PLoS ONE: Gradient Infiltration af neutrofil Ekstracellulære fælder i tyktarmskræft og Beviser for deres deltagelse i Tumor vækst

​​

Abstrakt

Baggrund

rolle neutrofiler i tumor biologi er stort set uløst. For nylig, uafhængige undersøgelser indikeret enten neutrofile ekstracellulære fælder (net) eller Tissue Factor (TF) involvering i kræft biologi og tilhørende trombose. Men er stadig uudforsket deres individuelle eller kombineret rolle i colon adenocarcinom.

Metoder

kolektomi vævsprøver og variabelt antal drænende lymfeknuder blev indhentet fra ti patienter med adenokarcinom i colon. NET aflejring og neutrofil tilstedeværelse samt TF udtryk blev undersøgt ved immunfarvning. Effekten af ​​NET på kræft cellevækst blev undersøgt i

in vitro

co-kulturer af Caco-2-cellelinje og akut myeloid leukæmi primære celler. Proliferation og apoptose /nekrose af cancerceller blev analyseret ved flowcytometri.

Resultater

TF-bærende NET og neutrofil lokalisering var fremtrædende i tumor sektioner og de respektive metastatiske lymfeknuder. Interessant nok blev neutrofil infiltration og NET koncentration gradvist reduceret fra tumormassen til den distale margin.

in vitro

-generated NET hæmmet væksten af ​​kræft cellekulturer ved at inducere apoptose og /eller hæmme proliferation.

Konklusioner

Disse data understøtter yderligere rolle neutrofiler og NET i cancer biologi. Vi foreslår også deres engagement på kræft cellevækst

Henvisning:. Arelaki S, Arampatzioglou A, Kambas K, Papagoras C, Miltiades P, Angelidou I, et al. (2016) Gradient Infiltration af neutrofil Ekstracellulære fælder i tyktarmskræft og Beviser for deres deltagelse i Tumor vækst. PLoS ONE 11 (5): e0154484. doi: 10,1371 /journal.pone.0154484

Redaktør: Nades Palaniyar, The Hospital for Sick Children og The University of Toronto, Canada

Modtaget: Marts 1, 2016 Accepteret: 14. april, 2016 Udgivet: Maj 2, 2016

Copyright: © 2016 Arelaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af bestyrelsen for Universitetshospitalet i Alexandroupolis. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden, med metastaser og cancer-associeret trombose omfattende de vigtigste dødsårsager hos patienter med malignitet. Det er velkendt, at forholdet mellem kræft og immunsystemet ikke er begrænset til overvågning mod stigende monoklonale lidelser, men også mod etablerede maligne tumorer. Samspillet mellem immunsystemet og cancer bestemmer mange aspekter af den kliniske præsentation og progression af sygdommen [1]. Selv neutrofiler udgør i almindelighed den mest fremtrædende inflammatoriske cellepopulation, relativt lidt om deres virkninger i humane tumorer. Nylige undersøgelser viste, at neutrofiler medierer krydstale mellem kræft og immunsystemet [2,3]. Tumor-infiltrerende neutrofiler er også blevet rapporteret at lette metastase, hovedsagelig ved at ændre mikromiljøet af den metastatiske læsion [4-6]. Desuden har neutrofili blevet forbundet med en dårligere prognose hos cancerpatienter [7], mens den neutrofile til lymfocyt-forhold er blevet foreslået som et prognostisk faktor i flere typer af cancer, såsom tyktarmskræft [8].

for nylig, en vigtig mekanisme af neutrofiler neutrofile Ekstracellulære Fælder (net), har omdefineret deres rolle i tumor biologi [4-6,9-11]. NET er ekstracellulære kromatin strukturer bestående af cytoplasmatisk, kornet og nukleare komponenter af neutrofiler, oprindeligt beskrevet som et antimikrobielt respons [12,13]. Men der er stigende evidens for nøglerolle NET i ikke-smitsomme sygdomme, såsom trombose [14,15], autoimmune [16], autoinflammatorisk [17], kardiovaskulære sygdomme [15], fibrose [18] og kræft [ ,,,0],11]. Til dato er det blevet foreslået, at NET kan handle inden den primære tumor fremme tumor progression [4,11], mens fjerntliggende steder de kunne lægge beslag på cirkulerende kræftceller fremmer metastase [5,6,19]. Yderligere er NET været impliceret i cancer-associeret trombose [9,11].

