PLoS ONE: Den p70S6K Specifik Inhibitor PF-4.708.671 hæmmer ikke-småcellet lungekræft vækst

​​

Abstrakt

Baggrund

Som en serin /threoninproteinkinase, p70S6K spiller en vigtig rolle i tumorceller. Beviser har afsløret overekspression af p70S6K og phosphoryleret p70S6K (p-p70S6K) i forskellige tumorvæv, med disse proteiner identificeret som uafhængige prognostiske markører i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I denne undersøgelse, udforskede vi rolle p70S6K specifik inhibitor PF-4.708.671 i NSCLC.

Metoder

Tre NSCLC cellelinjer (A549, SK-MES-1, og NCI-H460) blev behandlet med PF-4708671 ved fem forskellige koncentrationer, herunder 0,1 uM, 0.3μM, 1 uM, 3 uM og 10 uM, og proteinniveauer blev bestemt ved Western-blot. Derefter blev PF-4708671 virkninger vurderet både

in vitro

(celleproliferation, apoptose, cellecyklus distribution og invasion) og

in vivo

.

Resultater

de ekspressionsniveauerne af p-p70S6K og nedstrøms effektor S6 blev signifikant reduceret med PF-4.708.671. Diametralt modsatte, havde de nedstrøms protein niveauer af BAD, Caspase3 og ERK steg efter behandling med PF-4.708.671. Desuden PF-4708671 drastisk hæmmede celledeling og invasion evne A549, SK-MES-1 og NCI-H460 celler

in vitro

, forårsager cellecyklus anholdelse i G0-G1 fasen. Begrænsede effekter af PF-4708671 blev observeret på apoptose i de tre NSCLC cellelinier vurderes. Vigtigere er det, PF-4708671 kunne hæmme tumorigenese i nøgne mus

in vivo

.

Konklusion

Disse resultater viste, at p70S6K specifikke inhibitor PF-4.708.671 virker hæmmende på NSCLC tumorigenese

in vitro

in vivo

. Derfor bør p70S6k betragtes som en ny potentiel terapeutisk mål, og PF-470.867 kan anvendes som målrettet lægemiddel til kræftbehandling

Henvisning:. Qiu ZX, Sun RF, Mo XM, Li WM (2016) The p70S6K Specifikke Inhibitor PF-4708671 hæmmer ikke-småcellet lungekræft Growth. PLoS ONE 11 (1): e0147185. doi: 10,1371 /journal.pone.0147185

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: November 17, 2015; Accepteret: December 30, 2015; Udgivet: 15 januar 2016

Copyright: © 2016 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.372.504), Videnskab og Teknologi Support Program for Videnskab og Teknologi Institut for Sichuan provinsen (2014SZ-0148), og den internationale samarbejde Program for Videnskab og Teknologi Institut i provinsen Sichuan (2014AA022202-2)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

Lungekræft, en af ​​de mest almindelige maligne lidelser, er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med de højeste sygelighed og dødelighed i Kina. Mere end 80% af patienter med lungekræft er diagnosticeret som ikke-småcellet lungecancer [1]. Trods kombinationsbehandling med kirurgisk resektion, kemoterapi, strålebehandling, og biologisk target terapi, den samlede 5-års overlevelsesraten for lungekræft er kun 16%, varierende fra 52,2% til 4% hos patienter lokale og fjerne fase henholdsvis [2]. Derfor identifikation af hidtil ukendte mål og belysning af ændringer på molekylært niveau kunne være gavnlig for lungekræft behandling.

Som en serin /threoninproteinkinase for AGC-kinase-familien, er p70S6K phosphoryleres med forskellige vækstfaktorer og insulin -lignende faktorer gennem PI3K /mTOR pathway, og interagerer med S6, eIF4B, eEF2K, PDCD4 og mange andre substrater; dette er vigtigt for mitogen-induceret celleproliferation, overlevelse, motilitet og kemoterapi lægemiddelresistens i cancerceller [3]. Nylige undersøgelser viste, at overekspression af p70S6K og p-p70S6K i forskellige tumorvæv er vigtigt at forudsige dårlig prognose, og bidrager til kemoterapi modstand [4-14].

