PLoS ONE: MicroRNA Lad-7a Hæmmer spredning af human prostatacancer celler in vitro og in vivo ved Målretning E2F2 og CCND2

Abstrakt

Baggrund

Tidligere arbejde har vist reduceret ekspressionsniveauer af lad-7 i lungetumorer. Men lidt er kendt om udtrykket eller mekanismer af lade-7a i prostatakræft. I denne undersøgelse, vi anvendes in vitro og in vivo metoder til at undersøge, om E2F2 og CCND2 er direkte mål for lad-7a, og hvis lad-7a fungerer som en tumor suppressor i prostatakræft ved at nedregulere E2F2 og CCND2.

Metode /Principal

Resultater Real-time RT-PCR påviste, at nedsatte niveauer af lad-7a er til stede i resektion prostatakræft prøver og prostatakræft-cellelinier. Cellulær proliferation blev inhiberet i PC3-celler og LNCaP-celler efter transfektion med Lad-7a. Cellecyklusanalyse viste, at lade-7a induceret cellecyklusstandsning ved G1 /S-fase. En dobbelt-luciferase reporter assay viste, at 3’UTR af E2F2 og CCND2 var direkte bundet til at lade-7a og western blotting analyse anførte endvidere, at lade-7a ned-reguleret ekspression af E2F2 og CCND2. Vores xenograftmodeller på prostatakræft bekræftede evnen til Lad-7a til at hæmme prostata tumor udvikling in vivo.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater bidrager til at optrævle de anti-proliferative mekanismer lad-7a i prostatacancer. Lad-7a kan også være nye terapeutisk kandidat for prostatakræft givet sin evne til at fremkalde celle-cyklus anholdelse og hæmme cellevækst, især i hormon-refraktær prostatakræft

Henvisning:. Dong Q, Meng P, Wang T , Qin W, Qin W, Wang F, et al. (2010) MicroRNA Lad-7a Forhindrer spredning af menneskelige prostatacancerceller

In vitro

In Vivo

ved Målretning E2F2 og CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10,1371 /journal.pone.0010147

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Marts 9, 2010; Accepteret: 23. marts 2010; Udgivet: 14 April, 2010

Copyright: © 2010 Dong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program i Kina, 2009CB521705; og Nature Science Foundation of China, 30672097. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er endogene, kodende små RNA 20-25 nukleotider i længden [1], som spiller en vigtig regulerende rolle gennem gratis binding af 3 ‘utranslaterede regioner (UTR’er) af mål gener. Binding resulterer i nedbrydningen af ​​mål-mRNA’et og inhibering af translation [2]. Mange miRNA er associeret med cancer, og er involveret i celleudvikling, differentiering, proliferation og celledød [3]. Mange rapporter har indikeret, at miRNA kan være nyttige for kræft diagnose og terapi [4]. Lad-7 blev først identificeret i

Caenorhabditis elegans

[5]. Det er næsten ikke målbart i embryonale fase af udviklingen, men bliver mere rigelige i senere stadier af udvikling [6]. Tidligere arbejde har vist reducerede ekspressionsniveauer af Lad-7 i lungetumorer i forhold til normalt lungevæv. Lad-7 forsinker celleproliferation ved nedregulering af oncogener RAS /c-myc og HMGA-2 ved det translationelle niveau [7], [8]. De samme tumor undertrykkende funktioner er også rapporteret for lad-7 i tyktarmskræft [9].

I silico

analyser af potentielle Lad-7a mål (www.targetscan.org andwww.microrna .org) viser, at både E2F2 og CCND2 er mulige mål for lad-7a. E2F2 og CCND2 er celle-cyklus regulatorer og afvigende ekspression af dem kan føre til unormal celleproliferation. Vores foreløbige eksperimenter indikerer, at protein-niveauer af både E2F2 og CCND2 er opreguleret i PC3 prostatacancer-cellelinie. Vides kun lidt om udtrykket eller mekanismer af lade-7a i prostatakræft. I denne undersøgelse, brugte vi

in vitro

in vivo

tilgange at undersøge, om E2F2 og CCND2 er direkte mål for lad-7a, og hvis lad-7a fungerer som en tumor suppressor i prostata kræft ved at nedregulere E2F2 og CCND2.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle prøver blev opnået fra patienter, som har underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til forskning formål efter operation. De klinik patologiske faktorer i 26 patient blev viste i tabel S1. Brugen af ​​humane væv i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board i den fjerde Military Medical University og var i overensstemmelse med deres retningslinjer (nr 2008039085). Alle forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven og godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Fjerde Military Medical University. (Godkendelsesnummer 200.804.052.353).

