PLoS ONE: Spontan Produktion af Immunoglobulin M i Human epithelial Cancer Cells

Abstrakt

Det er velkendt, at B-1 B-celler er den vigtigste celletype, der er ansvarlig for produktionen af ​​naturlige immunglobulin M (IgM ) og kan reagere på infektion ved at øge IgM-sekretion. Men vi uventet konstateret, at nogle epitelceller også kan udtrykke omarrangeret IgM transkript, som har naturlige IgM kendetegn, såsom germlinie-kodet og begrænset omlejring mønstre. Her studerede vi IgM-ekspression i humane ikke-B-celler og fundet, at IgM ofte blev udtrykt af mange humane epiteliale cancerceller såvel som ikke-cancer epitelceller. Desuden CD79A og CD79B, to molekyler, der er fysisk forbundet med membranøs IgM på overfladen af ​​B-celler til dannelse af B-celle-antigen-receptor-komplekset, blev også udtrykt på celleoverfladen af ​​epitelcancerceller og placeres sammen med IgM. Ligesom det naturlige IgM, epithelial cancer celle-afledt IgM anerkendt en række mikrobielle antigener, såsom enkeltstrenget DNA, dobbeltstrenget DNA, lipopolysaccharid, og HEp-2-antigen. Vigtigere, stimulering af toll-like receptor 9 (TLR9), som efterligner bakterieinfektion, steg betydeligt sekretionen af ​​IgM i humane epiteliale cancerceller. Disse fund indikerer, at humane epiteliale cancerceller såvel som ikke-cancer epitelceller spontant kan producere IgM med naturlig antistofaktivitet

Henvisning:. Hu F, Zhang L, Zheng J, Zhao L, Huang J, Shao W et al. (2012) Spontan Produktion af Immunoglobulin M i Human epitelcancerceller. PLoS ONE 7 (12): e51423. doi: 10,1371 /journal.pone.0051423

Redaktør: Jonas Fuxe, Karolinska Instituttet, Sverige

Modtaget: August 27, 2011; Accepteret: November 7, 2012; Udgivet: 12. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 30973389 og 30772470 fra National Natural Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er velkendt, at som en klassisk immunitet molekyle, immunoglobulin (Ig) spiller en essentiel rolle i immunsystemet [1]. Det kan bindes fremmede stoffer, såsom bakterier og medvirke ødelægge dem [2]. Ig blev tidligere antaget kun at være produceret af B-lymfocytter og plasmaceller. I det seneste årti, men dette koncept er blevet udfordret af en række undersøgelser [3], [4], [5], [6],. I 2003, vi først rapporteret IgG udtryk i humane epiteliale cancerceller [3]. Siden da har vores gruppe og andre bekræftede, at mange menneskelige non-B cancerceller og nogle normale celler kan producere Ig, især IgG eller IgA [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Desuden er disse ikke-B-cancercelle-afledte IgG eller IgA er involveret i overlevelse og proliferation af cancerceller [3], [4], [18]. Imidlertid er ekspressionen af ​​IgM i humane ikke-B-celler sjældent undersøgt [8]. For nylig fandt vi, at IgM tung kæde (Ig μ) gen med et særskilt repertoire blev transkriberet i humane epiteliale cancerceller [8], hvilket antyder, at IgM kan også udtrykkes i disse epitelceller afstamningsceller.

Der er to klasser af IgM naturlige og immune. Naturlige IgM har været tænkt kun produceret af medfødte-lignende B-1 B-celler i fravær af patogene møder, og immun IgM produceres af både medfødte-lignende B-1 B-celler og adaptiv B-2 B-celler efter et antigen eller patogen støde på. Naturlige IgM udgør hovedparten af ​​den samlede cirkulerende IgM. Det meste af den naturlige IgM kimcellelinje kodet og polyreactive, og det binder med lav affinitet til en række forskellige antigener, såsom mikrobielle patogener, der bidrager til tidlig immunitet før igangsættelsen af ​​den adaptive humorale respons og spiller en grundlæggende rolle i tidlig antimikrobiel immunitet [19]. De seneste undersøgelser af Zhou et al. viste, at ikke alle polyreactive naturlige IgM-producerende antigen-bindende B-celler udtrykker B-1 B celleoverflademarkører (f.eks IgM

hej, IgD

lo, B220

lo, Mac-1

hi , CD23

lo og CD5

hi) [20], hvilket tyder på, at ud over B-1 B-celler, andre celletyper kan også være involveret i produktionen af ​​naturlige IgM.

