Abstrakt
Vrøvl-medieret mRNA Decay (NMD) nedbryder mutant mRNA indeholder præmatur termineringskodon (PTC-mRNA). Her vurderer vi konsekvensen af NMD aktivitet i kolorektale cancere (CRCs), der viser mikrosatellit instabilitet (MSI), hvis progression er forbundet med akkumuleringen af PTC-mRNA’er, der koder for immunogene proteiner på grund rammeskift mutationer i kodende gentagelsessekvenser. Inhibering af UPF1, en af de vigtigste NMD faktorer, blev opnået ved siRNA i HCT116 MSI CRC cellelinie, og de resulterende ændringer i genekspression blev undersøgt under anvendelse af ekspressions microarrays. Virkningen af NMD aktivitet blev også undersøgt i primære MSI CRC’er ved at kvantificere ekspression af flere mRNA i forhold til deres mutationsstatus og til endogene UPF1 og UPF2 udtryk. Værtsimmunitet udviklet mod MSI cancerceller blev værdsat af kvantificerer antallet af CD3e-positive tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL’er). UPF1 silencing førte til opregulering af 1251 gener i HCT116, blandt hvilke en del af dem (dvs. 38%) væsentligt højere end forventet ved et tilfælde indeholdt en kodende mikrosatellit (
P
2 × 10
-16). I MSI primære CRC’er, UPF1 var betydeligt over-udtrykt i forhold til normal tilstødende slimhinde (
P
0,002). Vores data fremlagt beviser for differentieret henfald af PTC-mRNA sammenlignet med vildtype, der var positivt korreleret til UPF1 endogen udtryk niveau (
P
= 0,02). Der blev observeret en negativ effekt af UPF1 og UPF2 udtryk på værtens anti-tumor respons (
P
0,01). Samlet set vores resultater viser, at NMD dybt påvirker MSI-drevet tumorigenese på molekylært niveau og indikerer en funktionel negative indvirkning dette system på anti-tumor-immunitet, hvis intensitet er blevet gentagne vist sig at være en uafhængig faktor for gunstigt resultat i CRC’er.
Henvisning: El-Bchiri J, Guilloux A, Dartigues P, Loire E, Mercier D, Buhard O, et al. (2008) Nonsens-medieret mRNA Decay Impacts MSI-Driven Carcinogenese og anti-tumor immunitet i tarmkræft. PLoS ONE 3 (7): e2583. doi: 10,1371 /journal.pone.0002583
Redaktør: Cathal Seoighe, University of Cape Town, Sydafrika
Modtaget: April 2, 2008; Accepteret: 28. maj 2008; Udgivet: 9 juli 2008
Copyright: © 2008 El-Bchiri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra foreningen pour la Recherche contre le Cancer (kredit nummer 3946). JEB, EL og PDLG var modtagere af et stipendium fra Ministère Français de la Recherche (MRT)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
nonsens-medieret mRNA henfald (NMD) er en evolutionært bevaret mRNA overvågning mekanisme, der genkender og eliminerer afvigende mRNA’er huser præmature termineringskodoner (PTC) og derved forhindre akkumulering af potentielt skadelige trunkerede proteiner i eukaryote celler [1]. Efter præ-mRNA splejsning, er NMD mål genkendes via en multiproteinkompleks exon-junction-kompleks (EJC), der er deponeret 24 nukleotider opstrøms for hver exon-exon junction. Som en generel regel, er det blevet fastslået, at afvigende mRNA indeholder PTC placeret enten mindre end 50-55 nukleotider opstrøms for sidste exon-exon vejkryds eller i den sidste exon ikke nedbrydes af NMD (NMD-irrelevant) [2]. Kernen i NMD effektorer omfatter de evolutionære-bevaret UPF proteiner, UPF1 /RENT1, UPF2 /RENT2 og to paraloger af UPF3, UPF3 (også kaldet UPF3a) og UPF3X (også kaldet UPF3b). UPF1 er et RNA helicase hvis aktivitet