PLoS ONE: Glukokortikoid forordning af SLIT /ROBO Tumor undertrykkende gener i æggestokkene overfladeepitelet og kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

De tre SLIT ligander og deres fire robo receptorer har fundamentale roller i pattedyrs udvikling ved at fremme apoptose og repulsing afvigende celle migration.

slidser

robos

er opstået som kandidat tumorsuppressorgener hvis ekspression hæmmes i en række forskellige epiteliale tumorer. Vi viste, at deres ekspression kan reguleres negativt af cortisol i normale ovariale luteale celler. Vi antaget, at den lokalt producerede cortisol efter ægløsning ville hæmme

SLIT /ROBO

udtryk i æggestokkene overflade epitel (OSE) at lette dens reparation og at denne lovgivningsmæssige vej var stadig til stede, og kunne manipuleres, i æggestokkene epitelial cancerceller. Her undersøgte vi udtrykket og regulering af SLIT /ROBO vej i OSE, kræft i æggestokkene epitelceller og æggestokkene tumorcellelinjer. Basal

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

udtryk var lavere i primære kulturer af kræft i æggestokkene epitelial celler sammenlignet med normale OSE (

P

0,05) og i dårligt differentierede SKOV-3 celler i forhold til de mere differentierede PEO-14-celler (

P

0,05). Cortisol reducerede udtryk for visse

slidser

robos

i normal OSE og PEO-14-celler (

P

0,05). Desuden blokerer SLIT /ROBO aktivitet reduceret apoptose i både PEO-14 og SKOV-3 tumorceller (

P

0,05). Interessant

SLIT /ROBO

udtryk kunne øges ved at reducere ekspressionen af ​​glukokortikoid receptor hjælp siRNA (

P

0,05). Samlet vores resultater viser, at en rolle af cortisol i postovulatoriske fase kan være midlertidigt hæmme SLIT /ROBO udtryk for at lette regenerering af OSE. Derfor kan denne vej være et mål at udvikle strategier til at manipulere SLIT /ROBO-system i æggestokkræft

Henvisning:. Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011) glukokortikoid Regulering af SLIT /ROBO Tumor undertrykkende gener i æggestokkene overfladeepitelet og æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10,1371 /journal.pone.0027792

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: April 4, 2011; Accepteret: 25 Oktober 2011; Udgivet: 23 November, 2011

Copyright: © 2011 Dickinson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. WCD er understøttet af en skotsk Senior Clinical Fellowship fra den skotske Funding Rådet og dette arbejde blev finansieret af CSO (SCD /02). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udskilles Slit glycoprotein og dets Robo receptor blev oprindeligt identificeret som vigtige axon vejledning molekyler i udviklingslandene

Drosophila

nervesystem [1], [2]. Deres rolle er evolutionær bevaret som hvirveldyr SLIT (SLIT1, SLIT2, SLIT3) og ROBO (ROBO1, ROBO2, ROBO3, ROBO4) også hæmme afvigende neuron migration [3]. Men de fleste medlemmer af hvirveldyr SLIT og ROBO familier udtrykkes også uden for nervesystemet og er blevet forbundet med udviklingen af ​​en række forskellige organer, herunder mælkekirtlen og ovarie [4], [5]. Under organogenesen den SLIT /ROBO interaktion menes at regulere en lang række processer, herunder celleproliferation, apoptose, vedhæftning og migration af ikke-neuronale celler [6], [7].

molekyler, der har en vigtig rolle i udviklingen er ofte dysreguleret i kræft [8]. Faktisk

slidser

robos

er kandidat tumorsuppressorgener hvis udtryk er reduceret i talrige epitelial tumor celletyper, primært gennem sletning, tab af heterozygositet og promoter region hypermethylering [9]. Dette omfatter kræft stammer fra reproduktive væv, herunder livmoderhalskræft, prostata og ovarie kim-line tumorer [10] – [13]. Nylige funktionelle undersøgelser har også støttet den teori, at de spalter og robos har tumor suppressor aktiviteter. Slidsen /ROBO vej fremmet programmeret celledød og /eller reduceret spredning af fibrosarcom, øsofagus, hepatocellulære, kolorektale, prostata- og brystcarcinomaceller [14] – [17]. SLIT2 hæmmede også invasionen af ​​talrige forskellige typer af tumorceller, herunder dem fra prostata, bryst, endometrium og æggestok [13], [18], [19].