Toll-lignende receptorer (TLR) er en klasse af proteiner, der spiller en afgørende rolle i det medfødte immunsystem. De genkender “patogen-associeret molekylære mønstre”, som er strukturelt konserverede molekyler afledt fra mikrober og kan skelnes fra værten molekyler, og aktivere medfødte immunrespons [21]. Mere end 13 medlemmer af TLR familien er blevet identificeret i pattedyr. TLR9 genkender specifikt umethylerede CpG-sekvenser i mikrobiel DNA [21], [22]. Syntetiske oligodeoxynucleotider (ODN) med umethylerede CpG motiver, som kan efterligne virkningerne af mikrobielle DNA, er også anerkendt af TLR9 [23], [24], [25], [26]. Når den er aktiveret, TLR9 og de tilknyttede adaptere, såsom myeloid differentiering antigen 88 (MyD88) [27], [28], rekruttere intracellulær signalering mediatorer og inducere aktivering af den nukleare faktor-KB (NF-KB) og mitogenaktiveret proteinkinase veje, hvilket resulterer i produktion af cytokiner og Ig, hovedsagelig IgM [29].

hos mennesker, TLR9 udtrykt præferentielt i B-celler, plasmacytoide dendritiske celler, monocytter og naturlige dræberceller [22]. Funktionel TLR9 er også fundet i mange humane epiteliale cancerceller som lungekræft, brystkræft og prostatakræft [30], [31], [32], [33], [34]. Vigtigere, CpG-ODN, og endog ikke-CpG-ODN, kan aktivere TLR9 udtrykt i brystcancercellelinier og prostatakræft-cellelinier, hvilket resulterer i forøget cellulær invasion [32], [33], [34]. Når de aktiveres af methyleret CpG, TLR9 inducerer sekretionen af ​​mange cytokiner, såsom interleukin (IL) -1α, IL-6 og IL-8 [31], [35]. Det er stadig uklart, om TLR9 på epitelial kræft celler kan mediere IgM produktion og sekretion.

I denne undersøgelse vurderet vi IgM udtryk i humane ikke-B-celler, og viste, at humane epiteliale kræftceller samt ikke- cancer epitelceller kan spontant producere naturlige IgM. TLR9 agonister stimulerede sekretionen af ​​IgM i humane epiteliale cancerceller. Ligesom B-1 B-celle-afledt naturlig IgM, epithelial cancer celle-afledt IgM anerkendt en række mikrobielle antigener og nogle autoantigen. Disse fund indikerer, at humane epiteliale cancerceller såvel som ikke-cancer epitelceller spontant kan producere IgM med naturlig antistofaktivitet.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og Kultur

den humane cervikale cancercellelinie HeLa MR, en

O

6-methylguanin-DNA methyltransferase-deficient derivat af HeLa S3 [36], [37], [38], [39], [40 ], [41], var en gave fra Dr. Shouping Ji (Academy of Military Medical Science, Beijing, Kina). Alle andre cellelinier, herunder humane cervikale cancercellelinie HeLa, coloncancer cellelinier HT-29 og SW480, hepatisk cancer cellelinie HepG2, osteosarcomcellelinie U-2 OS, embryoniske nyre cellelinier 293 og 293T og B lymfocytisk leukæmi celle Raji opnåedes fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HeLa MR, HT-29, SW480, HepG2, U-2 OS, 293 og 293T blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika, mens HeLa og Raji blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Cellerne i logaritmisk vækstfase blev anvendt til forsøgene.

vævsprøver

Tissue microarrays blev købt fra Patologisk Institut, Beijing Friendship Hospital. Vi studerede i alt 202 prøver, som omfattede 26 forskellige tumortyper, 19 counterpart prøver af godartet sygdom, og normale væv. Vi skære 4-um snit af de resulterende multitumor væv microarray blokke og monteret hver sektion på en klæbemiddelbelagte slæde (Instrumedics Inc., Hackensack, NJ, USA). Frosne cancer væv, herunder brystcancer (2 tilfælde), coloncancer (2 tilfælde), lungecancer (2 tilfælde), og ovariecancer (1 tilfælde) var fra tumoren vævsprøve bank af Peking University Cancer Hospital. 4-um frosne snit blev fremstillet og fikseret med acetone.