In vitro

overekspression af p70S6K fremmer celleproliferation, angiogenese, og apoptose suppression [15, 16]. I mellemtiden S6K1 knockdown inhiberer p70S6K ekspression og reducerer celleproliferation betydeligt, faldende tumordannelse i nøgne mus [17]. Desuden p70S6k og p-p70S6k niveauer er signifikant højere i tumorer end i normale væv fra NSCLC-patienter [18, 19]. Vores tidligere undersøgelse viste, at p-p70S6K er nært beslægtet med langtidsoverlevelse i NSCLC [20]. Derfor p70S6K spiller en vigtig rolle i NSCLC, og vurdering af høj specificitet p70S6k hæmmere kunne hjælpe yderligere at definere denne nye terapeutiske mål for klinisk anvendelse.

Aktuelle undersøgelser af mål behandlingsformer for kræft meste fokuserer på mTOR-hæmmere [20] , mens værker specifikt vurderer p70S6k inhibitorer i lungekræft behandling er begrænsede [21-25]. Denne undersøgelse fokuserer på de specifikke p70S6K korrosionsinhibitor PF-4.708.671 at vurdere virkningerne af p70S6K hæmning i NSCLC [22].

Metoder

1. PF-4708671 (C

19H

21F

3N

6)

PF-4708671 (# 559.273 Calbiochem, Merck, USA) er en inhibitor af S6K1 (Ki = 20 nM ; IC50 = 160 nM). 10 mg PF-4.708.671 var fuldt opløst i 1 ml DMSO og opbevaret ved -80 ° C i

in vitro

eksperimenter. For

in vivo

assays, PF-4798671 blev opløst i 10% DMSO først og yderligere fortyndet i 30% PEG400, 0,5% Tween 80 og 5% propylenglycol, for at opnå en endelig DMSO-koncentration på 1%.

2. Celledyrkning

Tre ikke-småcellet lungekræft cellelinier blev opnået fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, og dyrkes i henhold til leverandørens anbefalinger. De omfattede A549 (adenocarcinom), NCI-H460 (storcellet carcinom), og SK-MES-1 (pladecellecarcinom) celler. Alle celler blev holdt i en befugtet miljø, der indeholder 5% CO2 ved 37 ° C.

3. Western blot

Proteiner blev ekstraheret fra celler under anvendelse af phosphoryleret protein ekstraktion kit (Keygen, Nanjing, Kina), og koncentrationer blev målt under anvendelse af BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific, Rockford, USA). Lige store mængder protein fra forskellige prøver blev separeret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektro-overført til polyvinyliden (PVDF) membraner (Millipore, Billeraica, USA). Derefter blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-p70S6K R365, anti-p-p70S6K T389, anti-ribosom protein S6 A229 (# BS1568, # BS4440, # BS3610, 1, 1000, Bioworld Technology, Nanjing, Kina ), anti-BAD, anti-Caspase3, anti-ERK (# 9239P, # 96.625, # 3552S, 1: 1000, Cell Signaling Technology), og anti-β-actin (# 4970, 1: 5000, Cell Signaling Technology) antistoffer, henholdsvis. Målproteiner blev detekteret ved anvendelse af ChemiDoc XRS systemet (Bio-Rad, Philadelphia, USA) efter udsættelse for kemiluminescerende HRP substrat (Millipore, Billerica, USA). Data blev analyseret med Mængde One 1-D Analysis software (Bio-Rad).

4. Celleproliferationsassay

celleproliferation af NSCLC cellelinjer blev målt ved anvendelse celle Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge fabrikantens protokol. Tumorceller blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5 x 10

3 per brønd. Efter inkubering i nærværelse af PF-4708671 (0,1 uM, 0.3μM, 1 uM, 3 uM og 10 uM) i 24, 48 og 72 timer, henholdsvis blev celleproliferationen vurderet. DMSO behandlede eller ubehandlede celler blev anvendt som negative kontroller. Derudover blev celleproliferationen markør Ki-67 undersøgt ved immunhistokemi i nøgen tumorvæv.

5. Cell cyklus analyse

For hver cellelinje, ca 1 × 10

6 celler blev høstet efter behandling med 10 pM PF-4.708.671 for 24 timer; cellecyklusfordeling blev vurderet ved hjælp af Cell Cycle Detection Kit (Keygen, Nanjing, Kina); DNA-indhold blev bestemt på en FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, USA). Data blev analyseret ved anvendelse af CellQuest og Modfit software.

