme mRNA henfald [5], [6]. Modne miRNA kontrollere ekspressionen af ​​talrige gener, der regulerer de grundlæggende biologiske processer, herunder angiogenese [6]. Mange miRNA regulere angiogenese, selv om deres specifikke roller i angiogene proces er dårligt karakteriseret. Deres potentiale tumor-undertrykkende eller oncogen rolle i denne proces er blevet foreslået i forskellige humane cancere [7] – [11]. Desuden akkumulere beviser foreslår miRNA som attraktive mål for udviklingen behandlingsstrategier, der ville opnå bedre kliniske resultater hos kræftpatienter [12] – [14]

Flere forfattere viste reduceret ekspression af det lad-7 miRNA familie, herunder. lad-7b, i enten tumorvæv eller tumorcellelinier sammenlignet med deres normale modstykker [13], [15], [16] tyder på, at medlemmer af lad-7 familie er afgørende regulatorer af cellulære processer involveret i initiering og progression af forskellige humane cancere. I ikke-maligne celler, lad-7b undertrykker translation af flere proteiner involveret i udvikling lungekræft, nogle af dem med en potentiel rolle i angiogenese (f.eks C-MYC og K-RAS) [17], [18].

en anden miRNA ofte nedreguleret i flere humane kræftformer er miR-126 [9], [12], [19], som er rettet mod ekspression af VEGFA og andre molekylære mål med en potentiel rolle i dannelsen blod-fartøj ( f.eks VCAM1, EGFL7, og PIK3R2) [19] – [21]. Liu et al. [12] fundet nedsat ekspression af MIR-126 og forøget ekspression af VEGFA i forskellige lungecancer-cellelinjer, og viste, at indførelsen af ​​MIR-126 i tumorceller under anvendelse af en lentiviral vektor kunne nedregulere ekspressionen af ​​VEGFA.

medlemmer af mIR-17-92 klynge er kendt for at virke som onkogener i udviklingen af ​​lungecancer [14], [22]. Det er blevet vist at ekspression af MIR-17-92 klynge er direkte aktiveret ved onkogener c-myc og N-myc [23], [24]. Den deraf følgende høj ekspression af dets medlem, miR-19a, viste sig at korrelere med nedsat ekspression af adskillige anti-angiogene faktorer såsom thrombospondin-1 (TSP-1) og bindevæv vækstfaktor (CTGF) [23], [25] .

oplysningerne om den rolle, miR-9 i lungekræft udvikling og angiogenese mangler stadig. Brug af microarray analyse, nedregulering af MIR-9 i lunge tumorvæv i sammenligning med tilsvarende ikke-tumorvæv blev rapporteret [15]. På den anden side, ekspression af MIR-9 synes at være opreguleret i brystcancer, hvor det reducerer E-cadherin ekspression fører til forøget ekspression af VEGFA og fremme af angiogenese [10].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge graden af ​​vaskularisering bestemt ved mikrokar densitet samt ekspression af udvalgte miRNA (specifikt, lad-7b, mIR-126, mIR-9, og mIR-19a) i lunge tumorvæv, omgivende væv, og den tilsvarende ikke-tumorvæv hos patienter med planocellulært lungecancer (SCC) og lunge adenocarcinom (ADC) samt i lungevæv fra kontrolpersoner uden kliniske tegn på en malign sygdom. Forholdet mellem miRNA ekspressionsniveauerne og overlevelse udfald (PFS og OS) efter 1 år opfølgning blev også vurderet. Resultaterne af denne undersøgelse kunne forbedre den molekylære iscenesættelse af lungekræft og kan tilbyde værdifuld indsigt i at identificere potentielle antiangiogen målrettet terapi i lungekræft.

Resultater

mikrokar densitet (MVD)

MVD i tumorvæv (median [interval]: 48 [17-123]) og omgivende lungevæv (median [interval]: 49 [14-120]) var signifikant højere i sammenligning med tilsvarende ikke-tumorvæv ( median [interval]: 26 [12-89]) eller kontrol lungevæv (median [interval]: 34 [5-87] Figur 1). Der blev ikke observeret nogen forskel i MVD mellem tumorvæv og omkringliggende væv eller når patienter blev stratificeret efter stadium af sygdommen, type lungekræft eller køn. Ligeledes blev der ikke påvist forskelle i MVD inden kontrolgruppen af ​​individer med forskellige patologiske fund (data ikke vist). Figur 2 viser repræsentative tilfælde af MVD (faktor VIII) immunfarvning i FFPE vævsprøver.