Immunhistokemi

Tissue microarray snit blev deparaffineret, rehydreret gennem ethanol vaske med graduerede koncentrationer, som er tilføjet i 10 mM citratpuffer (pH 6,0), og derefter opvarmet to gange i en mikrobølgeovn for 5 minutters hver. Objektglassene blev derefter inkuberet med 3% hydrogenperoxid i 5 minutter, vasket med phosphatpufret saltvand (PBS), og blokeret i PBS plus 10% normalt gedeserum i 10 minutter. Efter fjernelse af overskydende blokeringspuffer, udførte vi indirekte immunhistokemisk farvning med monoklonalt muse-anti-humant Ig μ (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA). Objektglas blev inkuberet i et fugtigt kammer ved 37 ° C i 45 minutter, vasket grundigt og derefter inkuberet med gede-anti-muse-IgG-peberrodsperoxidase (HRP) (1:100, Dako) ved 37 ° C i 30 minutter. Objektglas blev vasket igen, og blev påvist bundne antistoffer ved anvendelse af 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, Dako). Kontrol- snit blev farvet med gede-anti-muse-IgG-HRP alene.

immunfluorescensfarvning

For at bekræfte ekspressionen af ​​IgM i humane epitelceller, blev to-farvet immunfluorescensfarvning udført på frosne væv objektglas . Kort fortalt blev de frosne væv objektglassene blokeret med 10% normalt gedeserum, og derefter blev glassene inkuberet med muse-anti-humant Ig μ (Mabworks Biotech Co., Beijing, Kina) samt kanin anti-human pan-cytokeratin eller kanin anti-humant CD19 (Santa Cruz, CA, USA) ved 37 ° C i 1 time efterfulgt af inkubering med TRITC-konjugeret ged anti-mus IgG og Alexa Fluor® 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (Santa Cruz) ved 37 ° C i 30 minutter. Efter modfarvning med Hoechst 33342 blev slides observeret direkte under en omvendt fluorescens mikroskopi (Olympus IX71-141, Tokyo, Japan).

flowcytometrianalyse

Vi udførte flowcytometri analyse for at vurdere den ekspression af IgM og TLR9 i humane epiteliale cancerceller. Til påvisning af IgM og TLR9 på celleoverfladen, blev cellerne høstet, vasket to gange med PBS, blokeret med 2% FBS i PBS ved 4 ° C i 30 minutter, farvet med monoklonale muse-antistoffer (mAb) mod human Ig μ (Mabworks) eller TLR9 (IMG-305A, IMGENEX, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C i 40 minutter. Efter to gange vask med PBS blev cellerne inkuberet i 100 pi PBS indeholdende fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-muse-IgG (Santa Cruz) ved 4 ° C i 30 minutter. Cellerne blev vasket to gange med PBS, og 10.000 celler blev analyseret på en FACSCalibur flowcytometer hjælp CellQuest software (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). Baggrund fluorescens blev bestemt under anvendelse af celler inkuberet med det sekundære antistof, men uden det primære antistof.

Til vurdering af intracellulær IgM og TLR9 blev de høstede celler fikseret i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 30 minutter, vasket med PBS og permeabiliseret to gange med 1 × permeabilisering puffer (eBioscience, San Diego, CA, USA). Cellerne blev derefter centrifugeret ved 1.500 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Supernatanten blev kasseret, og cellerne blev mærket med passende primære og sekundære antistoffer som beskrevet ovenfor.

For at udelukke muligheden for kontaminering af cancer cellelinjer ved B-lymfocytter, blev cellerne høstet, vasket to gange med PBS, blokeret med 2% FBS i PBS i 30 minutter, og farvet med monoklonalt anti-humant CD19-phycoerythrin (PE) (Becton Dickinson) ved 4 ° C i 40 minutter. Efter to vaske blev cellerne bedømt for CD19-ekspression på en FACSCalibur flowcytometer. CD19

+ cellelinie Raji blev anvendt som en positiv kontrol. Baggrund fluorescens blev bestemt under anvendelse af celler inkuberet med PE-konjugeret mus IgG (Becton Dickinson).