SLIT /Robo-vejen har nu også været vist at have fysiologiske roller i normale reproduktive væv [6]. SLIT /ROBO signalering synes at regulere placental angiogenese og trofoblasten funktion på en autokrin og /eller parakrin måde [20]. Desuden er de fleste af spalterne og robos også tidsmæssigt reguleret under den normale menstruationscyklus i endometriet og udtrykkes i æggelederen [21]. Desuden er der øget ekspression af det

slidser

robos

i den voksne corpus luteum under den sene lutealfasen af ​​æggestokkene cyklus. På dette tidspunkt SLIT /ROBO interaktion kan handle for at fremme sin disintegration ved at stimulere apoptose og hæmning migrering af luteal celler [22]. I corpus luteum og endometrium udtryk for spalter og robos er hormonelt reguleret. Der blev reduceret

SLIT /ROBO

udtryk i decidualised endometrium af tidlig graviditet [21]. Desuden de luteotropisk molekyler, humant choriongonadotropin [23] og cortisol [24], som er steget i begyndelsen af ​​graviditeten, reducere udtryk for

slidser

robos Salg In luteal celler [22] .

Omkring 90% af æggestokkene maligniteter er klassificeret som epiteltumorer, der menes at stamme fra æggestokkene overflade epitel (OSE) [25]. Risikoen for kræft i æggestokkene er positivt korreleret med antallet af ægløsninger [26]. Således tilbagevendende skade og efterfølgende reparation af OSE under ægløsning kan prædisponere denne væv til neoplasi [27]. Ægløsning er en inflammatorisk begivenhed forstyrre OSE, men kræver opløsning. Denne reparation lettes af en øget lokal produktion af anti-inflammatoriske steroid cortisol via opregulering af 11ß-hydroxysteroiddehydrogenase type 1 [28].

Vi antaget, at OSE udtrykker spalter og robos og at cortisol kunne midlertidigt reducere ekspressionen af ​​disse tumorsuppressorgener at lette overlevelse, proliferation og migration af disse celler under reparationsprocessen. Hvis dette var tilfældet denne vej kan have en rolle i ovariecancer progression og hvis den forbliver aktiv i maligne OSE celler, det kan tilbyde terapeutiske strategier for at manipulere disse gener. Vi undersøgte derfor udtrykket, lokalisering og regulering af SLIT /ROBO vej i OSE. Vi undersøgte også, om de spalter og robos afvigende blev udtrykt og hormonelt reguleret i æggestokkene cancerceller. Derudover analyserede vi den funktionelle betydning af en forstyrret SLIT /ROBO vej i æggestokkene cancerceller.

Resultater

spalten /ROBO vej er differentielt udtrykt i human OSE, kræft i æggestokkene celler og æggestokkene tumor celle linjer

SLIT2 og ROBO1 kunne immunolocalised til det normale humane ovarie overflade epitel (fig. 1A-C). RT-PCR-analyse bekræftede udtryk for

SLIT2

ROBO1

i primære kulturer af OSE og viste, at der var nogle udtryk for

SLIT3

,

ROBO2

og

ROBO4

i disse celler (fig. 1D). Vi undersøgte derefter ekspressionen af ​​disse gener i primære kulturer af maligne celler afledt fra ascitesvæsken af ​​kvinder med epitelial ovariecancer.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

blev også til udtryk i disse celler, men kvantitativ analyse viste, at de blev reduceret med 25-82% i forhold til primære kulturer af normal OSE (figur 2A.) (

P

0,05).