Cell kultur og væv samling

Menneskelig prostata cancer cellelinjer LNCaP, DU145, PC3, og Prec (prostata epitelceller) og humane embryonale nyreceller HEK293A blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) suppleret med 10% føtalt-kalv-serum og penicillin (100 U /ml). Kulturerne blev holdt under en atmosfære indeholdende 5% CO

2 (Forma Scientific). Tyve-seks frisk resektion prostatakræft prøver og deres tilstødende ikke-tumorform prøver blev indsamlet fra Institut for Urologi i Xi’jing Hospital. Prøverne blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og holdes der indtil anvendelse.

Plasmidkonstruktion og celletransfektion

Lad-7a blev amplificeret og oprenset ved miRNA isolation kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge med producentens protokol. PCR primere til lad-7a var:

5′-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 ‘Hotel (fremad) og

5′-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3′

(tilbage). Lad-7a PCR-produkter blev klonet ind i

Eco

RI /

Pst

jeg kloningssted i en pcDNA3 plasmid indeholdende grønt fluorescerende protein (GFP) til dannelse af plasmidet pcDNA3-let-7a-GFP . Celletransfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev PC3-celler udpladet i seks-brønds plader og dyrket uden antibiotika til 70-90% konfluens. Hver brønd modtog 6 pi lipofectamin-reagens indeholdende 3 ug plasmid DNA. Tre brønde modtog pcDNA3-let-7a-GFP-plasmidet, mens de andre brønde modtog tom vektor, pcDNA3-GFP. G418 (400 ug /ml) blev tilsat til cellerne 24 timer efter transfektion. Blandede kloner blev screenet og dyrket i yderligere 4 uger. PC3-celler transficeret med Lad-7a blev betegnet PC3-let-7a-GFP, den negative kontrol (celler transficeret med tom vektor) blev betegnet PC3-GFP. PC3 celler blev også transficeret med 30 nM af syntetisk Lad-7a (efterligner), og syntetiske negative kontrolprøver miRNA (NC). Endelig et syntetisk lad-7a-inhibitor sekvens og syntetisk lad-7a-inhibitor negativ kontrol (NC-inhibitor). Sekvenser af syntetisk HSA-lad-7a, negativ kontrol, HSA-lad-7a-hæmmer og inhibitor negativ kontrol blev viste i tekst S1.

Total RNA ekstraktion og real-time RT-PCR

for lad-7a blev totalt RNA ekstraheret fra prøver under anvendelse af en miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR blev udført med TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems). Primeren for lad-7a var

5′-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 ‘. Hus Til E2F2 og CCND2, total RNA-ekstraktion og real-time RT-PCR blev udført ved anvendelse SYBR® grønnere ™ To trin (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR primere til E2F2 var:

5′-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 ‘Hotel (fremad) og

5′-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3′

(tilbage). PCR primere til CCND2 var:

5′-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 ‘Hotel (fremad) og

5′-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3′

(tilbage). Alle protokoller blev udført i overensstemmelse med producentens protokoller. Ekspressionsniveauet af let7a blev normaliseret til RNU6B. Udtrykket niveau af E2F2 og CCND2 blev normaliseret til GAPDH. Real-time RT-PCR blev udført ved anvendelse af 7500 real-time RT-PCR System (Applied Biosystems). PCR blev udført under følgende betingelser: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 50 cykler ved 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 min. Hver prøve blev kørt tredobbelt.