Data er præsenteret som median med interkvartile område.

Pile angiver blodkar.

miRNA udtryk og korrelationer med mikrokardannelse tæthed

Angivelse af udvalgte miRNA blev bestemt i alle vævsprøver og normaliseret til en prøve fra kontrolgruppe. Ingen signifikante korrelationer blev observeret mellem ekspression af udvalgte miRNA og enten klinisk stadium af sygdommen, type lungekræft eller patienternes køn.

Vi fandt signifikant reduceret ekspression af enten lad-7b eller miR-126 i tumorvæv og det omgivende væv sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor lungevæv eller lungevæv fra kontrolgruppen (lad-7b /mIR-126:

s Restaurant 0,001; figur 3A og 4A, henholdsvis). Der blev ikke observeret nogen forskel i ekspressionen af ​​enten lad-7b eller miR-126 mellem tumorvæv og omgivende væv. Ingen forskelle i Lad-7b ekspression blev også noteret mellem ikke-tumorvæv og kontrol lungevæv. På den anden side blev der fundet signifikante forskelle i MIR-126-ekspression mellem begge vævstyper. Endvidere fandt vi en høj negativ sammenhæng mellem lad-7b (figur 3B-E) eller MIR-126-ekspression (figur 4B-E) og MVD i alle vævsprøver hvor den samlede r

S korrelationskoefficient var -0,784 og – 0,752, henholdsvis.

data er præsenteret som median med rækkevidde og interkvartile område. Korrelation mellem lad-7b relative ekspression og MVD i lungekræft patienternes tumorvæv (B), omgivende væv (C), og ikke-tumor lungevæv (D), såvel som i lungevæv fra kontrolindivider (E).

data er præsenteret som median med rækkevidde og interkvartile område. Korrelation mellem MIR-126 relative ekspression og MVD i lungekræft patienternes tumorvæv (B), omgivende væv (C), og ikke-tumor lungevæv (D), såvel som i lungevæv fra kontrolindivider (E).

på den anden side, ingen signifikante ændringer i miR-9 ekspressionsniveauerne blandt alle undersøgte vævsprøver blev observeret (figur 5A).

data er præsenteret som median med rækkevidde og interkvartile område .

Vi observerede signifikant lavere ekspression af mIR-19a i tumorvæv i sammenligning med kontrol lungevæv (figur 5B). Udtrykket af miR-19a var højere i omgivende væv formular ADC patienter i forhold til omgivende væv fra SCC patienter (

s

0,001; data ikke vist).

Da ekspressionsniveauer af miR -9 og miR-19a ikke varierer betydeligt mellem tumorvæv og tilsvarende ikke-tumorvæv, blev yderligere korrelationer med MVD ikke evalueret.

Overlevelse analyser

Kun miRNA med stærke statistiske forskelle i udtryk niveauer blandt tumorvæv versus tilsvarende ikke-tumorvæv (lad-7b og miR-126) blev inkluderet i overlevelse analyse.

median PFS for hele gruppen af ​​patienter var 154 dage, mens median OS var 236 dage. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i PFS eller OS for hele gruppen af ​​patienter, når patienterne blev stratificeret efter histologiske type lungekræft eller sygdom stadier (data ikke vist).

PFS og OS ifølge enten MVD status eller miRNA ekspression for patienter med lungecancer er vist i tabel 1 og figurerne 6-7. Kort fortalt blev lav ekspression af lad-7b, miR-126 eller begge miRNA kombineret korreleret med korte PFS eller OS i hele gruppen af ​​patienter med lungecancer. Med vedtagelsen af ​​signifikansniveau på 0,01, korrelationerne forblev signifikant i en undergruppe af SCC patienter, mens der blev observeret en tendens til kortere PFS eller OS i en undergruppe af ADC patienter.