6. Celleinvasion

celleinvasion blev evalueret under anvendelse af Millipore celleinvasion assaykit (# ECM550, Millipore, USA) ifølge producentens anvisninger, efter behandling med PF-4.708.671 på 10 uM i 24 timer. Cellesuspensioner indeholdende 1 x 10

6 celler /ml blev podet på det øvre kammer med medium suppleret med 1% serum. Medier indeholdende 20% FBS blev sat til nedre kamre.

7. Celleapoptose

Ca. 5 x 10

5-celler blev høstet efter behandling med PF-4.708.671 på 10 uM i 24 timer og farvet med Annexin V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KeyGen, Nanjing, Kina ) ifølge fabrikantens protokol. Fluorescens blev målt på et FACSCalibur flowcytometer. Annexin V-positive og 7AAD-negative celler anses for at være apoptotisk. Desuden blev TUNEL metode anvendes til at bestemme apoptose i xenograft tumorvæv.

8.

In vivo

effekter af PF-4708671 i en nøgen mus xenotransplantationsmodel etableret med H460 celler

H460 celler, som viste den højeste vækstrate, blev udvalgt til

in vivo

eksperimenter. Kvindelige nøgne mus (4 uger, 18 til 20 g) blev købt fra Beijing WeiTongLiHua forsøgsdyr teknisk co., LTD. (Kina), og har til huse i Animal Center i West China Sichuan University, med en 12-timers lys /12t mørke cyklus. Alle eksperimenter blev udført i SPF (Special patogenfri) betingelser. Mus blev opdelt i tre grupper tilfældigt, og hver gruppe indeholdt tre mus (n = 3 /hver gruppe). De endepunkter observation var som følger: 1) diameteren af ​​tumorer 3cm; 2) transplanterede tumorer havde nekrose og /eller forfald; 3) naturlig død. Metoden til offer i slutningen af ​​vivo forskning blev savet midt over efter anæstesi under forudsætning af, uden at andre mus kunne se. I gruppe 1 (H460 gruppe), 1 × 10

7 H460 celler blev subkutant injiceret i mus. Gruppe 2 (negativ kontrol, NC gruppe) blev dyrene injiceret celler som i koncernen1; tre dage senere blev de intraperitonealt administreret 200 pi opløsningsmiddel-blanding (1% DMSO, 30% PEG400, 0,5% Tween80 og 5% propylenglycol) dagligt i 1 uge. I gruppe 3 (H460 + PF4708671 gruppe) blev mus behandlet som beskrevet for gruppe 2, med 200 pi PF4708671 (50 mg /kg) i stedet for opløsningsmiddel mix. Tumorer størrelser blev målt dagligt i mere end en uge (lang diameter = a; kort diameter = b), og volumen blev afledt som følger: V = Ab2 /2. Tumorinhibering rate = [(kontrol tumorvægt-eksperimentel tumorvægt) /kontrol tumorvægt] x 100%. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i West China Hospital.

9. Statistisk analyse

Data blev behandlet af Microsoft Excel 2010. Brug af SPSS 19,0 software, t-test og en måde-ANOVA blev anvendt til dataanalyse. Dataene er gennemsnit ± SD, og ​​tosidet

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

1. PF-4708671 hæmmer p70S6K og S6 fosforylering

Vores resultater viste, at de specifikke p70S6K korrosionsinhibitor PF-4.708.671 væsentligt reduceret phosphorylering af p70S6K og dens downstream S6 på 0,1 uM (

P

0,05) ; p-S6 ekspressionsniveauerne faldt med stigende narkotika koncentrationer (

P

0,05). Tværtimod protein niveauer af downstream BAD blev Caspase3 og ERK steg efter behandling med PF-4.708.671 med koncentrationen af ​​1 uM. Men alt p70S6k og S6 protein niveauer havde ingen signifikante forskelle mellem negativ kontrol og behandlingsgrupper (figur 1, S1 File).

1. Protein-ekspressionsniveauer af p70S6K, p-p70S6K, S6, og p-S6 efter behandling med forskellige lægemiddelkoncentrationer. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. 2. Protein udtryk niveauer af p-p70S6K og p-S6 under forskellige lægemiddelkoncentrationer.

P

0,05: narkotikabehandling gruppe vs negativ kontrolgruppe. N, negativ kontrol; A, H460; B, A549; C, SK-MES-1.