er reguleret af cyklusser af phosphorylering /dephosphorylering. Phosphorylering af UPF1 kræver UPF2 og UPF3 og katalyseres af SMG1, en proteinkinase relateret til phosphoinositid-3-kinase-familien. UPF1 fosforylering af SMG1 har vist sig at være det hastighedsbegrænsende trin i NMD [3], [4]. Det er bemærkelsesværdigt, at SMG1 aktivitet ikke kun helliget NMD men også spiller en rolle i DNA-skader signalering og reparation, især ved phosphorylering p53 [5]. Dephosphorylering af UPF1 medieres af SMG5, SMG6 og SMG7, tre proteiner, der fungerer som adaptorer mellem phosphoryleret UPF1 og proteinphosphatase 2A [3]. UPF1 funktion er afgørende i NMD, mens UPF3 og UPF3X er delvist overflødige [6] og UPF2 kan undværes i nogle tilfælde tyder eksistensen af en UPF2-uafhængig NMD vej [7]. UPF1 optræder ikke kun i NMD-medieret nedbrydning af afvigende transkripter men også i det fysiologiske henfald af forskellige mRNA’er, regulering af ekspressionen af 3-10% af transkriptomet [8], [9]. Nedregulering af UPF1 og i mindre grad UPF2 er blevet rapporteret at modulere ekspressionsniveauet af en række fysiologiske substrater af NMD, herunder transkripter med opstrøms åbne læserammer i 5′-utranslaterede region, transkripter indeholdende en intron i deres 3′ utranslateret region samt transkripter afledt af transposon eller endogene retrovirus [8], [10]. NMD har også været foreslået at spille en rolle i reguleringen af alternative splejsningsbegivenheder, eftersom sekvens-baserede analyser forudser, at omkring 35% af mammale alternative splejsningsbegivenheder producerer PTC-holdige splejsede varianter. Alligevel er det for nylig blevet rapporteret, at de fleste PTC-holdige splejsningsvarianter produceres i lave niveauer i humane celler, uafhængigt af virkningen af NMD, hvilket antyder, at de fleste af sådanne PTC-indførelse begivenheder ikke under positivt selektionstryk og derfor ikke forventes at bidrage funktionelle roller [11].
til dato, konsekvenserne af NMD aktivitet er hovedsageligt undersøgt i monogene arvelige sygdomme, herunder arvelige tumorer [12]. NMD er blevet rapporteret at beskytte heterozygote bærere fra de skadelige virkninger af nogle afvigende PTC-mRNA’er, der koder trunkerede proteiner med dominant-negative aktivitet [12]. Omvendt har NMD manglende evne i nedværdigende NMD-irrelevante udskrifter blevet foreslået at favorisere den fænotypiske udtryk af dominerende arvelige sygdomme [12]. Fordi cancerceller er genetisk ustabile og akkumulere mange somatiske rammeforskydningsmutationer i gener med en forventet rolle i celle transformation, er blevet foreslået NMD system til at spille en rolle i tumorudvikling [12]. Men vurderingen af den samlede indvirkning på denne proces har været dårligt beskrevet og forbliver svært at definere, da det afhænger af arten og antallet af mutanter akkumuleret i kræftceller under tumor progression. Til dato har NMD inhibering med held blevet anvendt som en
in vitro
strategi for at opdage nye cancerrelaterede gener huser trunkering mutationer, hvilket antyder, at det faktisk kan spille en rolle i at favorisere udvælgelsen af nogle hyppige mutationsbegivenheder i forskellige tumortyper [13]. Det er bemærkelsesværdigt, at NMD aktivitet har vist sig at være meget varierende, hvilket fører til ufuldstændig og differentiel henfald -sagerne NMD-relevante mRNA’er indeholdende en PTC (benævnt NMD-escape) [14], [15], [16].