A) Lys-field mikroskopi af æggestok viser specifik farvning for SLIT2 (brun) i OSE. B) Ligeledes positivt ROBO1 (brun) farvning blev også observeret i OSE. C) Ingen farvning blev observeret i negative kontroller. Scale søjler repræsenterer 100 um. D) RT-PCR for

slidser

robos

i dyrkede slange. Med undtagelse af

SLIT1

ROBO3

medlemmerne af

SLIT

og

ROBO

familier blev udtrykt i slangen. FB = føtal hjerne positiv kontrol; Rt = RT negativ negativ kontrol.

A) Real-time kvantitativ PCR viser forøget

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

i primære kulturer af slange i forhold til maligne epitelceller dyrket fra ascites i æggestokkene kræftpatienter. B) RT-PCR, som viser, at både de SKOV-3 og PEO-14 cellelinjer udtrykte

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ROBO2

. C) Real-time kvantitativ PCR viser

SLIT2

,

SLIT3

og

ROBO2

udskrifter blev mere rigelige i godt differentierede PEO-14 celler sammenlignet med dårligt differentieret Skov- 3-celler. FB = føtal hjerne positiv kontrol; Rt = RT negativ negativ kontrol; – = DNA negativ negativ kontrol; * =

P

0,05; ** =

P

0,01; *** =

P

0,005

For at bekræfte, at maligne OSE celler havde en reduceret ekspression af

slidser

og

robos

undersøgte vi deres ekspression i to forskellige æggestokkene tumorcellelinier. PEO-14 cellelinien er afledt fra en veldifferentieret ovarie adenocarcinom og har ligheder med mere godartede ovarieepitelceller og tidlig ovariecancer. I modsætning hertil er det SKOV-3 cellelinie afledt fra et dårligt differentieret ovarie adenocarcinom og er mere karakteristisk for en avanceret tumor [29]. Begge disse cellelinjer udtrykte

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ROBO2

(Fig. 2B). Men parallelt vores resultater i den primære cellekultur,

SLIT2

,

SLIT3

og

ROBO2

udtryk blev reduceret med mellem 58% og 97% i dårligt differentierede Skov- 3 celler sammenlignet med de godt differentierede PEO-14-celler (figur 2C.) (

P

0,05). Selvom PEO-14 og SKOV-3-celler kan variere i andre aspekter samt deres differentiering status antyder disse data, at ekspression af

SLIT /ROBO

tumorsuppressorgen pathway kan være nedsat under tumorudvikling eller progression.

Blokering af SLIT /ROBO interaktion nedsætter apoptose i ovarietumorceller

virkningen af ​​SLIT /ROBO pathway på celleoverlevelse blev undersøgt under anvendelse af en rekombinant ROBO1 /Fc-kimære, der virker som en ligand fælde at hæmme SLIT /ROBO interaktion, og direkte hæmning af

SLIT2

bruge siRNA. Behandling af PEO-14 og SKOV-3-celler med ROBO1 /Fc-kimære påvirkede ikke celleproliferation (

P

0,05, data ikke vist). Men i begge PEO-14 og SKOV-3-celler blokerer SLIT aktion med ROBO1 /Fc-kimære reduceret apoptose med 20-21% målt ved en aktiveret caspase-3/7-assay (

P

0,05 ) (fig. 3A). Forbigående transfektion af

SLIT2

siRNA udelukkende reduceret

SLIT2

udtryk i både PEO-14 og SKOV-3 celler. PEO-14 og Skov-3 celler med reduceret

SLIT2

udtryk haft en betydelig 17-26% fald i kløvet caspase-3 og -7 aktiviteter (

P

0,05, parret t- test) (fig. 3B). Dette antyder, at en reduktion af SLIT /ROBO gen pathway er forbundet med øget celleoverlevelse.