Progressionsfri overlevelse i hele koncernen af NSCLC-patienter (A), i patienter med planocellulært lungecancer (B) og adenocarcinom (C). Samlet overlevelse i hele gruppen af ​​NSCLC patienter (D), hos patienter med planocellulært lungecancer (E) og adenocarcinom (F).

Progressionsfri overlevelse i hele gruppen af ​​NSCLC-patienter ( A), i patienter med planocellulært lungecancer (B) og adenocarcinom (C). Samlet overlevelse i hele gruppen af ​​NSCLC patienter (D), hos patienter med planocellulært lungecancer (E) og adenocarcinom (F).

Diskussion

Molekylære mekanismer der ligger til grund for den komplekse regulering af tumor angiogenese er dårligt forstået. Men en stigende mængde af beviser i de seneste år viser, miRNA som vigtige regulatorer af fysiologiske og patologisk angiogenese. For at vurdere angiogene rolle udvalgte miRNA, blev deres ekspressionsniveauerne bestemmes og korreleret med MVD i NSCLC patienter. Vi viste signifikant reduceret ekspression af to miRNA (lad-7b og MIR-126) og højere grad af MVD i tumorvæv og omgivende væv i sammenligning med tilsvarende ikke-tumorvæv. Der blev ikke observeret nogen forskel i MVD og ekspressionsniveauerne af begge miRNA mellem tumorvæv og omgivende væv fra NSCLC patienter. Ekspressionen af ​​begge miRNA også negativt korreleret med MVD og var signifikant associeret med sygdomsprognose. Disse observationer antyder kraftigt en mulig antiangiogen rolle Lad-7b og MIR-126 under udvikling lungekræft. Desuden kunne reguleringen af ​​Lad-7b og miR-126-ekspression have terapeutisk potentiale, fordi det kan reducere tumor angiogenese og derfor undertrykke tumorvækst i patienter med lungecancer.

Angiogenese kunne evalueres af forskellige metodiske tilgange. I vores undersøgelse anvendte vi MVD som indikator for den angiogene potentiale vævsprøver. Vores resultater indikerer høj MVD i tumorvæv og omgivende væv i sammenligning med ikke-tumorvæv fra NSCLC-patienter eller kontrolgruppen. Vi fandt ingen signifikante forskelle mellem tumorvæv og omgivende væv. Disse observationer er konsistente, selvom de ikke er direkte sammenlignelige med resultaterne af andre undersøgelser, tyder på, at mikromiljø omgivende væv udøver et stort potentiale for tumor udvikling, vedligeholdelse og progression [26] – [28]. Hidtil har flere undersøgelser rapporteret høj ekspression af enten pro-angiogene faktorer (f.eks transkriptionsfaktor HHvis-1α, vækstfaktorer VEGF og bFGF) eller faktorer involveret i vaskulær udvikling og remodellering (f.eks endoglin CD105) i tumorer og /eller omgivende væv [26], [28] – [30]. Forskellige typer af stromale celler, såsom endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, og infiltrerende celler i immunsystemet i tumormikromiljøet har vist sig at producere disse pro-angiogene mediatorer og dermed fremme afgørende begivenheder i tumorvækst og angiogenese [27 ], [31], [32].

Denne undersøgelse viste en signifikant lavere ekspression af lad-7b og mIR-126 i tumorvæv sammenlignet med enten ikke-tumorvæv fra NSCLC-patienter eller lungevæv fra kontrolgruppe. Vores resultater er i overensstemmelse med andre offentliggjorte undersøgelser, hvor reduceret ekspression af lad-7 familie, herunder lad-7b [13], [15], [16] eller miR-126 [9], [12], [15], [ ,,,0],19], [20], [33] i tumorvæv eller tumor cellelinier af forskellige humane cancere er rapporteret. Ekspressionsniveauer af både lad-7b og MIR-126 var også signifikant lavere i omgivende væv, hvor der ikke tumorceller var til stede. Så vidt vi ved, har direkte sammenligning af lad-7 eller MIR-126 ekspressionsniveauer mellem tumorvæv og omgivende væv ikke blevet rapporteret. På basis af vores resultater kan man konkludere, at lignende molekylære ændringer er til stede inden tumorvæv og dens omgivende væv. Desuden er en stærk negativ korrelation mellem MVD, en indikator for væv angiogene potentiale og ekspression af lad-7b eller MIR-126 i alle undersøgte vævsprøver blev observeret, kraftigt antyder deres rolle i at undertrykke angiogene processer. Desuden disse observationer igen indikerer den store betydning af tumor mikromiljø i cancer udvikling og dets inddragelse i tumor angiogenese.