MSI tumorer huser mismatch repair (MMR) mangel er hyppige hos mennesker. De repræsenterer ca. 15% af sporadisk kolorektal, mave- og endometrie tumorer og omfatter neoplasmer opstår i Arvelig Non polypose kolorektal cancer (HNPCC) syndrom. Snesevis af mutationer påvirker gener indeholder kodning gentagne sekvenser er blevet rapporteret i disse tumorer, der definerer den såkaldte mutator vej, hvis rolle er mistænkt for at være afgørende i MSI-drevet tumorigenese [17]. Til dato har et stort antal publikationer rapporterede rammeskift mutationer i gener involveret i forskellige biologiske veje såsom cellecyklusregulering (fx
TGFBR2
,
IGF2R
,
TCF4
,
AXIN2
,
PTEN
,
RIZ
), apoptose (f.eks
BAX
,
CASP5
,
BCL10
,
APAF1
,
FAS
), DNA skader reparation (f.eks
ATR
,
DNA-PKcs
,
RAD50
,
MSH3-
,
MSH6
,
MBD4
,
MLH3
,
BLM
,
CHK1
) og andre [17]. Vi rapporterede for nylig, at henfaldet af læserammeskiftemutation-afledte mRNA efter
in vitro
lyddæmpning af UPF1 og /eller UPF2 i et panel af MSI CRC cellelinjer var forskellen og ufuldstændige [14]. Hvis ikke fuldt nedbrudt, frameshift mutant mRNA koder for proteiner, der indeholder afvigende C-terminale haler, blandt hvilke nogle har vist sig at vise immunogene egenskaber [18], [19]. Flere undersøgelser har understreget, at der i overensstemmelse med denne proces, blev MSI tumorer markant infiltreret af cytotoksiske intra-epitel tumor-infiltrerende T-lymfocytter (tils) og at en sådan et cellulært immunrespons var prædiktiv for en relativt gunstigt resultat uafhængigt af den oprindelige tumor scenen og andre kliniske faktorer [20]. Derfor kan NMD aktivitet interferere med anti-tumor-immunitet ved at begrænse ekspressionen af nogle af disse afvigende proteiner. Brug MSI kolorektal cancer som en model, vi sigter her på yderligere at undersøge den rolle, NMD i onkogenese.
Resultater
Transkriptomet skifter sekundært til UPF1 tavshed i HCT116 CRC celler og deres forhold til mikrosatellit ustabilitet
Brug Affymetrix GeneChip® Menneskelig Exon 1.0 ST genekspression arrays, blev fundet ekspression af 1363 gener for deregulering betydeligt ved UPF1 lyddæmpning i HCT116 (MSI) CRC cellelinje, med en fold ændring ≥1.5 forhold til ubehandlede celler (tabel S1). Med 111 andre blev UPF1, som forventet, en af de gener for at være betydeligt nedreguleret. Niveauet af hæmning var signifikant ( 75%) og aftalt godt med vores data opnået ved real-time kvantitativ RT-PCR (data ikke vist). Samlet, 1251 gener var opreguleret ved UPF1 silencing (1251/1363, dvs. 92% af alle deregulerede gener under disse betingelser), blandt hvilke 472 (38%) indeholdt en mononukleotid repeat sekvens på mindst 7 basepar i den kodende region (tabel S2). Af interesse er det samlede antal af gener i det humane genom med en kodende repeat tarmkanalen ≥7N er lavere (4470/22218;. 20% data ikke vist), hvilket gør betydeligt højere end forventet ved en tilfældighed det samlede antal af sådanne målgener op- reguleret i HCT116 på UPF1 lyddæmpning (
P
2 × 10
-16, Chi2-test).
Blandt de førnævnte 472 gener i HCT116 celler, 22 gener, som indeholder en kodning mononukleotid gentagelse af 7 til 10 nucleotider blev valgt på grund af deres formodede rolle i colorektal carcinogenese og screenet for insertion /deletion mutationer i disse celler (tabel 1). Alle disse gener, men 3 (
MBD4
,
MSH3-
,
TGFBR2
) havde aldrig blevet rapporteret at være muteret i MSI CRC’er (tabel 1). Ved hjælp af denne metode, vi har registreret eller bekræftet homozygote mutationer i
SLC35F5
,
TGFBR2
,
ARV1
,
MSH3-
,
SMAP1
gener og heterozygote mutationer i
MBD4
,
EFHC1
,
TTC3
, og
WDR19
gener (figur 1a). Alle de tilsvarende mutante mRNA’er rummede et PTC placeret i kodende regioner, som kan være tilbøjelige til NMD. Desuden observerede vi, at 4 andre målgener med tidligere beskrevet heterozygote læserammeforskydningsmutationer i HCT116 (
BAX
,
RECQL
,
RAD50
MSH6
) blev ikke signifikant re-udtrykte efter UPF1 lyddæmpning (figur 1a). De re-udtryk satser for PTC-mRNA fremkaldt af UPF1 tavshed i HCT116 er vist i figur 1a og understrege, at, som beskrevet [14], UPF1-medieret mRNA henfald varierer meget inden for en række endogent muteret PTC-mRNA selv allelspecifikke udtryk analyser blev ikke brugt til at skelne mellem muterede og vildtype mRNA i tilfælde af heterozygote rammeskift ændringer.