MTT assay

PC3-celler og LNCaP-celler transficeret med enten NC eller lad-7a (efterligner) eller NC inhibitor og lad-7a-inhibitor blev udpladet på 96 -Nå plader på 1 × 10

4 celler /brønd. Levedygtige celler blev målt 1, 2, 3, 4, og 5 dage efter udpladning. Efter inkubering med 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev cellerne lyseret i 150 pi 100% dimethylsulfoxid (DMSO) og UV-synlig absorbans blev aflæst ved 490 nm ved anvendelse af 96-brønds plade-læser. Hver prøve blev kørt tredobbelt.

blød agar-assay

Kort fortalt blev 2 ml 0,5% agar blev tilsat til hver brønd af en 12-brønds plade. Fritliggende PC3-let-7a-GFP og PC3-GFP-celler blev blandet med topagarose suspension (slutkoncentration 0,3%), og derefter blev cellerne lagdelt på 0,5% agarose underlag. Antallet af foci 100 um blev talt efter 18 dage. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Cell cyklus analyse

PC3 celler og LNCaP-celler transficeret med enten NC eller lad-7a (efterligner) eller NC-hæmmer eller lad-7a inhibitor blev høstet 72 h efter transfektion vaskes med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret i 1 ml 70% ethanol. Efter inkubation natten over ved 4 ° C i ethanol blev celler vasket i PBS og suspenderet i 500 pi propidine iodid (PI) 30 min før flowcytometri. Populationer i G0-G1, S og G2-M-fasen blev målt ved flowcytometri (EPICS XL, Coulter, Miami FL), og data blev analyseret ved anvendelse af Multicycle-DNA Cell Cycle Analyseret Software. Målingen blev udført tre gange.

Dual-luciferase reporter assay

For at undersøge om E2F2 og CCND2 udtryk blev reguleret af Lad-7a, blev en dual-luciferase reporter assay udføres. 3′-UTR af CCND2 og E2F2 blev amplificeret ved PCR hhv. Forstærkning af CCND2 anvendt følgende primere:

5′-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 ‘Hotel (fremad) og

5′-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3′

(tilbage). PCR-produkter blev 398 bp og indeholdt to bindingssteder for Lad-7a. Det muterede 3′-UTR af CCND2 blev syntetiseret efter punktmutationer blev fremstillet i flere baser inden bindingsstederne i disse PCR-produkter. Forstærkning af 3′-UTR af E2F2 brugte følgende primersekvenser:

5′-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 ‘Hotel (frem) og 5

‘ – GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 ‘

(tilbage). PCR-produkterne blev 415 bp og indeholdt to bindingssteder for lade-7a. Muterede 3′-UTR af E2F2 blev syntetiseret efter flere punktmutationer blev foretaget i bindingsstederne PCR-produkter. Efter restriktionsspaltning blev opformerede gener klonet i de tilsvarende steder i en rekonstrueret pGL3 ekspressionsvektor. PRL-TK kontrol vektor, der udtrykker Renilla luciferase (Promega) blev anvendt til normalisering af celleantal og transfektionseffektivitet. Cotransfections af syntetisk Lad-7a-sekvens (efterligner) og NC, eller lad-7a-inhibitor og NC-inhibitor blev også udført i humane embryonale nyreceller HEK293A ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Firefly og Renilla luciferaseaktivitet blev bestemt ved Pikkagene Dual Luciferase Assay System (Toyo-B-Net)

Western blotting analyse

Følgende antistoffer blev anvendt til western blotting:. Muse-anti-E2F2 ( 1:200 fortynding, Santa Cruz Biotech); muse anti-cdk4 og muse-anti-cyclin D2 (1:300 fortynding BD Biosciences, San Jose, CA); muse-anti-k-RAS (1:300 fortynding Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin-anti-β-actin (1:4000 fortynding, Sigma). Femogtyve mikrogram prostatakræft prøver og deres tilgrænsende ikke-tumorøse enheder «protein samt PC3-let-7a-GFP og PC3-GFP-protein blev elektroforesebehandlet i 10% SDS-PAGE minigeler og overført på Hybond C nitrocellulosemembraner (Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK). Efter inkubation med primære antistoffer ved 4 ° C natten over blev nitrocellulosemembranerne vasket tre gange med Tris-saltvand Tween-20 (TBST) og derefter inkuberet med fluorecein (FITC) -konjugeret gede anti-mus eller ged-anti-kanin IgG (1:500 fortynding, Sigma) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med TBST blev blots visualiseret ved hjælp af Odyssey Infrarød Imaging-system (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska USA). Hvert assay blev gentaget tre gange.