Desuden overlevelse analyse af både miRNA viste, at NSCLC patienter med lav udtryk for enten individuel miRNA eller begge miRNA kombineret (lad-7b og miR-126) var stærkt forbundet med dårlige overlevelse udfald (PFS og OS). Men foreningerne var signifikante i en undergruppe af SCC patienter, selv om ADC patienter med lav ekspression af begge miRNA i tumorvæv tendens til at have kortere PFS eller OS. Denne stærke virkning af lad-7 eller miR-126-ekspression på sygdom prognose er blevet rapporteret af andre forskergrupper [13], [15], [34] – [36]. Flere undersøgelser korreleret reduceret ekspression af lad-7 i tumorvæv med dårlige overlevelse resultater af lungekræftpatienter [13], [15]. Tilsvarende har forholdet mellem lav MIR-126-ekspression i tumorvæv og værre sygdomsprognose blevet rapporteret i glioblastom [34], brystcancer [35] og gastriske kræftpatienter [36]. Som modsat vores resultater, Donnem et al. [37] viste, at høj MIR-126 ekspression i tumorprøver korrelerer med en kortere overlevelse NSCLC-patienter, især i de med pladecellecarcinom. Endnu mere interessant, blev en positiv korrelation mellem miR-126 og VEGFA udtryk observeret, hvilket tyder på en mulig positiv regulerende rolle miR-126 i tumor angiogenese [37].

Endnu vigtigere, Takamizawa et al. [13] viste, at væksten af ​​lungecancerceller kunne inhiberes ved indføring af ekspressionskonstruktioner overudtrykker lad-7. Alt i alt kunne disse resultater være potentielt bruges til at udvikle nye kræft-målrettede behandlinger, som kan begrænse bivirkninger, efterfølgende forbedre livskvalitet og forlænge den samlede overlevelse.

Denne undersøgelse viste ingen signifikante forskelle i miR-9 ekspressionsniveauerne blandt alle undersøgte vævsprøver og ingen sammenhæng med MVD. Ikke desto mindre er større undersøgelser berettiget til at bestemme den nøjagtige rolle miR-9 udtryk i tumor angiogenese, da kun et begrænset antal studier i lungekræft er blevet offentliggjort indtil videre [15], [38].

Vores resultater indikerer en lavere ekspression af mIR-19a i tumorvæv i sammenligning med andre vævsprøver. Disse resultater er modstridende og modsætte sig pro-angiogene rolle miR-19a, rapporteret af de fleste undersøgelser hidtil offentliggjorte [14], [23], [25], [39], [40]. rapporterede imidlertid flere forfattere, at de enkelte medlemmer af miR-17-92 klynge, herunder miR-19a, kan have forskellige funktioner i kræft cellevækst og angiogenese [14], [39], [40]. Desuden TSP-1, der er blevet beskrevet som en af ​​de vigtigste mål for MIR-19a, kan enten reducere [23], eller efter binding med celleoverfladereceptorer integriner, selv fremmer angiogenese [41]. Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser af de enkelte medlemmer af miR-17-92 klynge og deres involvering i angiogene processer.