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3-
,
SMAP1
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
MSH6
harbor homozygote eller heterozygote læserammeforskydningsmutationer i HCT116 MSI CRC cellelinje. Brug af udtrykket array, fold ændringer i ekspressionen af de tilsvarende mRNA’er forhold til UPF1 silencing blev bestemt (fold ændring = E
mRNA i celler behandlet med en UPF1 siRNA /E
mRNA i celler behandlet med kontrol siRNA). Gener, der er understreget, er dem, hvis re-ekspression var signifikant i disse betingelser (1,5 fold-change op med en p-værdi ≤0.005). kunne derfor opnås evidens for variabel følsomhed over for UPF1-medieret henfald af sådan PTC-mRNA’er, selvom allelspecifikke ekspressionsassays ikke blev anvendt til at skelne mellem muterede og vildtype mRNA’er i tilfælde af heterozygote rammeskift ændringer. b. Kodning rammeskift mutationer i målgener forhold til NMD-status i MSI primære CRCs. Hyppigheden af rammeskift mutationer af den samme serie af 13 målgener til ustabilitet i 44 MSI primære CRC’er er repræsenteret. Target gener, hvis rammeskift mutationer ofte udvalgt til under MSI CRC progression havnen forskellige følsomheder til UPF1-medieret forfald.
rammeskift mutationer i MSI primære CRC’er efter deres NMD status
Alle målgener muteret i HCT116 for som tidligere var blevet bestemt virkningen af NMD blev screenet for læserammeforskydningsmutationer i kodning mikrosatellit sekvenser i en serie af primær MSI CRCs (n = 44). Dette omfatter gener, hvis muterede mRNA er mere eller mindre følsomme over for NMD (
TGFBR2
,
SLC35F5
,
ARV1
,
MSH3-
,
TTC3
,
EFHC1
,
MBD4
,
SMAP1
,
WDR19
,
BAX
,
RECQL
,
RAD50
,
MSH6
) (figur 1a). De mutation frekvenser af disse 13 gener, der repræsenterer mulige mål for MSI-drevet ustabilitet var meget variabel i disse tumorer (figur 1b). Baseret på deres høje mutation frekvens,
SLC35F5
,
ARV1
,
TTC3
, og
SMAP1
repræsentere nye målgener hvor læserammeforskydningsmutationer har ikke tidligere blevet rapporteret i MSI CRC. De blev muteret i 48% (21/44), 23% (10/44), 32% (14/44) og 73% (32/44) af tumorer, (figur 1b).
over-ekspressionen af UPF1 mRNA i MSI primære CRC’er
Ved at måle niveauet af UPF1 og UPF2 mRNA ved real-time kvantitativ RT-PCR i en anden uafhængig serie af MSI primære CRC’er som vi også opnået prøverne svarende til matchende normal slimhinde, observerede vi en ca. 7 fold overekspression af UPF1 i tumorer (n = 25) sammenlignet med normal slimhinde (
P
= 0,0015; parret t-test) (figur 2). Eftersom kvantificering (7 gange) af overekspression har skal tages med forsigtighed på grund af den lille mængde data, vi bekræftet, at UPF1 mRNA blev faktisk over-udtrykt i MSI primære CRC’er ved at udføre en kvalitativ chi-square test, der er robust over for ekstreme værdier. Ved hjælp af denne metode, at antallet af tilfælde, hvor UPF1 udtryk var højere i tumorer i forhold til at matche normal slimhinde (N = 20/25) var signifikant anderledes end forventet tilfældigt (
P
= 0,009; chi-square test ). Disse data er illustreret på figur 2, hvor 20 og 5 åbne cirkler repræsenterer MSI tumorprøver overudtrykker UPF1 eller ej henholdsvis er repræsenteret over en doted linje symboliserer ekspressionen af dette NMD faktor i normal slimhinde. Af interesse, blev en trend for overekspression af denne faktor også observeret i ikke-MSI (MSS) CRC’er (n = 31) i de samme betingelser (
P
= 0,08; parret t-test) (figur 2). I modsætning hertil blev UPF2 ikke udtrykkes forskelligt i enten MSI eller MSS CRC’er forhold til at matche normal slimhinde (
P
= 0,56 og 0,83, henholdsvis; parret t-test). (Figur 2)
i 25 MSI og 31 MSS CRC’er sammenlignet vi udtryk for UPF1 og UPF2 mellem tumorer og matchede normale colon mucosa af real-time kvantitativ RT-PCR. I alle, men 5 sager, overekspression af UPF1 blev observeret i MSI CRC tumorer. I betragtning af alle prøver, at overekspression af UPF1 i MSI tumorer var statistisk signifikant (
P
= 1,5 × 10
-3; parret t-test). I MSS CRC’er, en tendens til overekspression af denne faktor blev observeret under de samme betingelser (
P
= 0,08; parret t-test). Hos patienter med MSI eller MSS CRC’er blev UPF2 ikke differentielt udtrykt mellem tumor og matchende normal slimhinde (
P
= 0,56 og
P
= 0,83, henholdsvis; parret t-test).