A) Behandling med ROBO1 /Fc-kimære reducerede caspase-3/7 Aktivitetsmenutast, sammenlignet med behandling PBS /0,1% (w /v) BSA (kontrol) i begge PEO-14 og SKOV-3-celler. B) Transfektion med

SLIT2

siRNA reducerede caspase-3/7 Aktivitetsmenutast, sammenlignet med behandling med en kodet siRNA kontrol. * =

P

. 0,05

Cortisol regulerer ekspressionen af ​​negativt

slidser

robos

i OSE og et godt differentierede ovariecancer cellelinje

Vi derefter undersøgt, om ekspressionen af ​​slidsen /ROBO pathway i ovarieepitelceller blev reguleret. I humane ovarie luteal celler SLIT /ROBO pathway kunne fysiologisk inhiberes af cortisol [22]. Som cortisol produceres lokalt i OSE, og har en anti-inflammatorisk rolle efter ægløsning [30], vi undersøgte, om cortisol kunne regulere SLIT /ROBO udtryk i OSE.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

udtryk blev reduceret med 25-30% i kortisol ( 1000 nM) behandlede primære kulturer af normal OSE (

P

. 0,05) (fig 4A). Men i primære kulturer af maligne epitelceller cortisol resulterede ikke i nogen yderligere reduktion i ekspressionen af ​​disse gener (

P

0,05) (fig 4B.)

A) Real. -time kvantitativ PCR viser, at kortisol (1000 nM) sammenlignet med ethanol carrier kontrol, reduceret

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

og

ROBO4

udtryk i primære kulturer af slange. B) Cortisol ændrede ikke udtryk for

slidser

robos

i primære kulturer af ovarieepitelceller kræftceller. C)

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ROBO2

udtryk blev signifikant reduceret med cortisol i mere differentierede PEO-14 celler. D) Men udtryk af disse

slidser

robos

ikke var reguleret af cortisol i dårligt differentierede SKOV-3 celler. E) Cortisol reduceret udskilte niveauer af SLIT2 protein i PEO-14-celler (kontrol sekretion er 0,5 ng /ml). F) Cortisol påvirkede ikke udskilte niveauer af SLIT2 protein i de SKOV-3-celler (kontrol sekretion er 0,5 ng /ml). * =

P

0,05; ** =

P

. 0,01

PEO-14 og SKOV-3 æggestokkene tumor cellelinier har også potentiale til at reagere på cortisol behandling som de udtrykker det glukokortikoid receptor (GR). Desuden de udtrykker mineralcorticoidreceptoren (MR), men udtrykker ikke progesteronreceptoren (PR) (fig. 5A). I de mere differentierede PEO-14 celler, cortisol reducerede udtryk for

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ROBO2

med 13-31% (

P

0,05) (. figur 4C). Desuden reducerede cortisol behandling udskilt SLIT2 proteinkoncentration med 53% (

P

0,05) (. Figur 4E). Ligesom de primære cellekulturer, regulering af disse

slidser

robos

, samt det udskilte SLIT2 protein, blev tabt i de mere ondartede, og mindre differentierede, SKOV-3 celler (

P

0,05) (fig 4D, F).. Dette antyder, at kortisol kan have en fysiologisk rolle i at reducere SLIT /ROBO interaktion under reparation af OSE og at denne vej kan stadig være aktiv i nogle tidlige fase æggestokkene kræftformer.

A) RT-PCR, som viser, at PEO -14 og SKOV-3 celler udtrykte

GR

og

MR

men ikke

PR

. Den brysttumorcellelinje HTB-19 blev anvendt som en positiv kontrol og Rt blev anvendt som en negativ kontrol. B) Real-time kvantitativ PCR påviser, at transfektion med

GR

siRNA reduceret

GR

udtryk i begge cellelinier sammenlignet med scrambled (sc) siRNA kontrol. C) Bekræftelse af, at

GR

siRNA påvirkede ikke

MR

udtryk i PEO-14 og SKOV-3 celler. D) kvantitativ real-time PCR viser en stigning i