Desuden vævsfaktor (TF) vigtigste

in vivo

initiator af koagulation er blevet rapporteret at spille en central rolle i cancer biologi [20,21]). TF-thrombin akse, bortset fra dens implikation i cancer-associeret trombose, er blevet angivet at have en meget potent angiogen ejendommen via signalering af dets serinproteaser gennem PAR’er. Således er denne vej blevet impliceret i neoangiogenese og cancermetastase [22]. Blandt celler i stand til at udtrykke TF, kræftceller og neutrofiler udgør kilden til denne prokoagulant og proinflammatoriske middel. Imidlertid har den kombinerede rolle TF og NET i kræft biologi aldrig været tidligere behandlet.

I dette studie undersøgte vi tilstedeværelsen af ​​NET i solide tumorer og metastatiske lymfeknuder af colonadenocarcinom patienter og deres

i vitro

effekter i kulturer af kolon kræftceller og primære leukæmiceller. Vi viser for første gang, at NET er til stede i kirurgiske prøver af colon-adenocarcinom og de respektive metastatisk lymfeknuder og de er også indrettet med TF. Vi rapporterer også, at NET kan begrænse kræft cellevækst

in vitro

ved at inducere apoptose og /eller hæmme proliferation

Materialer Metoder

Menneskelige prøver

For denne undersøgelse, formalin-fikseret paraffinindlejrede kirurgiske vævsprøver fra 10 patienter, der havde gennemgået kolektomi for adenocarcinom, herunder drænende lymfeknuder, blev undersøgt. Patientkarakteristika er påvist i S1 tabel. Snit blev taget i rækkefølge pr en cm fra centrum af tumormassen op til den kirurgiske margin fra hver prøve af colonadenocarcinom. Desuden blev både metastatiske og ikke-metastatiske identificeret lymfeknuder undersøges.

Derudover blev 10 raske donorer tilmeldt blodprøver for at isolere polymorfonukleære neutrofiler (PMN’er).

Skriftligt samtykke var ydes af alle personer, der er involveret i denne undersøgelse. Undersøgelsen protokol design var i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af den etiske Review Board af Universitetshospitalet i Alexandroupolis.

Immunhistokemi /Immunofluorescens

Sektioner blev afparaffiniseret og immuncytokemisk farvning blev udført ved anvendelse af en LSAB /HRP kit (DAKO) som tidligere beskrevet [23]. Neutrofil elastase blev påvist med en IgG kanin polyklonalt anti-neutrofil elastase-antistof (1/50 fortynding Santa Cruz, CA, USA; sc-25621). Snit blev derefter modfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret. Muse monoklonalt IgG1 blev anvendt som negativ kontrol. Prøver blev visualiseret under lysmikroskopi (Nikon, model Eclipse E400) og billeder blev taget med et Nikon digitalkamera (ACT-1 Nikon-software).

For immunfluorescens blev snit farvet som tidligere beskrevet [24]. Uspecifikke bindingssteder blev blokeret med 2% gedeserum i 2% BSA-PBS. NET blev farvet med et kanin-anti-citrullinerede histon H3 polyklonalt antistof (Abcam, UK ab5103), et muse-anti-NE-monoklonalt antistof (Santa Cruz; sc-55.548), et kanin-anti-NE poluclonal antistof (Santa Cruz; SC- 25621) og et muse-anti-myeloperoxidase monoklonalt antistof (Santa Cruz; sc-52.707). For TF detektion et IgG1-TF mAb (Sekisui Diagnostics, Lexington, USA; 4508) anvendt. En ged anti-kanin Alexa Fluor 647-antistof (Invitrogen, Carlsbad, USA; A21244) og et polyklonalt kanin-anti-muse Alexa Fluor 488-antistof (Invitrogen; A11059) blev anvendt som sekundære antistoffer. Sektioner blev modfarvet med DAPI, monteret og visualiseres i en konfokal mikroskopi (Spinning Disk Andor Revolution Konfokal System, Irland) i en PLAPON 606O /TIRFM-SP, NA 1,45 og UPLSAPO 100XO, NA 1.4 mål (Olympus, Hamburg, Tyskland).

Cell isolation

perifert blod neutrofiler blev isoleret fra hepariniseret blod fra raske donorer som beskrevet tidligere [24]. Primære humane akutte myeloid leukæmi (AML) -celler blev isoleret ved anvendelse Biocoll Adskillelse Opløsning ifølge producentens instruktioner (Biochrom, Berlin, DE) fra perifere blodprøver afledt fra patienter på University Hospital of Alexandroupolis, Grækenland. AML Diagnosen blev foretaget i overensstemmelse med World Health Organization kriterier.