Betydelig henfald af læserammeskiftemutation-afledt mRNA der er afhængige af UPF1 udtryk i MSI primære CRC’er
i vores serie af 44 primære MSI CRC’er, vi yderligere bestemmes den relative
in vivo
udtryk for 18 MSI målgener af real-time kvantitativ RT-PCR ved hjælp eksperimentelle betingelser, som vi tidligere har fastlagt i en serie af CRC cellelinier (
ATR
,
BAX
,
BLM
,
CBF2
,
CDX2
,
GRB14
,
GRK4
,
IGF2R
,
MBD4
,
MSH3-
,
MSH6
,
RAD50
,
RBBP8
,
RECQL
,
RIZ
,
TCF4
,
TFDP2
,
TGFBR2
) (Figur 3 og også tabel S3 for mutationsstatus af disse 18 gener i MSI CRC’er) [14]. For alle gener undtagen 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), en tendens til, at henfald af mutant sammenlignet med vildtype-mRNA blev observeret. Henfald af mutant mRNA forhold til vild typer var signifikant for MSH6 (
P
= 0,02; t-test) og næsten signifikant for et par andre kun, f.eks BAX (
P
= 0,08), CDX2 (
P
= 0,10), MSH3- (
P
= 0,10), RIZ (
P
= 0,10 ) og TFDP2 (
P
= 0,10), hvilket giver evidens for differentieret henfald af PTC-mRNA i forhold til vildtype i vores serie af primære CRC’er, som allerede er beskrevet i en række MSI CRC cellelinjer [14] (figur 3). Samlet set var der en meget signifikant henfald af PTC-mRNA i MSI primære CRC’er (
P
10
-4, t-test; afsnit se “Materialer og metoder” for Statistiske analyser ). Som indirekte bevis på det bidrag, NMD, blev den samlede intensitet af denne proces i MSI primære CRC’er positivt korreleret til den endogene UPF1 udtrykket niveau (
P
= 0,02, t-test, se “Materialer og metoder “for statistiske analyser), mens effekten af UPF2 var ikke signifikant (
P
= 0,72, t-test) (data ikke vist).
∂Ct værdier er angivet i forhold til den mutationsstatus af hvert gen i de 44 MSI primære CRCs (vildtype og muterede tumorprøver er angivet med hvide cirkler og sorte trekanter, henholdsvis). For hvert gen blev mellemstore værdier af ∂Ct relateret til vildtype (hvid pil) eller muterede (sort pil) tumorprøver beregnes. For alle gener undtagen 3 (
CDX2
,
GRB14
,
TFDP2
), en tendens til, henfald af mutant i forhold til mRNA vildtype blev observeret (∂Ct værdier er omvendt proportional med genekspression). Samlet set giver dataene tegn på signifikant henfald af PTC-mRNA i forhold til vildtype mRNA
in vivo
i MSI primære CRC’er (
P
10
-4, student
t
-test).