Reverse Transcription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) og Realtime PCR Analyser

Total RNA blev ekstraheret fra celler eller vævsprøver under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og blev behandlet med TURBO DNase (Ambion, Austin, TX, USA) for at eliminere forurening af genomisk DNA. Revers transskription blev udført med RevertAid første streng cDNA syntesekit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) ifølge producentens anvisninger. Den resulterende cDNA blev underkastet PCR og realtime PCR-analyser.

PCR blev udført for at analysere ekspressionen af ​​Ig μ, Ig κ, CD79A, CD79B, TLR9 og MyD88 i de humane epithelical cancercellelinier (primere vist i tabel S1). PCR-produkterne blev separeret ved gelelektroforese på 1% agarose. Identiteten af ​​PCR-produkterne blev yderligere bekræftet ved DNA-sekventering.

To-trins realtime PCR blev udført for at kvantificere ekspressionen af ​​IgM og CD19 i humane epiteliale cancer væv under anvendelse SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) ifølge producentens instruktioner (primere vist i tabel S2). Reaktionen blev kørt på 7300 Fast Realtime PCR System (Applied Biosystems). Genekspression blev kvantificeret i forhold til ekspressionen af ​​housekeeping-genet GAPDH og normaliseret til den positive kontrol (humane mononukleære celler fra perifert blod) ved standard 2

-. △△ CT beregning

Protein Extraction og Western Blot Analyse

for at udvinde cytoplasmatiske proteiner, blev de høstede cellepellets lyseret i radioimmunudfældning assay (RIPA) lysepuffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA), og inkuberes på is i 30 minutter. Lysaterne blev centrifugeret ved 16.000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatanterne blev indsamlet til Western blot-analyse.

For at opnå udskilte proteiner blev cellekultursupernatanten uden cellerester opsamlet, udfældet natten over med 100% mættet ammoniumsulfat (01:01), og centrifugeret ved 16.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev kasseret. Pelleten blev resuspenderet i 100 pi PBS, dialyseres to gange med 0,05 M PBS i 24 timer, og derefter anvendt til Western blot-analyse.

Western blot-analyse blev udført under anvendelse af reduceret (med β-mercaptoethanol) eller ikke-reducerede ( uden β-mercaptoethanol) proteinprøver der blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK). Membranerne blev blokeret med Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 og 5% fedtfri mælk eller 5% bovint serumalbumin (til detektering phosphoproteiner) ved stuetemperatur i 2 timer, og blev inkuberet med primære antistoffer, såsom muse anti- human Ig μ mAb (Mabworks), gede-anti-humant Ig u polyklonalt antistof (Sigma, St. Louis, MO, USA), muse-anti-humant CD79A og CD79B mAb’er (Abcam, Cambridge, MA, USA), muse-anti-humant TLR9 mAb (IMGENEX), anti-phospho-PKC mAb, anti-phospho-Akt mAb, anti-phospho-ERK mAb, anti-phospho-IKB mAb, og anti-IKB-mAb (alle fra Cell Signaling, Danvers, MA, USA ), kanin-anti-ERK polyklonalt antistof (Kangcheng Biotech Co, Shanghai, Kina), og anti-actin mAb (Sigma), ved 4 ° C natten over. Membranerne blev vasket tre gange med Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 i 10 minutter hver, og inkuberet med IRDye 800- eller 700-konjugerede sekundære antistoffer (LI-COR Bioscience Inc., Lincoln, NE, USA) ved stue temperatur i mørke i 1 time. Signalet blev detekteret ved anvendelse af Odyssey Imaging System (LI-COR Bioscience).