SLIT2

,

ROBO1

ROBO2

udtryk efter

GR

banke ned af

GR

siRNA i PEO-14-celler. E) Påvisning af, at

GR

siRNA transficerede SKOV-3 celler også var steget

SLIT2

og

ROBO1

udtryk. * =

P

0,05

Manipulation af

slidser

robos

i æggestokkene tumorceller ved at målrette den glukokortikoid receptor

, selvom glukokortikoider har en teoretisk negativ indvirkning på tidlige ovariecancerceller, betyder det således at manipulation af GR, med det formål at øge

SLIT /ROBO

genekspression, er et potentielt terapeutisk mål. Vi har derfor “slået ned”

GR

bruge

GR

siRNA i kortisol-responsive PEO-14 celler. Transfektion af

GR

siRNA i 48 timer medførte en signifikant reduktion i 63%

GR

udtryk (

P

0,001) (. Figur 5B) uden at påvirke

MR

ekspression (fig. 5C). Denne øgede ekspression af

SLIT2

,

ROBO1

ROBO2

tumorsuppressorgener (

P

0,05) (. Figur 5D). Hertil kommer, transfektion af

GR

siRNA resulterede i en tilsvarende reduktion i

GR

udtryk i cortisol-reagerer SKOV-3 celler (

P

0,01) ( fig. 5B). Vigtigere udtryk for

SLIT2

ROBO1

tumorsuppressorgener blev også forstærket af

GR

siRNA transfektion (

P

0,05) (Fig . 5E).

PEO-14 og SKOV-3-celler blev også behandlet med mifepriston (RU486), der fungerer som en GR-antagonist. RU486 behandling alene ikke indflydelse på ekspressionen af ​​

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

eller

ROBO2

i enten cellelinje (

P

0,05, data ikke vist). Men RU486 behandling gjorde afskaffe cortisol medierede negative regulering af

SLIT /ROBO

udtryk i PEO-14-celler (data ikke vist). Dette antyder, at der kan være ligand uafhængige effekter af GR på SLIT /ROBO udtryk og bekræfter, at selv i dårligt differentierede kræftceller manipulation af GR kan regulere ekspressionen af ​​tumorsuppressorgener.

Diskussion

i denne undersøgelse har vi etableret, at den normalt voksent menneske OSE udtrykker, på RNA-niveau,

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

. Brug af immunhistokemi vi viste også, at SLIT2 og ROBO1 også udtrykkes på proteinniveau. Da hver af spalterne er i stand til at interagere med hver af robos, med den mulige undtagelse af ROBO4, er det sandsynligt, at SLIT /ROBO interaktion forekommer i OSE. Dette er ikke overraskende, da disse molekyler udtrykkes i andre ovarieceller herunder granulosa lutein, theca lutein og luteale fibroblastceller af den voksne corpus luteum [22], og de præ-granulosaceller og oocytter fra primordiale follikler inden for udvikling af føtalt ovarie [5 ]. Den normalt ovarie er derfor et site af de fysiologiske autokrine eller parakrine aktioner af slidsen /ROBO systemet.

Vi fandt, at SLIT /ROBO systemet i normal OSE kan reguleres ved cortisol. Cortisol reducerede udtryk for

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

i primære kulturer af OSE celler . Vi har tidligere vist, at den samme koncentration af cortisol kan inhibere ekspressionen af ​​

SLIT2

og

SLIT3

i primære kulturer af luteinised granulosaceller og luteale fibroblastlignende celler [22]. Efter ægløsning er der en stigning i den lokale produktion af cortisol i OSE, der kan virke til at fremme vævsheling og fornyelse [28]. Over området af fysiologisk relevante koncentrationer i OSE celler cortisol er blevet vist at have en anti-inflammatorisk virkning og kan blokere interleukin-1 stimulerede MMP-9-ekspression [30], [31]. Derudover har vi tidligere vist, at kortisol, ved negativ regulering af ekspressionen af ​​spalter og robos, inhiberer apoptose og letter cellemigrering [22]. Dette indebærer, at efter ægløsning en af ​​virkningerne af lokalt producerede cortisol kan være midlertidigt reducere ekspressionen af ​​SLIT /Robo tumorsuppressorgener at lette reparation af den beskadigede OSE.