UPF1 og UPF2 er negative prædiktive faktorer i værtens immunrespons mod MSI CRC’er
med undtagelse af
TCF4
, blev ingen signifikante positive korrelationer fundet mellem den endogene udtryk for PTC-mRNA og tilstedeværelsen af CD3e-positive TIL’er i tumorer (
P
TCF4 = 0,06; bootstrapped t-test) (data ikke vist ). Sammenhængen mellem antallet af TIL’er og udtryk for UPF1 og UPF2 var ikke lineær, men log-lineær. Således blev indflydelse UPF1 og UPF2 udtryk på antallet af TIL’er undersøgt
via
en Wald test og koefficienterne i Poisson regressionsmodel blev anslået via iterativt re-vægtede mindste kvadraters metode. Baseret på disse observationer blev en negativ effekt af UPF1 og UPF2 udtryk på det samlede antal CD3e-positive TIL’er påvist (
P
0,01 for UPF1 og UPF2, Wald test). En matematisk model korrelere antallet af CD3e-positive TIL’er med ekspressionen af disse NMD faktorer i MSI CRCs blev etableret, forudsiger, at TIL’er steg med omkring 30%, når ekspressionen af UPF1 blev halveret.
Disse data er illustreret for UPF1 og UPF2 i figur 4; tumor prøver, hvor UPF1 og UPF2 udtryk er lav (under gennemsnittet) præsenterede med variable satser CD3e positiv-TIL’er mens tumor prøver, hvor UPF1 og UPF2 udtryk er høj (over gennemsnittet) viste sig at være næsten altid karakteriseret ved en lav CD3 tælle, hvilket gør UPF1 og UPF2 mulige markører for dårlig anti-tumor immunitet i MSI primære CRC’er.
det samlede antal CD3e positiv-TIL’er var signifikant relateret til den endogene udtryk for UPF1 og UPF2 i denne serie af 44 MSI primære CRC’er (
P
0,01; Wald test). Af interesse, mens tumor prøver, hvor UPF1 og UPF2 udtryk var lav (under gennemsnittet) præsenteret med variable satser CD3e positiv-TIL’er, tumor prøver, hvor UPF1 og UPF2 udtryk var høj (over gennemsnittet) blev næsten altid karakteriseret med lav CD3 count (dårligt immunogene CRC’er). Disse data gør UPF1 og UPF2 specifikke markører for dårlig anti-tumor immunitet i MSI primære CRCs. CD3 protein immunfarvning er præsenteret for 2 MSI primære CRC prøver viser enten lav CD3 tæller og høj UPF1 og UPF2 udtryk (venstre) eller høj CD3 tæller sammen med lav UPF1 og UPF2 udtryk (til højre).
Diskussion
ved at evaluere en lang række target gener, der blev muteret med variabel rente i deres kodning gentagne sekvenser, vi viser en betydelig nedbrydning af den tilsvarende mutant mRNA i forhold til vildtype i MSI primære CRC’er med en betydelig indvirkning på endogen udtryk for UPF1 i denne proces, med UPF2 spiller en mindre rolle i processen, som for nylig beskrevet af vores gruppe i en serie af MSI CRC cellelinjer [14]. Taget én efter én, observerede vi en signifikant eller næsten signifikant henfald af kun nogle mutant mRNA forhold til vild typer, og det er ikke overraskende, da: (i) som for nylig udgivet af vores gruppe, NMD indvirkning på ekspressionen af læserammeskiftemutation-afledte mRNA’er varierer meget fra den ene mutant til en anden [14]; (Ii) frekvenser af target genændringer var meget varierende og til tider meget lav i vores tumor serien; (Iii) nogle mutanter især
(TCF4)
er NMD-irrelevant. I denne undersøgelse har vi også undersøge storskala genekspression ændringer i MSI CRC-celler i forbindelse med NMD inhibering under anvendelse af en specifik metode, der viser, at det førte til opregulering af 1251 gener i HCT116, blandt hvilke en del af dem signifikant højere end forventet tilfældigt indeholdt en kodende mikrosatellit. Selvom ikke alle af dem forventes at være muteret i MSI CRC-celler, som vist her på en kort række opregulerede målgener, kan det fremføres, at UPF1 er særlig relevant til modulering af ekspressionen af dusinvis af gener muteret i MSI CRC celler. Samlet set har disse data bekræfter for første gang, begge
in vitro
in vivo
, at NMD dybt påvirker MSI-drevet tumorigenese på det molekylære niveau.