2. PF-4708671 hæmmer NSCLC celledeling

CCK-8 assay data vist, at spredning evner tre NSCLC cellelinjer blev betydeligt hæmmet af PF-4708671. Efter 24 timers behandling, PF-4.708.671 hæmmede H460 celledeling på 10 uM, og A549 og SK-MES-1 celle beløb blev reduceret betydeligt på 3 uM og 0,1 uM henholdsvis (

P

0,05). Desuden H460, A549, og SK-MES-1 celle vækstrater betydeligt hæmmet af PF-4.708.671 på 0.3μM, 0,1 uM, og 0,1 uM henholdsvis 48 timer efter behandlingen (

P

0,05). Alle cellelinier viste signifikant reduceret spredning på 72 timer efter behandling med 0,1 uM PF-4.708.671 (

P

0,05). Betydelig tids- og koncentrationsafhængig hæmning af celleproliferation blev observeret i alle cellelinier (

P

0,05). (Fig 2)

Proliferation inhibition rate = [1 – (forsøgsgruppe værdier – blank værdi) /(negativ kontrolgruppe værdi -. blank værdi)] x 100%

3. PF-4708671 påvirker NSCLC cellecyklus

Efter DNA farvning af PI, flowcytometri analyse viste cellecyklusstop i G0 /G1 fasen for alle tre NSCLC cellelinjer (

P

0,05). I mellemtiden, andelen af ​​celler i S og G2 /M-faser blev signifikant reduceret i A549-celler (

P

0,05). Derudover blev også detekteret reducerede mængder af S-fasen (H460) og G2 /M-fase (SK-MES) celler (

P

0,05). (Fig 3)

(* p. 0,05, narkotikabehandling gruppe vs negativ kontrolgruppe)

4. PF-4708671 hæmmer markant celle invasion

PF-4708671 hæmmede invasion evne i de tre NSCLC cellelinier vurderes. De gennemsnitlige antal celler, der passerer gennem den ekstracellulære matrix gel var signifikant lavere i behandlingsgrupper end i negative kontroller (

P

0,05), med invasion hæmning satser på 75,90%, 46,23% og 82,73%, for H460, A549 og SK-MES-1-celler, (fig 4).

5. PF-4708671 øger NSCLC celle apoptose

PF-4708671 viste begrænset effekt på apoptose i de tre NSCLC cellelinjer, selv om der blev opnået statistisk signifikante forskelle (

P

0,05). Sammenlignet med negative kontrolgrupper, apoptose priser til H460, A549 og SK-MES-1 cellelinjer blev forøget med 1,537%, 2,483% og 3,475%, henholdsvis (

P

0,05) (Figur 5).

6. PF-4708671 hæmmer tumorigenese

in vivo

Alle transplanterede tumorer blev dyrket med succes i hver mus, og alle mus har ingen tegn på miscomfort og /eller lidelse, indtil vi slå dem ihjel. Tendenserne i tumorvolumener hos nøgne mus for hver gruppe er opsummeret i tabel A i S1 Fil og S2 Fig. Dyr behandlet med p70S6K specifikke inhibitor PF470867 viste åbenlyst hæmmede tumorvækst i forhold til gruppe 1 (H460) og gruppe 2 (NC) (alle

P

0,05). Som vist i tabel B i S1 File og S3 Fig, vægte og mængder af de udskårne tumorer var lavere efter behandling med PF470867 sammenlignes med kontrolværdierne (

P

0,05). Endvidere celleproliferation, som udtrykt ved Ki-67, blev signifikant reduceret i H460 + PF4708671 gruppen sammenlignet med værdier opnået for begge kontrolgrupper. Endelig TUNEL-farvning demonstrerede signifikant højere apoptotisk pris på tumorceller i Gruppe 3 sammenlignet med kontroldyr (gruppe 1 og 2) værdier (Fig 6).

pile viser positivt farvede celler. Original forstørrelse, × 400.