I mange epitelial kræft er der en tilhørende tab af ekspressionen af ​​medlemmer af SLIT /ROBO familie [9]. For eksempel faldt udtryk for

SLIT

er blevet observeret ROBO

udskrifter i spiserøret planocellulært, hepatocellulær, lunge, prostata og bryst carcinom [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Denne reduktion i udtryk er dog ikke universel og visse kræftformer, såsom gliomer [34] og tilbagevendende endometriecancer [35] opretholde eller forøge SLIT /ROBO vej. Men ændringer i ekspressionen af ​​denne vej i maligne epitelceller fra ovariecancer ikke tidligere er undersøgt.

Vi dyrket maligne epitelceller fra ascitesvæsken af ​​patienter med fremskreden epitelial ovariecancer og sammenlignet SLIT /ROBO ekspression til at det ved normal OSE. Vi fandt reduceret udtryk for

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ROBO4

i maligne celler. Selvom vi mener, at disse kulturer er rene kulturer af maligne ovarieceller [36], er det muligt, at der kan være ikke-maligne, forurenende celler i nogle kulturer. Vi har derfor også sammenlignet de godt differentierede PEO-14 celler med de dårligt differentierede SKOV-3 celler. I begge tilfælde havde de mere maligne celler lavere ekspression af spalterne og nogle af de robos. Det er derfor sandsynligt, at kræft i æggestokkene kan føjes til listen af ​​tumorer med nedsat SLIT /ROBO udtryk.

Vi gik på at undersøge, hvilken effekt en mindre aktiv SLIT /ROBO vej kan have på celle funktion. Nylige undersøgelser har antydet, at SLIT2 kan inhibere invasion af endometriske og ovarie tumorcellelinjer [19]. Vi har også vist, at hæmning af SLIT /ROBO signalering i primære kulturer luteal fibroblaster fremmes celle migration [22]. Desuden blokerer SLIT indsats luteal celler fra normalt ovarie inhiberede apoptose og reduceret i Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast [22]. Var der en reduktion i Caspase-3/7 medieret apoptose i PEO-14 og SKOV-3 celler, når SLIT /ROBO signalering blev inhiberet ved at blokere SLIT aktivitet under anvendelse af en ROBO1 /Fc-kimære og SLIT2 syntese under anvendelse siRNA teknologi. Øget apoptose, forbundet med reduceret ekspression af Bcl-2 og Bcl-xl anti-apoptotiske molekyler, blev set i SLIT2 transficerede fibrosarkomer og øsofageale pladecellecarcinomer [16]. SLIT2 kunne også inducere apoptose forbundet med aktivering af caspase 3 i bryst- og lunge tumorcellelinjer [37]. Alt i alt en reduktion i SLIT /ROBO aktivitet er forbundet med øget celle overlevelse og migration, og det vil sandsynligvis være relevant i kræft i æggestokkene og dens progression.

Hvis glukokortikoid-medieret hæmning af SLIT /ROBO vej er stadig manifesteret i maligne epitelceller i kræft i æggestokkene så cortisol kan have effekt på celle overlevelse og migration, der ville være til skade for patienten. I vores primære kulturer af fremskreden ovariecancer, såvel som den dårligt differentieret SKOV-3 æggestokkræft cellelinje blev reguleringen af ​​spalter og robos af cortisol tabt. Det blev dog opretholdt i mere differentieret PEO-14 tumorcellelinie. Dette indebærer, at vejen stadig kan være aktiv i de tidlige stadier af ovariecancer eller mindre maligne fænotyper. Interessant glukokortikoider kunne hæmme apoptose under fibrosarkom udvikling [38] og i æggestokkene tumorcellelinjer og celler fra ascitesvæsken af ​​patienter med ovariecancer [39]. Dexamethason kan også begrænse apoptose induceret af kemoterapi i en række forskellige tumortyper, herunder bryst-, prostata-, cervikale og ovariekarcinomceller [40] – [42]. Derfor kan stadig være mulig glucocorticoid inhibering af spalter og robos i nogle maligne celler.