Som muligt funktionelt konsekvens af NMD aktivitet
in vivo
i MSI tumorigenese, vi undersøgt, om aktiviteten af dette system modulerer anti-tumor immunitet. Af interesse, blev den eneste læserammeskiftemutation hvis tilstedeværelse signifikant associeret med et højere antal TIL’er i MSI CRCs var i
TCF4
, den eneste NMD-irrelevant målgen undersøgt i vores serie som dens kodende gentagelsessekvens er beliggende inden sin sidste exon. Desuden blev en omvendt korrelation mellem UPF1 og UPF2 ekspression og antallet af CD3e-positive TIL’er observeret i MSI CRCs, og en matematisk model, der forbinder antallet af CD3e-positive TIL’er til ekspressionen af NMD faktorer i MSI CRCs forudsagt, at TIL’er steg med omkring 30%, når ekspressionen af UPF1 eller UPF2 blev halveret. Disse data indikerer, at NMD kan påvirke negativt værtens immunitet mod MSI tumorceller i en kumulativ måde
via
kontrast og ufuldstændig nedbrydning af muterede udskrifter koder immunogene peptider. Det kunne spekuleret i denne sammenhæng, at UPF faktorer kan være specifikke markører for dårlig immunitet i MSI primære CRCs. I lyset af disse resultater, kan det således fremføres, at den førnævnte negative virkninger af NMD på immunsystemet proces udviklet af værten mod MSI tumorceller ville være effektiv, når NMD faktorer er overudtrykt og særdeles aktiv i nedværdigende de mange PTC- mRNA’er der koder for immunogene peptider, som er syntetiseret i MSI CRCs. I modsætning hertil kan det antages, at, når de udtrykkes ved lavere hastigheder, ville NMD faktorer være ineffektivt til forebyggelse af udviklingen af et immunrespons anti-tumor hvis intensitet vil afhænge af antallet og arten af rammeskift ændringer akkumuleret i MSI cancerceller. Disse fund kan være af klinisk interesse, da, som tidligere nævnt, anti-tumor immunitet anses generelt som en uafhængig faktor, hvis intensitet er konsekvent blevet påvist at være prædiktiv for gunstigt resultat uafhængigt af den indledende colon tumor stadium og andre kliniske faktorer [20] .
Da effektiviteten af NMD for nedværdigende mutant mRNA fra målgener varierer meget, vi for nylig foreslået, at NMD kan derfor spille en vigtig rolle i udvælgelsen af mål genmutationer med en funktionel rolle i MSI carcinogenese [14 ]. Det er bemærkelsesværdigt, at der blandt de gener opreguleret på UPF1 lyddæmpning, fire endnu ikke rapporteret målgener (
SLC35F5
,
TTC3
,
ARV1
SMAP1
) er her påvist at være hyppigt muteret i vores serie af MSI primære CRCs. Blandt dem,
SMAP1
, for Stromal Membrane Associated Protein-1, har tidligere været rapporteret til at deltage i kromosomale rearrangementer med
MLL
i blodkræftsygdomme [21]. Med en hyppighed 73% af rammeskift ændringer i MSI primære CRCs, herunder homozygote mutationer i fem CRC prøver (data ikke vist), er det en af de hyppigst muterede målgener i MSI CRCs sammen med
TGFBR2
ACVR2
[17]. I overensstemmelse med vores tidligere resultater, og dem, der opnås ved Ionov et
al.
Bruge emethine som uspecifik inhibitor af NMD-systemet [14], [22], bekræftede vi i denne undersøgelse, at
TGFBR2
PTC-mRNA nedbrydes gennem NMD i MSI CRC-celler. I en nylig papir, du et
al.
