PLoS ONE: Funktionel karakterisering af human Kræft-Afledt trkB Mutations

Abstrakt

Kræft stammer fra celler, der har erhvervet mutationer i gener, kritisk til styring celleproliferation, overlevelse og differentiering. Ofte tumorer fortsat afhænge af disse såkaldte driver mutationer, der giver begrundelsen for målrettede anticancer behandlinger. Til dato har store sekventering analyser viste hundredvis af mutationer i humane tumorer. Men uden deres funktionelle validering er det fortsat uklart, hvilke mutationer svarer til føreren, eller rettere tilskuer, mutationer og dermed om det muterede gen udgør et mål for terapeutisk intervention. I humane kolorektale tumorer, har fundet den neurotrofe receptor trkB muteret på to forskellige steder i sit kinasedomæne (trkB

T695I og trkB

D751N). Et andet websted, i den ekstracellulære del af TrkB, muteres i en human lunge-adenocarcinom-cellelinje (trkB

L138F). Endelig har vores egen analyse identificeret et yderligere trkB punktmutation proksimalt til kinasedomænet (trkB

P507L) i et human melanoma cellelinie. De funktionelle konsekvenser af alle disse punktmutationer har dog hidtil været undvigende. Vi har tidligere vist, at trkB er en potent suppressor af anoikis og at trkB-udtrykkende celler danner stærkt invasive og metastatiske tumorer i nøgne mus. For at vurdere de funktionelle konsekvenser af disse fire trkB mutationer, vi bestemt deres potentiale til at undertrykke anoikis og til at danne tumorer i nøgne mus. Uventet begge tyktarmskræft-afledte mutanter, trkB

T695I og trkB

D751N, viste reduceret aktivitet sammenlignet med vildtype-trkB. Konsekvent, efter stimulering med trkB ligand BDNF, blev disse mutanter forringet i aktivering trkB og dens downstream effektorer AKT og ERK. De to mutanter afledt af humane tumorcellelinier (trkB

L138F og trkB

P507L) var funktionelt at skelne fra vildtype trkB i både

in vitro

in vivo

assays. Afslutningsvis vi ikke opdager nogen gevinst-of-funktion fire cancer-afledte trkB punktmutationer

Henvisning:. Geiger TR, Song JY, Rosado A, Peeper DS (2011) Funktionel karakterisering af human kræft- afledte trkB mutationer. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10,1371 /journal.pone.0016871

Redaktør: Hang Nguyen, Emory University, USA Ameica

Modtaget: 21 september, 2010; Accepteret: 17 januar 2011; Publiceret: 17 feb 2011

Copyright: © 2011 Geiger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en EU-FP6 tilskud til TRG, AR og D.S.P. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en genetisk sygdom, med talrige somatiske mutationer i proto-onkogener og tumorsuppressorgener, der bidrager til den maligne fænotype [1]. Disse gener normalt styrer vitale processer herunder celle proliferation, overlevelse eller differentiering [2]. Deres mutation forlener tumorceller med en selektiv fordel, resulterer i klonal ekspansion og neoplasi. Selvom tumorer normalt harbor multiple genetiske afvigelser [1], kan inhibering af kun en eller nogle få genprodukter være tilstrækkelig til i høj grad at undertrykke tumorcelleproliferation eller levedygtighed [3]. Dette har vist sig at forårsage tumorregression i forskellige cancer musemodeller [4] – [6] og førte til begreberne “onkogen afhængighed” og “tumorsuppressorgen overfølsomhed” [3]. Afhængigheden af ​​tumorceller på visse onkogener og signalveje udsætter en “akilleshæl” af kræft, som kan målrettes til anticancer terapi [7]. Baseret på dette koncept, har adskillige hidtil ukendte terapeutiske midler blevet udviklet og anvendes i klinikken [8]. De omfatter imatinibmesylat (eller “Gleevec” /”Glivec”) til BCR-ABL hæmning i kronisk myeloid leukæmi (CML) [9], og for KIT hæmning i gastrointestinale stromale tumorer (GIST) [10], hhv. Tilsvarende i brystcancerpatienter med ERBB2 (også betegnet HER-2 /neu) overekspression det monoklonale antistof trastuzumab [11] – [13] og den lille molekyle inhibitor lapatinib [14] er effektive. En kritisk rolle for onkogene mutationer er illustreret ved eksemplet med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR /ErbB1) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), hvor kun en undergruppe af patienter reagerer på EGFR-inhibitor gefitinib. Sekventering afslørede, at responsive tumorer huser specifikke mutationer i EGFR, øge dets aktivering af EGF [15].