intracellulært calcium Flux Måling

Måling af intracellulært calcium flux blev udført som tidligere beskrevet [42]. Kort fortalt blev HeLa MR-celler dyrket i specialiserede glas-bottom mikrobrønde retter (Mattek Corp., Ashland, MA, USA) og fyldt med 5 uM Fluo-3 /AM i HEPES-bufret saltvand ved 37 ° C i mørke i 30 minutter . Cellerne blev vasket med HEPES-bufret saltvand og stimuleret med 20 ug /ml gede-anti-humant IgM eller gede-IgG. Fluorescens blev overvåget ved 488 nm (excitation) og 530 nm (emission) ved anvendelse af en Leica TCS-NT konfokalt fluorescensmikroskop (Leica MicroImaging, Mannheim, Tyskland) med en 40 x olie nedsænkning linse (Wetzler, Heidelberg, Tyskland). Billeder blev indsamlet på 5 sekunder for fem gange før stimulering, og hver 1,5 sekund i 60 sekunder, derefter hver 5 sekunder i yderligere 120 sekunder. Målingen blev gennemført ved stuetemperatur, og hvert felt af celler blev udvalgt tilfældigt. Billederne blev analyseret for relativ fluorescens under anvendelse Leica konfokal software (Wetzler). Alle calciumflux assays blev udført i nærvær af ekstracellulært calcium og i fravær af EDTA eller EGTA i assay-buffere. Derfor blev intracellulært calcium frigivelse og ekstracellulært calcium tilstrømning analyseret.

Cell Behandling med ODN Stimulation

HeLa MR-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS før ODN-stimulering. Mediet blev derefter ændret til DMEM suppleret med 2% FBS, og 10 ug /ml af en stimulus, såsom phosphorthioat-modificerede, human-specifik CpG 2006 [5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 ‘], ikke-CpG-ODN kontrollerer CpG 2078 [5’-TGCTGCTTCCCCCCCCCCCC-3 ‘] og GPC [5′-TGCTGCTTTTG TGCTTTTGTGC TT-3′], eller neutraliserende CpG-N ODN208 [5’-TGCCGCGGCAGA-3 ‘]) blev tilsat med eller uden 10 pmol /l chloroquin ( Sigma) i 1 time af præinkubation før ODN blev tilsat. Efter 3 dage blev cellerne høstet til RT-PCR, flowcytometri, og Western blot analyse. Cellekultursupernatanten også blev opsamlet for Western-blot som beskrevet ovenfor.

MyD88 knockdown assay blev udført under anvendelse af syntetiseret MyD88 siRNAs som tidligere beskrevet [43]. SiRNA blev transficeret ind i HeLa MR cellelinje ved elektroporering. De ovennævnte stimulus (CpG 2006 CpG 2078, eller GPC) blev tilsat til cellekulturen 24 timer efter elecroporation, og cellerne blev høstet efter yderligere 3 dage RT-PCR, flowcytometri, og Western blot-analyser.

konfokal mikroskopi analyser

HeLa MR-celler blev stimuleret med eller uden gede-anti-humant Ig u polyklonalt antistof (20 ug /ml) i 5 minutter, og dobbelt farvet med PerCP /Cy5.5-konjugeret muse-anti-humant Ig μ (Biolegend, San Diego, CA, USA) og FITC-konjugeret muse-anti-humant CD79A (ABD SEROTEC, Kidlington, UK) eller FITC-konjugeret muse-anti-humant Ig μ og PE-konjugeret mus anti human CD79B (eBioscience). Cellerne derefter undergik konfokal mikroskopi analyse, og billederne blev indsamlet med en Axioskop-2 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), en 63 × NA 0,75 Plan Apochromat nedsænkning olie objektiv og standard filtersæt (Leica MicroImaging), en 1300 × 1030 pixel-afkølede charge-coupled device-kamera (CCD-1300-Y; Princeton Instruments, Trenton, NJ, USA), og Metavue software (Visitron Systems, Puchheim, Tyskland)

Analyse af Natural antistof Aktivitet af Epithelial. kræft Cell-afledt IgM

for at analysere, om epitel kræftcelle-afledt IgM har naturlig antistof aktivitet mod de mikrobielle antigener, såsom enkeltstrenget DNA (ssDNA), dobbeltstrenget DNA (dsDNA) eller lipopolysaccharid (LPS ) udførte vi antigen-specifikt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) under anvendelse af HeLa MR cellekultursupernatant indeholdende IgM. Mikrotiterplader blev overtrukket med 10 pg /ml ssDNA, dsDNA eller LPS (alle fra Sigma). Muse-anti-humant Ig μ mAb og HRP-mærket gede-anti-muse-IgG blev anvendt til påvisning af IgM, med tetramethylbenzidin som substrat. OD450 blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek, Winooski, VT, USA).