Tumorigenicitet

Fem nøgne mus blev subkutant injiceret med ~ 1 x 10

6 PC3-let-7a-GFP eller PC3-GFP-celler ved en enkelt site af ryggen. Vægten af ​​tumoren og vægten af ​​musen blev målt på tidspunktet for aflivning (4 uger efter injektion). Western blotting blev udført for at undersøge, om E2F2 og CCND2 blev nedreguleret i nøgen-mus xenograftmodel. Tumor suspensioner blev behandlet med lysisbuffer og western blotting blev udført i overensstemmelse med de ovenfor beskrevne procedurer.

Statistisk analyse

Forskelle mellem hver gruppe blev bestemt ved T-test eller Mann-Whitney

U

test med Statistisk SPSS softwarepakke (SPSS Inc., Chicago) (

s

0,05 blev betragtet som signifikant).

Resultater

Lad-7a nedreguleret i resektion prostatacancer prøver og i prostatacancerceller

Real-time RT-PCR viste, at ekspressionsniveauerne af lad-7a blev nedsat med ~43% i reseceret human prostatacancer prøver sammenlignet med den tilstødende ikke -cancerous prøver. Prostata cancer cellelinjer LNCaP kun udtrykkes -70% som lad-7a end normale prostata epitelceller Prec. Derudover er mængden af ​​lad-7a-ekspression i PC3-celler og DU-145 var omkring 50% af den observeret i Prec. Disse resultater indikerer, at lade-7a er faldet i prostatacancer, herunder androgen-uafhængige cancere PC3 (. Figur 1, *

s Restaurant 0,05; **

s Restaurant 0,01) .

Real-time RT-PCR viser, at den relative ekspression af lad-7a i seksogtyve prostatacancer prøver, og i prostata cancercellelinier LNCaP, PC3, DU-145 er højere end i deres tilstødende ikke-kræft prøver og den normale prostata epitelcelle Prec. Data er vist som procent af middelværdier signaler i væv og celler fra tre uafhængige målinger. RNU6B blev målt parallelt og anvendes til at normalisere ekspressionsniveauet af lad-7a i hvert forsøg. Værdier repræsenterer middelværdier og fejlsøjler repræsenterer SEM. (*

s

0,01, **

s

0,01; Mann-Whitney-U-test).

Lad-7a hæmmer cellevækst

In vitro

og inducerer standsning af cellecyklus ved G0-G1-fasen

Efter transfektion ekspressionsniveauet af lad-7a i PC3-let-7a-GFP var ~300% højere end i PC3-GFP af real-time RT-PCR; En ti-fold stigning i ekspressionen af ​​Lad-7a blev observeret i PC3 celler transficeret med lad-7a (efterligner) versus dem transficeret med NC (Fig 2A,

s

. 0,01). Dette indikerede, at transfektion passende blev udført. Kolonidannelse analyse viste, at kolonier dannelse evne PC3-let-7a-GFP-celler er ~ 40% mindre end den for kontrolceller (fig 2B,

s.

0,01). MTT vækstkurver viste, at fra den anden dag, overlevelsen af ​​lad-7a transficerede PC3-celler og LNCaP-celler er signifikant mindre end for negativ kontrol, og overlevelsen af ​​lad-7a inhibitor transficerede PC3-celler og LNCaP-celler er signifikant mere end det af NC inhibitor transfekterede celler (fig 2C,

s.

0,05). Flowcytometri viste, at procentdelen af ​​lad-7a transficerede PC3-celler og LNCaP-celler i G0-G1-fasen var -30% (PC3) og 16% (LNCaP) højere end den for negativ kontrol, som modsvares af en -50% ( PC3) og 20% ​​(LNCaP) fald i S-fasen. procentdelen af ​​lad-7a inhibitor transficerede PC3-celler og LNCaP-celler i G0-G1-fasen var ~23% (PC3) og 19% (LNCaP) mindre end det fra NC inhibitor transficerede celler, som modsvares af en ~33% (PC3 ) og 25% (LNCaP) stigning i S-fasen (fig 2D, *

s

. 0,05; **

s

0,01). Disse data indikerer, at lade-7a inhiberer PC3 proliferation ved induktion celle-cellecyklusstandsnings ved G1 /S-fase.