Disse og andre eksempler viser, at identifikationen af ​​onkogener kritisk nødvendige for tumorcelleproliferation og overlevelse kan føre til effektiv anticancer terapeutika. Derfor har flere forskergrupper udøvet systematisk storstilet sekventering analyser til at screene for gener, der er muteret i kræft. Denne strategi har ført først til identifikation af BRAF kinase som et kritisk onkogen i en stor del af melanomer og flere andre kræftformer [16]. I 2003, gruppen af ​​Vogelstein, Kinzler og Velculescu systematisk sekventeret de kinase domæner i alle tyrosinkinaser i en samling af humane kolorektal kræft. De fandt 7 ud af 138 gener analyserede skal muteres i mere end én tumor [17]. Den samme gruppe efterfølgende analyseret mere end 1000 forskellige gener i bryst- og tyktarmskræft [18], identificere op til 189 nye og kendte kandidat kræft gener. Ligeledes Stratton, Futreal og medarbejdere på Sanger Institute sekventeret første 518 fuld længde kinaser i lunge tumorer og tumorcellelinjer [19] og efterfølgende fuld kinome i ti forskellige typer kræft [20]. Disse og andre analyser har identificeret hundredvis af nye somatiske mutationer over adskillige menneskelige maligniteter [21]. Men nogle få undtagelser til side, de funktionelle konsekvenser af disse mutationer har stort set undvigende. For at vælge de passende mål for fremtidige anticancer behandlinger, vil det være nødvendigt at teste eksperimentelt hvilke af disse mutationer er onkogene og som muterede gener tumorer er afhængige af.

Vi valgte at undersøge neurotrofisk receptor trkB (NTRK2), for som tre somatiske, ikke-synonyme punktmutationer er blevet rapporteret i de ovennævnte [17] undersøgelser, [19], mens vores egen analyse har afsløret en anden trkB punktmutation i en human melanoma cellelinie. TrkB er en af ​​tre medlemmer af TRK-receptorfamilien, som også omfatter trkA og trkC. TrkB fortrinsvis binder den neurotrophin hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) og NT4 /5, mens trkA og trkC har høje affiniteter til nervevækstfaktor (NGF) og NT3, henholdsvis [22]. Den pan-TRK receptor p75NTR modulerer yderligere reaktionsevne TRK receptorer neurotrophiner [22]. har vist sig trkB overudtrykt i en række aggressive humane cancertyper (for en oversigt se [23]). Vi har tidligere vist, at trkB er en potent suppressor af anoikis (apoptose induceret af uhensigtsmæssig eller fraværende celleadhæsion) i rotte epitelceller, og at trkB-overudtrykkende celler danner stærkt invasive og metastatiske tumorer i nøgne mus [24]. Desuden vores tidligere rapporteret struktur-funktion analyse viste, at alle disse funktioner afhænger af trkB-aktivitet i dette eksperimentelle system [25]. På det seneste har vi demonstreret for trkB-transformerede rotte-epitelceller, at øget MAPK aktivitet signaler via twist og snegl til at inducere Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) -lignende transformation, anoikis undertrykkelse og metastase [26]. Som to af de identificerede cancer-afledte trkB punktmutationer kort i kinase domæne, muligvis påvirke dens enzymatiske aktivitet, er det tænkeligt, at de handler oncogenically og svarer til driver mutationer. Formålet med denne undersøgelse var derfor at vurdere de funktionelle konsekvenser af fire uafhængige humane cancer-afledte trkB punktmutationer.