Vi udførte også indirekte immunfluorescensfarvning at analysere autoantistof aktivitet af epitelcancer celle-afledt IgM. Vi inkuberes HEP-2 celle slides (EUROIMMUN, Lübeck, Tyskland) med HeLa MR cellekultursupernatant indeholder IgM. Efter vask med PBS blev muse-anti-humant Ig μ mAb og FITC-konjugeret gede-anti-muse-IgG anvendes til at påvise positivt signal.

Statistical Analysis

Alle statistiske analyser blev udført med den statistiske software SAS version 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Forskelle mellem forskellige grupper blev beregnet ved Students

t

test eller chi-square test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

var. 0,05

Resultater

IgM er Hovedsageligt Udtrykt i humane epitelceller

Vi analyserede væv microarray af 202 vævsprøver for IgM udtryk ved immunhistokemi, herunder kræft eller normale væv af epitel, mesenkymale, og neuroglial oprindelse samt kønsceller (tabel S3). Vi fandt, at IgM blev udtrykt hyppigere i epitelceller, herunder 17 ud af 34 (50%) epitelcancerceller, især carcinomer i lunge, bryst, lever og bugspytkirtel (Figur 1A-D), og 23 af 66 (34,8% ) ikke-cancer epithelceller (fig 1E, F). I modsætning hertil ingen eller lavfrekvent IgM blev fundet i neoplastiske mesenkymale celler (1 ud af 47, [2,1%] herunder lipoma, fibrom, og leiomyom celler [Figur 1i]) og i normale mesenkymceller (1 ud af 34, [2,9 %]; herunder lipocytes, fibroblaster, og glatte muskelceller). Ingen af ​​de neuroglial celler vurderede udtrykte IgM (0 af 13, [0%]). Det er interessant, at IgM-ekspression blev detekteret i høje niveauer i seminom celler og i nogle normale kimceller i testiklerne (fig 1K, L). To tilfælde af T-celle lymfom havde nogen detekterbar IgM-ekspression, som forventet (fig 1J). Disse resultater antyder, at ikke-B-celle-afledt IgM findes hovedsageligt i epitelceller Salg

A, lungecancerceller.; B, brystcancerceller; C, liver cancer cells; D, bugspytkirtelkræftceller; E, nyretubuli epitelceller; F, endometrium epitelceller; G, nyretubuli epitelceller, farvet med gede-anti-muse-IgG-HRP kun, som en negativ kontrol; H, endometrium epitelceller, farvet med gede-anti-muse-IgG-HRP kun, som en negativ kontrol; I, leiomyoma celler; J, T-lymfomceller; K, seminom celler; L, spermatocytter.

For yderligere at bekræfte, at IgM udtrykkes af de epiteliale kræftceller, men ikke de infiltrerede B-celler, blev to-farve immunfluorescensfarvning udført på frosne epitel kræft væv slides, herunder tyktarmskræft , brystcancer, lungecancer og ovariecancer, med anti-IgM og anti-pan-cytokeratin antistoffer. Som vist i figur 2A, blev en signifikant co-lokalisering afsløret bewteen IgM og cytokeratin; Kun få B-celle infiltration blev detekteret i disse væv som demonstreret af IgM og CD19 dobbelt farvning (fig S1). Endvidere realtime PCR-analyse viste, at der ikke var nogen korrelation mellem niveauerne af IgM-transkripter og B-celle specifikke transkripter CD19 i disse væv, som de udtrykte højere niveauer af IgM end humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), men udtrykte temmelig lavere niveauer af CD19 end PBMC (figur 2B). Alle disse resultater antyder, at IgM positivt signal blev afledt af epitelcancerceller.