(A) Relativ ekspression af lad-7a i PC3-celler transficeret med pcDNA3-GFP, pcDNA3-bogstav 7a-GFP, NC, og lad-7a (efterligner). RNU6B blev målt parallelt og anvendes til at normalisere ekspressionsniveauet af lad-7a i hvert forsøg. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. (**

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test). (B) PC3-let-7a-GFP og PC3-GFP-celler blev dyrket i medium indeholdende blød agar og inkuberet i 18 d. Antallet af foci 100 um blev talt. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. (*

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test). (C) levedygtighed PC3-celler og LNCaP-celler, der er transficeret med lad-7a, NC eller lad-7a-inhibitor, blev NC-inhibitor målt ved MTT-assays hhv. UV-synlig absorbans blev målt ved 490 nm. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. (*

s

0,05; Parret-Sample t-test). (D) Analyse af cellecyklus i PC3-celler efter transficeret med NC og lad-7a (efterligner) eller NC inhibitor og lad-7a-inhibitor, samt analyse af cellecyklus i LNCaP-celler efter transficeret med NC og lad-7a (efterligner ) eller NC inhibitor og lad-7a-inhibitor. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. (*

s

0,05, **

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test).

Lad -7a mål 3’UTR af E2F2 og CCND2

Figur 3A viser sekvenserne af 3’UTR’er af E2F2 og CCND2 der repræsenterer bindingsstederne for lade-7a. De tilsvarende sekvenser af de muterede 3’UTR’er af E2F2 og CCND2 vises også. Ingen reduktion af luciferaseaktivitet blev observeret i HEK293A celler transficeret med lad-7a (efterligner) og muteret CCND2 eller E2F2. Men mere end 30% reduktion af luciferaseaktivitet blev observeret med vildtype CCND2 og -50% reduktion af luciferaseaktivitet blev observeret med vildtype-E2F2 (Fig 3B, **

s

. 0,01). Sammenlignet med NC-inhibitor, er der ingen signifikant forskel i luciferaseaktivitet når HEK293A celler blev transficeret med lad-7a-inhibitor og vildtype CCND2 eller E2F2 (fig. 3C). Disse data understøtter, at E2F2 og CCND2 er direkte mål for lad-7a og endogene Lad-7a i HEK293A har ingen interferens til vores erfaring.

(A) bindingssteder på E2F2 og CCND2 for lad-7a med den tilsvarende muterede E2F2 og CCND2 sekvenser. (B) Relativ luciferaseaktivitet af humane embryonale nyreceller HEK293A efter transfektion med NC eller lad-7a (efterligner) og derefter også co-transficeret med pRL-TK kontrol vektor eller pGL3 ekspressionsvektor indeholdende enten WT-CCND2-3’UTR eller MUT-CCND2-3’UTR eller WT-E2F2-3’UTR eller MUT-E2F2-3’UTR. (C) Relativ luciferaseaktivitet af humane embryonale nyreceller HEK293A efter transfektion med NC-inhibitor eller lad-7a inhibitor og også co-transficeret med pRL-TK styrevektor eller pGL3 ekspressionsvektor indeholdende enten WT-CCND2-3’UTR eller WT-E2F2-3’UTR. Værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. (**

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test).

Lad-7a hæmmer ekspressionen af ​​E2F2, CCND2

Real-time RT-PCR viser, at mRNA relative udtryk for E2F2 og CCND2 i prostata cancer væv og i LNCaP, PC3, og DU-145 celler er opreguleret i forhold til deres tilstødende ikke-kræft prøver og Prec celler (fig. 4A, B, *

s

0,05; **

s

0,01). Men i forhold til Prec, mRNA ekspressionen af ​​E2F2 og CCND2 er nedreguleret efter transficeret med lad-7a i PC3 og LNCaP celler (Fig 4C, D, *

s

. 0,05; **

p

0,01). Western blotting-resultater viste ingen ændring af CDK4-proteinekspression mellem prostatakræft væv og deres tilstødende ikke-tumor-væv eller mellem PC3-let-7a-GFP-celler og PC3-GFP-celler, ekspressionsniveauerne af E2F2, CCND2 steg i prostatacancer væv sammenlignet med deres tilstødende ikke-tumor-væv, men ekspressionsniveauerne af E2F2, CCND2 og K-ras faldt drastisk i PC3-let-7a-GFP-celler sammenlignes med den i PC3-GFP-celler (fig. 4E). K-RAS, en tidligere defineret molekylært mål af lad-7a [7] blev anvendt som en positiv kontrol til disse eksperimenter. Disse data understøtter, lad-7a nedregulering af mRNA ekspression af E2F2 og CCND2 og undertrykke proteintranslation af dem.