Resultater

Identifikation af human cancer-afledte trkB point mutanter og generering af cellesystemer

To ikke-synonyme punktmutationer i kinase domæne

trkB

gen er blevet opdaget i kolorektale tumorer: trkB

T695I og trkB

D751N [17] ( nummereringen af ​​alle aminosyresekvenser refererer til den humane fuldlængde trkB protein, accessionsnummer NP_006171.2). Et andet trkB punktmutation, trkB

L138F, blev identificeret i lungerne adenocarcinom cellelinie NCI-H2009 [19]. Denne mutation ligger inden for leucin-rige domæne af den ekstracellulære del af receptoren, som har vist sig at være nødvendig for binding af trkB ligand hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) og aktivering af trkB receptoren [25], [27 ], [28]. Vi bekræftede tilstedeværelsen af ​​denne mutation ved sekventering af genomisk DNA (gDNA) isoleret fra NCI-H2009-celler (figur 1A, venstre panel). Tilstedeværelsen af ​​en dobbelt top (thymidin og cytosin) indikerer, at mutationen er heterozygot, i overensstemmelse med den oprindelige rapport [19]. Det resulterer i udskiftningen af ​​leucin med phenylalanin. For at søge efter flere cancerassocierede

trkB

punktmutationer, vi sekventeret exonerne omfattende

trkB

kinasedomæne fra genomisk DNA fra 28 humane tumorcellelinier, fra flere væv oprindelser (data ikke vist ). Denne analyse afslørede en ekstra

trkB

punktmutation, i MDA-MB-435 melanoma cellelinie. (MDA-MB-435-cellelinje synes at have været klassificeret forkert i fortiden [29]. Det oprindeligt blev isoleret fra en patient med brystkræft [30], [31], seneste analyse viste, at den aktuelt tilgængelige cellelinie er af melanom oprindelse [32], [33]).

trkB

mutation er identificeret i MDA-MB-435 celler er C1520T, hvilket resulterer i en substitution af prolin 507 med leucin (trkB

P507L). I dette tilfælde sekventering af gDNA afslørede en enkelt top kun (figur 1A højre panel), hvilket antyder, at mutationen er homozygot. Den P507-rest er placeret proximalt til kinasedomænet i den intracellulære del af receptoren. Figur 1B viser en skematisk oversigt over placering af samtlige humane cancer-afledte trkB punktmutationer analyseret i denne undersøgelse.

(A) Sekventering analyse af gDNA fra NCI-H2009 celler, der huser den trkB

L138F mutation ( venstre felt) og fra MDA-MB-435 celler, der huser den trkB

P507L mutation (højre panel). Stjerner (*) angiver de respektive muterede baser. Sorte bogstaver angiver vildtype-rester, røde bogstaver betegner mutant rester. (B) Skematisk oversigt frem for alle cancer-afledte trkB punktmutationer analyseret i denne undersøgelse. LRM: Leucin-Rich Motiv, Ig: Immunoglobulin-lignende domæne, TM: transmembrane domæne. Tal angiver positionerne af aminosyrerester. (C) Ekspressionsniveauer af mutant eller vildtype-trkB i RIE-1-celler, analyseret på immunoblot (IB). Tubulin tjener som lastning kontrol. Tal repræsenterer kvantificering af trkB-signal, normaliseret til a-tubulin, og i forhold til vektorkontrol. (D) Cell overflade biotinylering assay viser, at i det mindste en betydelig del af alle trkB mutanter lokaliserer til cellemembranen. Total celleoverfladeproteiner blev biotinyleret med sulfo-NHS-LC-Biotin, lyseret og trkB blev immunpræcipiteret (IP) med TRK-antistof (C-14, C-13 til kontrol). Efter gelelektroforese blev biotinyleret trkB visualiseret med streptavidin-HRP og total trkB med TRK-antistof (C-14). Alle vildtype og mutant trkB-proteiner blev biotinyleret (øverste venstre panel). På højre side specificiteten af ​​assayet demonstreres: biotin signal blev kun påvist for fuld længde trkB (øvre højre panel, andet bane), men ikke for cytosoliske, trunkerede TPR-trkB [25] (tredje vognbane, forventes på -50 kD), og ikke i kontrolgruppen IP (bane 4) eller i fravær af sulfo-NHS-LC-Biotin (bane 5). IP af samlet fuld længde og trunkeret trkB er vist i bundpanelerne. Pilespidser angiver fuld længde TrkB, pil angiver trunkeret TPR-trkB (lige under Ig tunge kæder).