A, co-lokalisering i humane epiteliale cancere i IgM og cytokeratin. Humane epiteliale cancere, herunder coloncancer, brystcancer, lungecancer og ovariecancer, var dobbelt farvet med anti-humant IgM (rød), anti-humant pan-cytokeratin (grøn), og Hoechest 33342 (blå). Den co-lokalisering af IgM og cytokeratin blev vist (gul). Coloncancer farvet med TRITC-konjugeret ged anti-mus IgG og Alexa Fluor® 488-konjugeret gede anti-kanin IgG kun blev anvendt som en negativ kontrol. B, der var ingen korrelation mellem niveauerne af IgM-transkripter og B-cellespecifikke CD19 transkripter i humane epiteliale cancere. Humane epiteliale cancere, herunder coloncancer, brystcancer, lungecancer og ovariecancer blev underkastet QRT-PCR-analyse af IgM og CD19-ekspression. Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) blev anvendt som positiv kontrol for IgM og CD19-ekspression.

IgM er Vidt Udtrykt i flere humane epithelial kræftceller

Vi har tidligere fundet ekspression af monoklonale, omlejrede Ig μ i HeLa S3 og HT-29-celler [8]. For at bestemme om IgM bredt blev udtrykt i ikke-B-celler, især epitelceller cancercellelinier, vurderede vi ekspressionen af ​​Ig u-og Ig K-gener i fire humane epiteliale cancercellelinier (cervikal cancercellelinier HeLa og HeLa MR, coloncancer celle SW480 og hepatisk cancer HepG2), en osteosarcom-cellelinje (U-2 OS), og to humane embryonale nyre cellelinier (293 og 293T) ved RT-PCR. Raji-celler blev anvendt som positiv kontrol. Resultaterne viste, at Ig u-og Ig K-transkripter blev detekteret i alle disse cellelinier (GenBank No. FJ197674, figur 3A). Sekvensanalyse afslørede, at Ig κ havde en dominerende Vκ4-1 /Jκ3 rekombination mønster (data ikke vist).

A, påvisning af Ig u-og Ig K udskrifter i flere cancer cellelinjer af semi-nested RT PCR. HeLa og HeLa MR, cervikale cancercellelinier; SW480, coloncancercellelinie; U-2 OS, osteosarcomcellelinie; HepG2, hepatisk cancer cellelinje; 293 og 293T, humane embryonale nyre cellelinier. Raji, human B lymfocytisk leukæmi cellelinje, som positiv kontrol; GAPDH, intern kontrol. B, flowcytometri under anvendelse af muse-anti-humant Ig μ mAb viste, at IgM blev lokaliseret ikke alene på plasmamembranen, men også i cytoplasmaet i epitelcancerceller, især HeLa MR-celler. Rød linje, isotypekontrol IgG1; Blå linie, anti-humant IgM. C, Konfokal mikroskopi-analyse af HeLa-celler under anvendelse MR muse-anti-humant Ig μ mAb viste, at IgM var til stede både på cellemembranen og i cytoplasmaet. Mus IgG, som isotypekontrol. D, hele IgM blev detekteret i HeLa-celler MR ved ikke-reducerende SDS-PAGE (uden β-mercaptoethanol) og Western blot med gede-anti-humant Ig u polyklonalt antistof. Humant IgM, som positiv kontrol. E, IgM-ekspression blev detekteret i HeLa-celler MR ved reducerende SDS-PAGE (med β-mercaptoethanol) og Western blot med muse-anti-humant Ig μ mAb. Humant IgM, som positiv kontrol; p-actin, intern kontrol. F, IgM blev også påvist i det kulturelle supernatanten af ​​HeLa MR celler ved reducerende SDS-PAGE og Western blot under anvendelse af muse-anti-humant Ig μ mAb. Humant IgM, som positiv kontrol; Medium, som negativ kontrol.

Flowcytometrianalyse afslørede membranøs og cytoplasmatisk ekspression af IgM i HeLa MR-celler, og lidt eller ingen ekspression af membranøs IgM med lav ekspression af cytoplasmatisk IgM i HeLa og HepG2-celler ( Figur 3B). Derefter HeLa MR blev valgt som en celle model for yderligere analyse. Konfokal mikroskopi bekræftede lokalisering af IgM at være på membranen og i cytoplasmaet (figur 3C). Reducerende og ikke-reducerende Western blot-analyse afslørede ekspressionen af ​​IgM i cellerne samt cellekultursupernatanten (figur 3D-F).