(A) Real-time RT-PCR viser, at relative ekspression niveau af E2F2 i prostatacancer væv og i LNCaP, PC3, og DU-145 celler er meget højere end i deres tilstødende ikke-kræft prøver og Prec celler (*

s

0,05, **

s

0,01 ; Mann-Whitney-

U

test). (B) Real-time RT-PCR viser, at den relative udtryk niveau af CCND2 i prostata cancer væv og LNCaP, PC3 og DU-145 celler er meget højere end i deres tilstødende ikke-kræft prøver og Prec celler (*

s

0,05; Mann-Whitney-

U

test). (C) Real-time RT-PCR viser, at den relative udtryk niveau af E2F2 i LNCaP og PC3 celler er mindre end i Prec celler efter transficeret med lad-7a (*

s

0,05, **

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test). (D) Real-time RT-PCR viser, at den relative udtryk niveau af CCND2 i LNCaP og PC3 celler er mindre end i Prec celler efter transficeret med lad-7a (*

s

0,05; Mann-Whitney-

U

test). Alle værdier repræsenterer middelværdier fra tre separate forsøg og fejl søjler repræsenterer SEM. GAPDH blev målt parallelt og anvendes til at normalisere ekspressionsniveauerne af E2F2 og CCND2 i hvert forsøg. (E) Western blotting viser, at ingen ændring af CDK4 ekspression mellem prostatakræft væv og deres tilgrænsende ikke-kræft prøver, eller mellem PC3-let-7a-GFP-celler og PC3-GFP-celler. Ekspressionsniveauerne af E2F2 og CCND2 er højere i prostatakræft væv end i deres hosliggende ikke-kræft prøver. Efter transficeret med lad-7a, ekspressionsniveauerne af E2F2, CCND2, og K-RAS faldt drastisk i PC3-let-7a-GFP-celler sammenlignes med den i PC3-GFP-celler. β-actin blev anvendt lastning kontrol.

Lad-7a hæmmer tumorvækst i nøgne mus xenograftmodel

Nude mus med PC3-lad-7a-GFP eller PC3-GFP xenografter blev aflivet 4 uger efter inokulering. Tumorer blev udskåret og målt (fig. 5A). Western blotting viste, at ekspressionsniveauer af E2F2 og CCND2 faldet drastisk i PC3-lad-7a-GFP tumorer sammenlignet med PC3-GFP tumorer (fig. 5B). Vægten af ​​PC3-lad-7a-GFP tumorer var -80% lettere end PC3-GFP tumorer (Fig 5C,

s

. 0,01). Endvidere er forholdet mellem tumorvægt /legemsvægt hos mus der bærer PC3-let-7a-GFP tumorer var kun -6% af forholdet fra mus, der bærer PC3-GFP tumorer (Fig 5D,

s Restaurant 0,01), som giver stærke beviser, lad-7a kan hæmme tumorvækst

in vivo

.

(A) Fotografi af udskårne tumorer 4 uger efter implantation. Den øverste række viser tumorer udskåret fra mus injiceret med PC3-GFP celler. Den lavere er tumorer udskåret fra mus injiceret med PC3-let-7a-GFP-celler. Af mus injiceret med PC3-let-7a-GFP-celler, blev der ikke tumor påvist i en mus og en mus døde 2 dage efter injektion. (B) Western-blotting viste, at ekspressionen af ​​E2F2 og CCND2 faldet drastisk i tumorer udskåret fra PC3-let-7a-GFP-tumor-Bearin mus sammenlignet med dem med PC3-GFP tumorer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (C) Tumorvægt og (D) forholdet mellem tumorvægt /legemsvægt blev bestemt, når musene blev aflivet. Værdier repræsenterer middelværdier og fejlsøjler repræsenterer SEM. (**

s

0,01; Mann-Whitney-

U

test).