Vi undersøgte, om disse fire cancer-afledte trkB punktmutationer svarer til få af funktion mutationer associeret med øget onkogent potentiale. Vi udførte denne analyse i rotte epitelceller først, fordi de er meget følsomme over for trkB-medieret onkogen transformation, som angivet ved en EMT-lignende morfologisk transformation, anoikis modstand og metastatisk tumordannelse i nøgne mus [24] – [26]. Til dette formål klonede vi vildtype og mutant trkB ind i retrovirale pBabe-puro ekspressionsvektor og transduceret rotte intestinal epithelial (RIE-1) celler såvel som E1A-immortaliseret rotte nyre epiteliale (RK3E) celler. Begge cellelinier immortaliseres, men ikke-oncogen i athymiske mus. Som en negativ kontrol, vi udtrykte en kinase-inaktiv mutant af TrkB, trkB

K588M [34], som vi tidligere har vist sig at være ude af stand til oncogenically omdanne RIE-1 celler [25], [26]. Vi bekræftet ved Western blot analyse, at alle trkB mutanter blev udtrykt lignende niveauer som vildtype trkB (Figur 1C for RIE-1 celler, figur S1A for RK3E celler). I overensstemmelse med vores tidligere observationer [25], vi har registreret trkB som flere arter på en SDS-polyacrylamid gel, sandsynligvis afspejler forskelligt glykosylerede arter [35]. Endvidere ved at udføre en celleoverflade biotinylering assay vi sikret, at mindst en detekterbar del af alle de trkB mutanter korrekt lokaliseret til cellemembranen [36] (figur 1D). Vi har dermed en celle-system gør det muligt at sammenligne de aktiviteter og funktioner i de forskellige trkB mutanter side om side.

Omdannelse potentiale af humane cancer-afledte trkB point mutanter in vitro

Som de fleste kinaser , trkB brug for et minimalt niveau af aktivering til at transformere epitelceller. Vi antager, at hvis kræft-afledte trkB mutationer giver en gevinst på funktion, kan de forvandle epitelceller selv i fravær (eller med reducerede niveauer) af BDNF. Men når vi testede de forskellige trkB mutanter i fravær af co-udtrykkes ligand, ingen af ​​dem fremkaldte en spindel-formet celle morfologi (figur 2A til RIE-1 celler, Figur S1B for RK3E celler) eller undertrykt anoikis (figur 2B, Figur S1c) i fravær af BDNF. Dette var i modsætning til hvad der blev observeret for konstitutivt aktiv og ligand-uafhængig TPR-trkB-mutant, som gjorde omdanne RIE-1 og RK3E celler og undertrykt anoikis i fravær af exogent BDNF, i overensstemmelse med [25].

(A) Morfologi af RIE-1-celler, der udtrykker mutant eller vildtype TrkB, fotograferet ved 50x forstørrelse. (B) anoikis assay, i hvilket celler beskrevet i (A) blev podet på ULC plader og scannet ved 1x forstørrelse 9 dage senere (7 dage for TPR-trkB).

Dernæst vi aktiveret vildtype og mutant receptorer ved stabilt co-udtrykkende human BDNF, både i RIE-1 (figur 3A) og RK3E celler (Figur S1D). I overensstemmelse med vores tidligere observationer [24] – [26], for celler, der udtrykker vildtype-trkB + BDNF dette resulterede i EMT-lignende morfologisk transformation (figur 3B, fig S1E), nedregulering af E-cadherin (figur 3C og fig S1F) og anoikis suppression (figur 3D, fig S1G). Det samme blev set for celler, der udtrykker trkB

L138F + BDNF og trkB

P507L + BDNF. Derimod blev trkB

T695I- og trkB

D751N-udtrykkende celler svækket i deres svar på BDNF (figur 3B, C, D, figur S1E, F, G). Disse resultater viser, at uventet, trkB

T695I og trkB

D751N er svækket i deres evne til at omsætte rotte epitelceller

in vitro

. Desuden trkB

L138F og trkB

P507L er til at skelne fra vildtype trkB i denne indstilling.