Som konklusion, vores resultater viser, at signifikant nedsat ekspression af lad-7b og miR-126 i tumor væv har en indvirkning på prognose NSCLC patienter. Disse fund kunne give os et vigtigt skridt i retning af at forstå de komplekse veje er nødvendige for udvikling og progression af lungekræft. Desuden har miRNA blevet foreslået som attraktive mål for at udvikle behandlingsstrategier, der ville opnå bedre kliniske resultater hos kræftpatienter. Men de foreliggende resultater giver kun konklusioner baseret på korrelativ analyse og yderligere validering gennem mekanistiske undersøgelser synes obligatorisk.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Denne multi- centric undersøgelse blev påbegyndt efter den blev godkendt af human Research etiske komité i Bosnien-Hercegovina og den tilsvarende organisation i Serbien og alle patienter gav deres skriftlige godkendelse. Indsamling og efterfølgende konservering (formalin fiksering, paraffin indlejring) af vævsprøver fra de deltagende patienter og kontroller samt immunhistokemiske evaluering blev udført på General Hospital Tešanj (Bosnien-Hercegovina) og Klinik for lungesygdomme i Kruševac (Serbien). Molekylære laboratorium procedurer, herunder RNA ekstraktion, revers transkription, og real-time PCR udtryk analyse på vævsprøver blev udført på University Clinic Golnik (Slovenien).

50 patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) , herunder SCC og ADC (tabel 2), og 45 alders- og køn-matchede individer uden kliniske tegn på en ondartet sygdom (kontrolgruppe) blev inkluderet (tabel 3).

for patologisk undersøgelse, immunhistokemi, og miRNA-analyse, pincet biopsier af tumorvæv, omgivende væv (2 cm radius omkring primær tumor væv uden maligne celler), og patienternes non-tumor lungevæv blev taget fra patienter med lungekræft. Diagnosen SCC eller ADC i alle tumor- vævsprøver blev bekræftet af en erfaren patolog før indskrivning i undersøgelsen. Vi inkluderede prøver tumorvæv med mindst 70% tumorvæv, hvilket bekræftes af pathohistology, og omgivende væv såvel som ikke-tumor lungevæv uden patologiske synger eventuelle cellulære maligne ændringer. En pincet biopsi blev taget fra kontrolpersoner uden kliniske tegn på en cancersygdom (kontrolgruppe). Vævsprøver blev straks formalinfikseret og paraffinindlejret end anvendelse af standardprocedurer.

Immunhistokemi

Sektioner af 5 um blev udskåret fra paraffinindlejrede vævsblokke. Fra hver vævsprøve blev snit farvet med hæmatoxylin-eosin bruges til morfologisk undersøgelse og kvalitetsvurdering. Immunohistokemisk analyse af vaskularisering blev udført ved anvendelse analysesystemet og det monoklonale antistof mod faktor VIII (DAKO, Glostrup, Danmark). Kort fortalt blev 5 um tykke FFPE snit skåret, anbragt på objektglas overtrukket med 3-triethoxysilylpropylamine (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), og fastsættes til 37 ° C natten over. Efter deparaffinizing i xylen og rehydrering gennem graduerede alkoholer blev objektglassene inkuberet i H

2O

2 for at blokere endogen peroxidase aktivitet. Derefter snit blev inkuberet i 1 time med primært monoklonalt antistof mod faktor VIII (fortynding 1:1200) ved stuetemperatur. Efter vask blev sektionerne inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin-immunglobulin (fortynding 1:300; Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA), vasket igen, og efter tilsætning af 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid peroxidase-aktivitet blev visualiseret. Hematoxylin blev anvendt som en tæller plet.

Graden af ​​vaskularisering blev målt ved det gennemsnitlige antal faktor VIII-positive mikrokar i tre forskellige områder ved 200 ganges forstørrelse og registreres som mikrokardannelse densitet (MVD). Kort fortalt blev Faktor VII farvede sektioner oprindeligt scannet ved lav effekt (100 ganges forstørrelse), og de områder, der har det højeste antal mikrokar (hot spots) blev udvalgt. Efterfølgende blev mikrokar optælling udført i tre forskellige områder ved 200 ganges forstørrelse og gennemsnitsværdien blev anvendt til yderligere analyse. Enhver klart farves endotelceller eller celleklynger blev betragtet som en enkelt tællelig mikrokar, om tilstedeværelsen af ​​lumen og store fartøjer blev automatisk udelukket fra analysen.