Diskussion

Den manglende evne af en celle til regulere vækst og proliferation er et særkende for kræft. Som kritiske molekyler i celle-cyklus regulering, E2F proteiner nedstrøms for vækst-faktor signalering kaskader. De påvirker cellevækst og proliferation gennem deres evne til at regulere gener involveret i cellecyklus-progression [10], [11]. E2F2 er medlem af E2F-familien af ​​transkriptionsfaktorer, og er blevet godt karakteriseret som en regulator af G1-til-S-faseovergangen [12]. Tidligere rapporter indikerer, at E2F2 har stærke onkogen kapacitet og kan fremme cellecyklusfremadskriden. Cellelinjer transficeret med E2F2 formere dobbelt så hurtigt af kontrol celler [13]. For korrekt fremadskriden gennem cellecyklussen, phosphorylering aktivitet af cyclin-afhængig kinase (Cdk) er vigtig. CCNDs er udtrykt i den tidlige G1-fasen og binder CDK4 og Cdk6 [14]. Aktiveringen af ​​disse kinaser resulterer i phosphorylering af andre kritiske celle-cyklus regulatorer såsom pRb. pRb aktiverer derefter E2F’ere og tillader S-fase indtastning. Følgelig vil afvigende ekspression af CCND2 og E2F2 føre til unormal cellulær proliferation. Overekspression af CCND2 blev rapporteret i æggestokkene granulose celletumorer, mavekræft og tarmkræft [15] – [17]. Tilsvarende opregulering af E2F2 blev fundet i astrocytomer af forskellige kvaliteter [18].

miRNA post-transkriptionelt regulere genekspression ved binding til 3’UTR af target mRNA’er. Bindende fører til nedbrydning af mål mRNA og reduceret oversættelse af target proteiner. miRNA aktivitet påvirker også ekspressionen af ​​gener, som er nedstrøms for direkte mål og kan føre til ændringer i de globale protein udtryk profiler. Derfor miRNA potentielt spille en kritisk rolle i udviklingen af ​​human cancer. En stor del af beviser understøtter, at afvigende ekspression af miRNA forekommer i forskellige typer af human cancer, og på forskellige stadier af kræft progression [19], [20]. Lad-7 er blevet rapporteret at virke som en tumorsuppressor i visse kræfttyper, såsom lunge- og coloncancer [9], [21] – [23], og at reducerede ekspressionsniveauer af lad-7 er korreleret med dårlig klinisk prognose [ ,,,0],24].

Selvom denne korrelation mellem lad-7-ekspression og sygdom er stærkest i lungevæv, hvor lad-7-ekspression er højt, vores undersøgelse fastslår, at lade-7 forårsager cellecyklus defekter i prostatacancer-cellelinie som godt. Vi fandt, at lade-7a ekspressionsniveauet nedreguleres dramatisk i prostatakræft væv og cellelinjer. Protein- og mRNA ekspressionsniveauer af E2F2 og CCND2 er nedreguleres i PC3 og LNCaP-celler efter transfektion med let-7a. Vores xenograftmodeller på prostatakræft også at bekræfte vores

in vitro

resultater og vise, at lade-7a har evnen til at hæmme prostata tumor udvikling

in vivo

. Vores dual-luciferase reporter assay bekræftet, at E2F2 og CCND2 er direkte mål for lad-7a. Desuden har andre gener associeret med celle-cyklus regulering blevet rapporteret at være undertrykt direkte eller indirekte af lad-7. Disse omfatter CDC34, som fremmer nedbrydningen af ​​cyclin-afhængig kinase (CDK) inhibitor 1B og CCNA2, som fremmer G1-S og G2-M faseovergange [25]. Vores grundlæggelsen udvider familien af ​​lad-7 mål, og identificere de molekylære veje ramt i kræft kunne yderligere afsløre de mekanismer, som lader-7a hæmmer celledeling. Selvom meget er stadig at lære om den rolle, lad-7a i prostatakræft tumorigenese, lad-7a giver os en ny måde at prostatakræft behandling via sin evne til at fremkalde cellecyklusstop og hæmme cellevækst.

Støtte Information

tabel S1.

Clinic patologiske faktorer af 26 patienter i øjeblikket anvendes

doi:. 10,1371 /journal.pone.0010147.s001

(0,08 MB DOC)

Text S1. Salg Sekvenser af syntetisk Hsa-lad-7a, negativ kontrol, Hsa-lad-7a-hæmmer og Inhibitor negativ kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0010147.s002

(0,02 MB DOC)

Tak

Vi vil gerne anerkende Lijie Han for fremragende redaktionelle assistance og indsigtsfulde forslag.