Cell kultur, stimulering og hæmning undersøgelser

Caco-2 [Caco2] (ATCC

® HTB-37

™) (ATCC, Manassas, USA) celler blev dyrket i 5% CO

2, ved 37 ° C, i L-glutamin Eagles minimale essentielle medium (EMEM; Gibco BRL, New York, USA). AML-celler blev dyrket i 5% CO

2, ved 37 ° C, i myeloid Long-Term Culture Medium (MyeloCult

™ H5100; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada). Både Caco-2 og AML-celler blev stimuleret med 500 ng NET strukturer isoleret fra neutrofiler behandlet med de førnævnte midler eller hele PMN forbehandlet med disse midler, i 4 dage. For NET stillads hæmning, isolerede NET strukturer blev præ-inkuberes med DNase1 (10 U /ml; Fermentas, Vilnius, Litauen) eller heparin (heparin natrium, 100 mg /ml; LEO Pharma A /S, Ballerup, Danmark) i 60 min . For TF inhibition et IgG1 muse-anti-humant TF mAb (10 ug /ml; Sekisui Diagnostics) blev anvendt

Fire billeder tilfældigt taget fra forskellige regioner af hver brønd med 100 x forstørrelse per eksperiment blev analyseret.. Gennemsnitlig areal dækket af cellerne blev beregnet med Fiji /ImageJ [25].

NET struktur generation, isolation og kvantificering

For at generere NET, 1,5 × 10

6 neutrofiler blev podet i seks-brønds dyrkningsplader (Corning Incorporated, New York, USA) i lav-serum RPMI-medium (Gibco BRL) som tidligere beskrevet [13] og blev behandlet med sepsis serum [14], isoleret fra blodprøver afledt fra septiske patienter på Academic Hospital i Alexandroupolis, Grækenland, for 210 min. Neutrofiler blev også inkuberet med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (40 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en generisk inducer af NET frigivelse, for 210 min. Bagefter blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med RPMI. Desuden 1 ml RPMI blev tilsat til hver brønd og NET blev opsamlet efter kraftig omrøring. Mediet blev centrifugeret ved 20xg i 5 min og net blev opsamlet i supernatant fase. Disse koncentrationer og tidspunkter var optimal for neutrofil stimulering ifølge optimering eksperimenter. DNA-indholdet blev bestemt ved anvendelse NanoDrop.

celledeling og apoptose

Til analysen af ​​celleproliferation, Caco-2 og AML-celler blev farvet med 5 (6) -carboxyfluorescein diacetat N-succinimidylester (CFSE; Sigma-Aldrich) [26], CD34 APC (klon 8G12; BD Biosciences, New Jersey, USA) og CD45 PerCP (klon 2D1, BD Biosciences) før stimulering. Forsøg blev udført og analyseret i timer serien eksperimenter overvejer som faderlig befolkning til sammenligning cellerne med højeste CFSE intensitet ifølge skelsættende publikationer [27,28].

Til analysen af ​​apoptose /nekrose, Caco-2 og AML-celler blev farvet med FITC-annexin V (BD Biosciences) og propidiumiodid (PI; Sigma-Aldrich). AML-celler blev også farvet med CD34 APC (klon 8G12; BD Biosciences).

spredning og apoptose analyse blev udført efter 4 dages co-kultur med NET til en FACScalibur flowcytometer (BD Biosciences). Alle data blev analyseret med Flowjo V10.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA) med Scheffé test for post-hoc sammenligninger. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Alle statistiske analyser blev udført med OriginPro 8.