Som en af ​​de vigtigste kontroller, fandt vi, at ingen af ​​de cancercellelinjer vurderede udtrykte overflade CD19 undtagen Raji-celle, der blev anvendt som en positiv kontrol (fig S2). Disse resultater udelukke muligheden for forurening af kræft cellelinjer af B-lymfocytter.

Angivelse af BCR-lignende Complex i Humane epitelcancerceller

CD79A og CD79B, to B-celle specifikke molekyler, er fysisk knyttet til membranøs IgM på overfladen af ​​B-celler, der danner B-celle-antigen receptor (BCR) kompleks. For at løse hvorvidt CD79A og CD79B også er knyttet til epitel cancercelle-afledte IgM, danner en BCR-lignende kompleks, vi først undersøgt, om disse molekyler kan udtrykkes af disse celler. Ved RT-PCR og Western blot-analyser, demonstrerede vi ekspressionen af ​​CD79A og CD79B i epitelcancerceller (figur 4A, B). Brug HeLa MR som en celle model, vi yderligere bekræftet, at disse molekyler blev co-lokaliseret med membranøs IgM (figur 4C). Vigtigere, blev det bemærket, før stimulering blev BCR-lignende kompleks fordeles ensartet på epitelcancerceller. Efter stimulering, anti-IgM-antistof tværbundet BCR-lignende kompleks i små og store pletter (figur 4C) og inducerede en forøgelse af calcium flow (figur 4D). Desuden BCR nedstrøms signalveje, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt og phospholipase C (PLC) -γ2-PKC, blev aktiveret efter stimulering med anti-humant IgM (figur 4E). Taget sammen antyder disse resultater, at CD79A og CD79B er knyttet til membranøs IgM på overfladen af ​​epitelcancerceller, danner en BCR-lignende kompleks, som kan mediere signaler, der fører til vækst og overlevelse af de epiteliale cancerceller.

A udviste RT-PCR at CD79A og CD79B blev påvist i humane cancercellelinier, U-2 OS, HT-29, HeLa MR og HeLa, og at der var to isoformer for både CD79A og CD79B. Raji, som positiv kontrol; GAPDH, intern kontrol. PCR-produkterne blev separeret ved gelelektroforese på 1% agarose og blev yderligere bekræftet ved DNA-sekventering. B, Western blot-analyse viste tilstedeværelsen af ​​den større isoform af CD79A og CD79B. p-actin, intern kontrol. C, konfokal mikroskopi analyse viste co-lokalisering (gul) CD79A (FITC, grønne) og Ig M (PerCP /Cy5.5, rød) (øverste to paneler) eller CD79B (PE, rød) og Ig M (FITC, grøn) (nederste to paneler) i HeLa MR-celler med eller uden stimulering med anti-IgM. D, calcium flux analyse ved konfokal mikroskopi i HeLa MR-celler fyldt med Fluo-3 /AM og stimuleret med gede-anti-humant IgM (a) eller gede-IgG som isotype controle (b). Billeder blev fanget efter stimulering for 0, 1, 15, 30, 60 og 150 sekunder. Den tilsvarende tidsforløbet for calciumflux vises. Den relative fluorescens fra billederne blev estimeret med Leica konfokal software. Hver linie repræsenterer signal afledt fra en enkelt celle. E, phosphorylering af PKC og AKT nedstrøms for PLC-γ2 og PI3K signalveje henholdsvis blev detekteret i HeLa MR-celler efter stimulering med 20 ug /ml gede-anti-humant IgM i 5 og 15 minutter.

Analyse af Natural antistof aktivitet for human epithelcancer Cell-udskilt IgM

den spontane udtryk for IgM i de menneskelige epiteliale kræftceller uden tegn på infektion eller anden stimulering opfordrede os til at afsløre, om de har den aktivitet af naturlige IgM. Til dette formål, testede vi evnen hos HeLa MR-celleafledt IgM at anerkende ssDNA, dsDNA, og LPS. Ved ELISA, opdagede vi, at HeLa MR celle-udskilte IgM anerkendt alle disse tre antigener (figur 5A-C). Desuden er denne IgM havde autoantistof aktivitet og erkendte veldefinerede autoantigener i kernen, cytoplasmaet, og cytoskelettet af HEp-2-celler (figur 5D).

A-C, viste ELISA at udskilt IgM i kultur