Valg af specifikke miRNA er involveret i angiogenese

For at vælge miRNA er involveret i kræft angiogenese regulering, tilgængelige publikationer og flere mål forudsigelse programmer /databaser blev ransaget, herunder Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), Targetscan (http: //www.targetscan.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), og miRBase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Baseret på disse resultater, fire miRNA (specifikt lad-7b, MIR-9, MIR-19a, og MIR-126) blev udvalgt. Udvalgte miRNA viste sig at have roller i angiogenese, enten direkte eller indirekte at undertrykke translation af afgørende angiogene faktorer såsom VEGFA, TSP-1, CTGF, vaskulært celleadhæsionsmolekyle 1 (VCAM-1), fibroblastvækstfaktor (FGF), E -cadherin (CDH1), MMP’er (matrixmetalloproteinaser), og tumor vækstfaktor (TGF).

RNA-ekstraktion, revers transkription, og real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra 10 FFPE vævssnit 5 um tykke vha miRNeasy FFPE Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Total RNA-koncentrationen blev vurderet ved hjælp af Quanti-iT RNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Totrins realtids-PCR blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​udvalgte miRNA. I det første trin total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af miRNA-specifikke RT-primere (RNU6B, HSA-let-7b, HSA-MIR-9, HSA-MIR-19a, og HSA-MIR-126) og en TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA). RT-reaktionen blev udført i 10 pi volumen, indeholdende 1 pi Taqman RT puffer (10 ×), 0,10 pi 100 mM dNTP’er, 0,67 pi MultiScribe revers transkriptase (50 U /pl), 0,13 pi RNase inhibitor (20 U /pl), 2 pi specifikke miRNA primer, 3,33 pi RNA og nuclease frit vand til at slutvolumen 10 pi. Produkter fra RT-reaktionen blev anvendt i en real-time PCR-reaktion med de TaqMan miRNA assays (Applied Biosystems) og TaqMan Universal Master Mix II, ingen UNG (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 1,33 pi cDNA blandet med 5 pi TaqMan Universal Master Mix II, nr UNG (2 x), 0,5 pi TaqMan miRNA assay og 3,17 pi nuclease-frit vand. Alle prøver blev kørt tredobbelt. Den RNU6B (Applied Biosystems), blev anvendt som en endogen kontrol for normalisering af mål- miRNA og en prøve fra kontrolgruppen blev anvendt som en kalibrator. Relativ ekspression blev beregnet ved anvendelse af ΔΔCt metoden. Den RQ blev bestemt ved 2

-ΔΔCt, hvor ACt = (gennemsnit af tre eksemplarer Ct

Target miRNA-gennemsnit tre eksemplarer Ct

RNU6B) og ΔΔCt = (ACt

Sample-ACt

Eksempel fra kontrolgruppe). Real-time PCR blev udført på ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System (Sequence Detection System instrument udstyret med SDS version 1.3.0 software Applied Biosystems).

statistiske analyser

Fordelingen af data blev bestemt under anvendelse af D’Agostino og Pearson omnibus normalitet test. Styrken af ​​sammenhængen mellem miRNA ekspressionsniveauer, MVD og andre kliniske variable blev analyseret med Mann-Whitney U-test, uparret t test eller Fishers eksakte test efter behov. Spearman rank korrelation test blev anvendt til at analysere graden af ​​lineær sammenhæng mellem MVD og relative ekspression af individuelle miRNA. Patienterne blev dikotomiseret i grupper med høj /lav MVD eller høj /lav udtryk for udvalgte miRNA i tumorvæv efter cut-off værdier (median MVD eller median relative udtryk, henholdsvis). Alle patienter inkluderet i dette studie blev observeret i 1 år; Efter denne tid overlevelsessandsynligheder (PFS og OS) blev beregnet ud fra den dag diagnosen til tidspunktet for begivenheden (fremskridt eller død, henholdsvis) eller tab at følge op ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og log-rank test blev anvendt til sammenligne forskellige kategorier. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 5 software (San Diego, Californien, USA) og sandsynlighed værdier af

s

0,01 blev accepteret som væsentlig i henhold til Bonferroni korrektion for 5 tests. Statistisk signifikante forskelle præsenteres som: **

s

0,01; ***

s

. 0,001

Tak

Vi er taknemmelige for alle patienter, der deltog i denne undersøgelse, og til I. Kern (Universitetsklinikken Golnik) for hans faglært bistand og uvurderlig rådgivning i Pathohistologisk procedurer.