Diskussion

p70S6k deltager i tumorigenicitet og kræft progression, men mekanismen bag dens effekt er ikke helt forstået. Undersøgelser vurderer p70S6K i forhold til NSCLC er knappe; vi tidligere fundet, at p70S6K overekspression fremmer NSCLC celledeling, hæmmer celle apoptose og øger invasion evne. For yderligere at forstå den rolle p70S6k inhibitorer i ikke-småcellet lungekræft, nærværende undersøgelse vurderede tre NSCLC cellelinier (A549, SK-MES-1, og NCI-H460) behandlet med PF-4.708.671, og vurderet ændringerne i maligne fænotyper såsom spredning, invasion og apoptose unddragelse.

som det fremgår ovenfor, p70S6K hæmmeren PF-4.708.671 hæmmede signifikant aktivering af p70S6K og dens centrale nedstrøms effektor S6, i en koncentrationsafhængig måde. Endvidere proteinniveauer af nedstrøms BAD; Caspase3 og ERK, som påvirker apoptose evne celler, blev forøget efter behandling med PF-4.708.671. Dette viste sig at PF-4708671 kunne påvirke NSCLC cellelinjer overlevelse ved at regulere relevante faktorer af apoptose. Desuden NSCLC celledeling var tid og koncentration hængigt hæmmet af PF-4708671, der bekræfter tidligere rapporter [15-17]. Foreslog vi, at p70S6K forordningen er forbundet med celle apoptose. Forskellene i minimale effektive koncentrationer lægemiddel til NSCLC cellelinjer vurderede kan skyldes deres særlige p70S6k niveauer og vækstrater: vi fandt væksthæmning på 30 til 40%

Vi antager, at ved at regulere cellens cyklus. , PF-4708671 kan hæmme celleproliferation. Nylige undersøgelser viste, at S6K1 og p70S6K er kritiske for G1 arrest [26-28]. Konsekvent, fandt vi, at PF-4708671 påvirket cellecyklus distribution i de tre NSCLC cellelinjer vurderede, væsentligt forsinke cellecyklus progression i G0 /G1 fasen. En anden vigtig faktor, der påvirker celleproliferation er apoptose; et fase I forsøg med LY2584702 evaluere fremskredne solide tumor patienter viste ingen åbenlys anti-tumor effekt af dette stof [25]. Som vist ovenfor, PF-4708671 haft begrænset effekt på celle apoptose i NSCLC celler, med en apoptose sats tæt på 3% in vitro. Derfor antog vi, at p70S6k veje ikke kan være involveret i celle apoptose. Men denne undersøgelse viste også, at PF-4708671 inhiberer NSCLC tumorigenese

in vivo

.

p70S6K overekspression blev vist at være associeret med aggressiv sygdom og dårlig prognose ved brystcancer [29]. Vores tidligere undersøgelse viste p70S6K overekspression fremmer celle invasion

in vitro

. Interessant, PF-4708671 kunne inhibere invasion evne alle NSCLC cellelinier vurderes i denne undersøgelse. I modsætning hertil studier i NSCLC-patienter viste, at p-p70S6K ekspression ikke er forbundet med lymfeknudemetastaser og kræft stadium [18-29]. er behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte rolle p70S6K i NSCLC invasion og metastase

in vivo

.

Men der stadig havde nogle begrænsninger i vores forskning. Først og fremmest, selv om alle celler var NSCLC cellelinier, kilderne var forskellige. Så vores resultater ikke kunne være helt konsekvent, fordi der kan være forskellige mekanismer mellem forskellige genetiske baggrunde. Endvidere mængden var ikke store nok til eksperimenter af nøgne mus in vivo. Derfor er resultaterne brug for yderligere grundig forskning for at bekræfte.

Som konklusion, vores undersøgelse viste, at p70S6K hæmmeren PF-4.708.671 kunne påvirke cellecyklusfordeling, hæmme celledeling, apoptose og invasion i NSCLC celler. Hæmme p70S6K-S6 aksen resulterede i potent antitumoraktivitet. Derfor kombinationsbehandling med p70S6K hæmmer og kemoterapi repræsenterer en lovende ny strategi for NSCLC behandling.

Støtte Information

S1 Fig. Protein ekspressionsniveauer for BAD, Caspase3 og ERK efter behandling med PF-4.708.671

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s001

(TIF)

S2 Fig. Tumor volumenvækst tendens i hver gruppe af nøgne mus (mm

3)

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s002

(TIF)

S3 Fig. Sammenligning af tumor størrelser mellem grupper

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s003

(TIF)

S1 File. Tabel A. Tumorvækst volumen af ​​hver gruppe i nøgne mus (n = 3 /mm

3). Tabel B. tumorxenoplantater vægten af ​​hver gruppe ()

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147185.s004

(DOCX)

Tak

Tak til professor Mo XM givet os et godt laboratoriemiljø og udstyr.