[23] rapporterede modstridende data, hævder, at dette mål gen samt
MSH3-
undslippe NMD i HCT116 cellelinie. De præsenterede resultater på en række PTC-mRNA’er viser disse transkripter var enten helt følsomme eller fuldstændigt resistente over for NMD i MMR-defekte celler. Deres data blev opnået ved at udføre ekspressionsassays der var hverken kvantitativt eller allel-specifik. I den samme undersøgelse, disse forfattere også foreslået en systematisk translationel undertrykkelse af trunkerede proteiner fra læserammeskiftemutation-afledte mRNA, der undslap NMD (NMTR for “Vrøvl Mediated Translationel Undertrykkelse”) [23]. Vi bekræftet ved western blotting, at ekspression af de tilsvarende proteiner for begge de homozygot muterede målgener (
TGFBR2
,
MSH3-
) kunne ikke detekteres i HCT116-celler (data ikke vist). I modsætning til du et
al
, foreslår vi, at tab af
TGFBR2
MSH3-
udtryk skyldes primært NMD snarere end til en hypotetisk NMTR vej. Det er bemærkelsesværdigt, at eksistensen af en NMTR pathway ikke passer godt med de immunogene egenskaber af MSI kræftceller, der er direkte afhængige af akkumulering af immunogene peptider afledt fra talrige rammeskift-relaterede proteiner, hvis PTC-mRNA’er er NMD-relevant i de fleste tilfælde [ ,,,0],18], [19], [20]. Uanset uoverensstemmelser, alle disse data argumentere for en rolle NMD i at modulere ekspressionen af flere gener, hvis mutationer er blevet allerede demonstreret
(TGFBR2
,
MSH3-
,
MBD4)
eller forventes at spille en vigtig rolle under MSI CRC progression [17]. UPF1 udtynding med shRNA i ikke-MSI HeLa-celler blev for nylig rapporteret at inducere cellecyklus arrest i tidlige S-fase på grund af inddragelse af denne faktor i DNA-reparation [24]. I modsætning hertil forbigående lyddæmpende af UPF1 og /eller UPF2 i MSI og MSS kolorektal cancer celler (HCT116, LoVo, Co115, LS174T, SW480, COLO320) ikke føre til betydelige ændringer i cellevækst og /eller død i vores hænder (data ikke vist). Yderligere undersøgelser skal nu afgøre, hvordan NMD aktivitet kan ændre repertoiret af gener involveret i MSI carcinogenese og virkning tumor progression hjælp MMR mangelfuld musemodeller, hvor UPF1 aktivitet modificeret.
Vores observationer vedrører den hyppigste primære tumor placering i forbindelse med MSI i human, dvs. colon. De viser, at NMD dybt påvirker ekspressionen af talrige mutanter med en forventet afgørende rolle i MSI-drevet tumorigenese og negativt påvirker værten immunitet mod MSI cancerceller. Sådan en formodet onkogen funktion af NMD i MSI carcinogenese passer godt med, at vi også rapporterer her for første gang, at UPF1 er signifikant overudtrykt i MSI CRC’er forhold til matchende normal slimhinde. Denne sidste observation var baseret på måling af UPF1 mRNA niveau. Som perspektiv, er det nu at blive bekræftet på proteinniveau gennem en kvantitativ tilgang som vestlige Blotting der blev her ikke foretaget på grund af mangel på yderligere tumor materiale. bør nu udvikles udviklingen af kliniske forsøg for at se, om NMD kan betragtes som en faktor dårlig prognose i MSI CRCs eller ej. Små molekyler hæmmer NMD er nu tilgængelige [25], og kan bruges til at opnå yderligere indsigt i NMD rolle i kræft. Vi planlægger nu at bruge disse stoffer i MMR-mangel mus udvikler MSI neoplasmer at vurdere, om det kan udgøre en ny terapeutisk mål for behandling af sådanne tumorer.
Materialer og metoder
Tumor prøver og cellelinier
CRC HCT116 blev erhvervet fra American Type Culture Collection og opretholdt i DMEM (Life Technologies) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen) og glutamin uden antibiotika for at tillade forbigående transfektionsforsøg med siRNA. Fyrre-fire MSI primære tumorer blev opnået fra patienter, der gennemgår operation for kolorektal cancer; alle tilfælde blev histopatologisk bekræftet som værende adenokarcinomer. Samlede tumorer blev systematisk formalin-fikseret, paraffin-indlejret og frosset efter operation uden forudgående indlejring i flydende nitrogen. MSI-status blev bestemt ved fluorescerende multiplex-PCR omfattende 5 quasimonomorphic mononukleotid gentagelser (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27), som beskrevet [26].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.