Som opregulering af slidser er blevet vist at have inhibitoriske virkninger på tumorvækst og invasion er det muligt at manipulering af glucocorticoid pathway har terapeutisk nytte. RU486, en GR og PR-antagonist, kan inducere apoptose i prostata og ovariecancerceller [43], [44]. Blokade af cortisol aktivitet i PEO-14 og SKOV-3 celler, som mangler PR, hjælp RU486 ikke indflydelse på ekspressionen af ​​

slidser

robos

enten cellelinie. RU486 gjorde imidlertid afskaffe negative regulering af

SLIT /ROBO

udtryk i PEO-14 celler.

Endnu vigtigere, når vi hæmmede endogene

GR

udtryk, ved hjælp af siRNA, der var en stigning i ekspressionen af ​​visse

slidser

robos Salg In både PEO-14 og SKOV-3-celler. Dette indebærer, at

slidser

robos

kunne reguleres, på transkriptionsniveauet ved GR, og at en stor rolle for GR i at kontrollere

SLIT /ROBO

udtryk kan være ligand uafhængige. Vores bioinformatisk analyse viste adskillige GR-responsive og relaterede elementer (GRE’er) i promotorområder af

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

og

ROBO4

. Interessant nok i neuroblastomceller, det aktiverede GR direkte interagerer med p53 og inhiberer p53 afhængige cellecyklusstop og apoptose [45]. Imidlertid GR kan fungere som en tumorsuppressor i andre typer af tumorer, herunder hudkræft [46]. Derfor nøjagtige funktion af GR i cancer kunne være afhængig af tumor type.

Sammenfattende denne undersøgelse har tilvejebragt yderligere bevis at spalten /ROBO pathway har en rolle i normal ovarie fysiologi og reguleres af hormoner, herunder glukokortikoider. Vi har også vist, at de spalter og robos synes at være udtrykkes afvigende i ovariecancer. Desuden reduktion af denne vej kunne forøge tumorudvikling og progression gennem en dysregulering af cellulære processer, herunder apoptose og frastødning af celle migration. Samlet disse data understøtter konceptet, at reduktionen af ​​SLIT /ROBO vej er vigtigt i ondartet udvikling og progression. Denne forskning viser også, at målrette deres fysiologiske regulering af steroider kan have nytte i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

Cell og væv samling

Alle celler og væv blev opnået med informeret skriftligt samtykke efter godkendelse fra Lothian Medical Research Ethics Committee. Humane OSE-celler blev opnået fra æggestokkene hos præmenopausale kvinder (n = 5) undergår elektiv kirurgi for ikke-maligne gynækologiske tilstande som tidligere [29] beskrevne. Maligne epitelceller blev opnået fra ascitesvæsken af ​​kvinder (n = 8) har kirurgi for fremskreden epitelial ovariecancer som tidligere [36] beskrevne. Normal menneske ovarievæv var blevet indsamlet til en gratis undersøgelse [47]. Den SKOV-3 og PEO-14 cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af P. Pujol, INSERM, Montpellier, Frankrig og S. Langdon, University of Edinburgh, Edinburgh, UK.

Cell kultur og behandlinger

primære OSE og primærbatterier ovariecancerceller blev rutinemæssigt opretholdt i dyrkningsmedier bestående af Medium 199 (Invitrogen, Paisley, UK) og MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp., Gillingham, UK) (pH 7,3, 01:01 vv

-1) suppleret med 15% (vol /vol) kalvefosterserum, 50 IE /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 2 mM L-glutamin. PEO-14 og SKOV-3-celler blev dyrket i det samme medium, men det blev suppleret med 10% (vol /vol) FBS. For cortisol behandlingsundersøgelser celler blev podet i seks-brønds plader ved en densitet på 2 x 10

5 celler /brønd. Efter 24 timer frisk medium indeholdende enten 1000 nM Cortisol [22], [30], [31] i ethanol med eller ækvivalent volumen ethanol (0,001% v /v) blev tilsat til cellerne. I andre forsøg 50 pM RU486 [24] (Sigma) med og uden cortisol blev anvendt. Hver behandling blev udført i teknisk triplo. Efter 24 timer 1 ml medium blev fjernet fra hver brønd og opbevaret ved -20 ° C til enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) eksperiment og RNA blev ekstraheret fra cellerne som beskrevet nedenfor.