Resultater

NET er til stede i human colon adenocarcinom og metastatiske lymfeknuder

Da det er blevet for nylig foreslået, at NET er impliceret i cancer progression og metastase i murine lunge og mamma tumormodeller [4,11], vi undersøgt, om de er til stede i human colon adenocarcinom og deres respektive metastatiske lymfeknuder.

til dette formål brugte vi konfokal mikroskopi til at undersøge tumorprøver af kolektomi for adenocarcinom fra ti patienter. Vi observerede en betydelig aflejring af NET i tumor sektioner, som ekstracellulær colokalisering af neutrofil elastase med citrullinerede H3 (Fig 1ai og 1Aii) og neutrofilelastase med myeloperoxidase (Fig 1Aiii) i konfokal mikroskopi, i modsætning til deres fravær i normale tarmen dele af samme patienter. Især blev NET lokaliseret i nærheden af ​​cancerceller og i stroma (Fig 1Aii) og endda inden glandulære lumen i hovedsagen colon masse. For at bekræfte vores observation i lavere forstørrelse, blev de samme vævsprøver undersøgt for neutrofil tilstedeværelse ved neutrofilelastase immunhistokemi. Neutrofiler farvet med NE demonstrerede lignende lokalisering i tumoren som NET (Fig 1B). Forventeligt, neutrofiler var også synlige med hæmatoxylin og eosin (H 0.05.

Vi næste undersøgt, om NET hæmmer Caco-2 vækst via apoptose. Således blev Caco-2-celler behandlet med de ovennævnte midler og påviste øget niveau af apoptotiske og sene apoptotiske celler som vurderet af Annexin V /PI flowcytometri (fig 4C og 4D). DNase I eller heparin svækkede denne virkning på apoptose (fig 4C og 4D). Endvidere apoptose induktion af Nets var koncentrationsafhængig (data ikke vist) .Disse data indikerer, at NET, uanset NET-frembringende stimulus, virke som potente inhibitorer af colon vækst cancerceller

in vitro

ved at inducere apoptose i disse celler.

NET også hæmme akut vækst myeloid leukæmi celler

in vitro

for yderligere at afklare, om denne hæmmende rolle NET til kræft cellevækst er unik for kolon adenocarcinom eller opstår med andre typer af malignitet samt, undersøgte vi deres virkninger i humane hæmatopoietiske cancer. Således gennemførte vi

in vitro

co-kultur eksperimenter af primære AML celler i nærværelse af Nets.

I lighed med Caco-2 celler, PMA eller sepsis-induceret net eller henholdsvis præ-stimuleret neutrofiler undertrykte signifikant væksten af ​​AML-celler (S2B fig) og apoptose (S2C og S2D fig). Derudover NET-behandlede AML-celler viste en bemærkelsesværdig reduktion af deres spredning i forhold til kontroller, som vurderet ved flowcytometri (fig 5A og 5B). På den anden side, NET chromatin scaffold inhibitorer (DNase eller heparin) afskaffet-NET virkninger på både AML celleproliferation og apoptose (fig 5A og 5B, S2D Fig).

(A), (B) CFSE flowcytometri af AML-celler co-dyrket med enten PMA eller sepsis serum-inducerede NET i nærvær eller fravær af NET stillads inhibitorer. (A) Repræsentative scatter plots. (B) Data fra fire uafhængige forsøg præsenteres som gennemsnit ± SD. n.s.-ikke signifikant sammenlignet med kontrol, * p 0.05.

Disse data er taget sammen med de tidligere resultater antyder, at NET, uanset stimulus, har også en potentielt universel hæmmende rolle i primære humane cancer cellekulturer, som blev observeret i celler af akut myeloid leukæmi.

Discussion

i denne undersøgelse påviste vi for første gang tilstedeværelsen af ​​NET, dekoreret med TF, i colonadenocarcinom sektioner af både den primære tumor masse og de respektive metastatiske lymfeknuder . Vi leverer også beviser for en potentiel rolle NET til at begrænse

in vitro

kræft cellevækst ved at inducere apoptose både i kulturer af Caco-2 og primære AML-celler. Desuden NET hæmmede

in vitro

proliferation i AML-celler.

På linje med tidligere rapporter indikerer tilstedeværelsen af ​​NET i kræft biopsier [6,19], viste vi overflod af NET i colon adenocarcinom sektioner både inden for primær tumor og i metastatiske lymfeknuder, som ekstracellulære colocalizations af neutrofilelastase med citrullinerede histon H3 eller MPO. Desuden observerede vi øget infiltration af neutrofiler i disse sektioner belyser kilden til disse NET. Især NET-generering neutrofiler viste en samlet mønster, muligvis som følge af neutrofiler fastgørelse på allerede dannede NET og yderligere generere flere NET. Selvom øget tilstedeværelse af neutrofiler også blev observeret med standard histokemiske H 0.05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154484.s002

(TIF)

S1 tabel. Kliniske Karakteristik af patienter med kolorektal cancer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154484.s003

(DOC)