For ROBO1 /Fc behandlingsundersøgelser celler blev podet ved 2 × 10

4 celler /brønd i plader med 96 brønde. Efter 24 timer frisk medium indeholdende enten rekombinant rotte ROBO1 /Fc-kimær (R 1 pg /ml) eller tilsvarende volumen af ​​PBS /0,1% (vægt /volumen) BSA blev tilsat til celler. Behandlinger blev udført i teknisk firdobbelt. Otteogfyrre timer senere blev cellerne analyseret for apoptose ved anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay som beskrevet nedenfor.

lille interfererende RNA teknologi

Fireogtyve timer før transfektion PEO-14 eller SKOV-3-celler blev podet i antibiotiske frie medier, således at cellerne var 50% konfluente på tidspunktet for transfektion. Lille interfererende RNA-oligonukleotider mod GR og SLIT2 såvel som en negativ kontrol, med ingen signifikant sekvenslighed med humane gensekvenser, blev opnået fra Applied Biosystems (Warrington, UK). De blev transient transficeret i cellerne under anvendelse Oligofectamine transfektion reagens ifølge producentens anvisninger (Invitrogen). Kort fortalt blev siRNA oligonukleotider fortyndet til en slutkoncentration på 200 nM i Opti-MEM I reduceret Serum Media (Invitrogen) og kombineret med fortyndet Oligofectamine at tillade siRNA:Oligofectamine komplekser til dannelse ved stuetemperatur. Den siRNA:Oligofectamine kompleks blev derefter tilsat dråbevis til hver brønd, og cellerne blev derefter inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 48-72 timer. For ekspressionsanalyse eksperimenter blev cellerne dyrket i plader med 6 brønde, og hver transfektion blev udført tre gange. For caspase-3/7 Aktivitetsmenutast assay eksperimenter blev cellerne dyrket i 96-brønds plader og hver transfektion blev udført i fire eksemplarer.

Expression analyse

RNA blev ekstraheret fra hver brønd af cellerne under anvendelse af RNeasy Mini kit (QIAGEN Ltd., Crawley, UK) og behandlet med deoxyribonuklease i (QIAGEN). RNA blev anvendt som en skabelon for cDNA-syntese under anvendelse af Taqman reverse transcriptase reagenser (Applied Biosystems). Primere specifikke for

slidser

robos

tidligere er blevet beskrevet i detaljer [22]. PCR blev udført på en Eppendorf Mastercycler gradient autoriseret thermocycler (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA) under anvendelse GoTaq Flexi-DNA-polymerase (Promega Ltd., Southampton, UK). PCR thermocycle bestod af en initial denaturering på 5 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 sek, annealing temperatur i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder, og en endelig forlængelse på 10 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter blev visualiseret på en 2% (vægt /volumen) agarosegel med tilsat ethidiumbromid.

Real-time kvantitativ PCR

RNA blev ekstraheret og revers transkriberet som beskrevet ovenfor. En standardkurve blev genereret med serielle fortyndinger af cDNA syntetiseret ud fra human føtal hjerne total RNA (Stratagene Europe, Amsterdam, Holland). Real-time PCR-amplifikation blev derefter udført i dobbelte 10 pi reaktioner under anvendelse

Power

SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner og anvendelse af ABI 7500HT hurtig realtids-PCR-system instrument (Applied Biosystems) . Anvendte primere var den samme som for ekspressionen analyse og er blevet beskrevet tidligere [22].