(A) RIE-1 celler, der udtrykker mutant eller vildtype trkB blev transduceret med BDNF og analyseret på immunoblot (IB). Pilespids angiver positionen af ​​BDNF. Tubulin tjener som lastning kontrol. (B) Morfologisk transformation af RIE-1-celler co-udtrykkende mutant eller vildtype trkB- og BDNF, fotograferet ved 50x forstørrelse. (C) Den epithelial markør E-cadherin nedreguleres i trkB-induceret, morfologisk transformerede celler som vurderet ved immunoblot (IB) analyse. β-actin tjener som ladningskontrol. (D) anoikis undertrykkelse af mutant eller vildtype trkB + BDNF i celler, der er beskrevet i (A). Celler blev scannet på 1x forstørrelse 9 dage efter såning på ULC-plader.

Lydhørhed af humane cancer-afledte trkB mutanter til BDNF

Vi har tidligere vist, at trkB-medieret onkogen transformation af RIE-1 celler kritisk afhænger trkB-aktivitet [25], [26]. På jagt efter en biokemisk forklaring på de uventede resultater er beskrevet ovenfor, bestemte vi, om kræft-afledte trkB mutanter adskiller sig fra vildtype trkB i deres modtagelighed for BDNF. For at måle trkB aktivering anvendte vi RIE-1-celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB men ingen ligand og stimulerede cellerne med en fysiologisk relevante område af rekombinant BDNF. I tråd med vores tidligere undersøgelser [25], [26], det inducerede autophosphorylering af vildtype trkB (figur 4A og 4B), og førte til aktivering af to større nedstrøms signalveje [22]: Den PI3K pathway (hvilket resulterer i phosphorylering af AKT /PKB, figur 4C) og MAPK-vejen (hvilket resulterer i phosphorylering af MAPK /ERK, figur 4D). Udsættelse for 1 ng /ml BDNF var tilstrækkelig til at fremkalde vildtype trkB autophosphorylering og aktivere MAPK-vejen, mens højere koncentrationer af BDNF var påkrævet for at aktivere AKT (figur 4B, C, D og data ikke vist). TrkB

L138F og trkB

P507L reageret på BDNF på samme måde som vildtype trkB. I overensstemmelse med deres manglende evne til at undertrykke anoikis blev trkB

T695I kun delvis aktiveret af BDNF, mens trkB

D751N var fuldstændig ikke reagerer på BDNF, identisk med kinaseinaktiv trkB

K588M (figur 4). Disse resultater viser, at trkB

T695I og trkB

D751N display reduceret modtagelighed over for BDNF stimulation i rotte epitelceller, mens trkB

L138F og trkB

P507L opfører uden separat fra vildtype trkB.

(A) RIE-1-celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB blev stimuleret med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analyseret for phospho-tyrosin (pY) og total TRK indhold ved immunpræcipitering (IP) og efterfølgende immunoblot (IB) analyse . (B) RIE-1-celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB blev stimuleret med 1 ng /ml rekombinant BDNF og analyseret for phospho (P) og total TRK. (C) RIE-1-celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB blev stimuleret med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analyseret for phospho- (p) AKT og total AKT. PI3K-inhibitor LY294002 blev påført for at bekræfte identiteten af ​​den Pakt signal vist ved pilehovedet. Asterisk (*) angiver en ikke-specifikt bånd. Prøverne indlæst i bane to og tre tjener som kontroller og blev afledt af en gengivelse eksperiment udført under identiske betingelser. (D) RIE-1-celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB blev stimuleret med 1 ng /ml rekombinant BDNF og analyseret for phospho- (p) ERK og total ERK. For alle paneler, tallene nedenunder angiver kvantificering af phospho-specifikke signaler, normaliseret til de samlede signaler og i forhold til dem af vildtype trkB.

onkogent potentiale af human cancer-afledte trkB mutanter udtrykt i rotte epitelceller Salg

Dernæst testede vi den onkogene potentiale trkB mutanter

in vivo

, i mus xenograft eksperimenter. Vi subkutant inokuleret nøgne Balb /c-mus med vildtype eller mutante trkB-udtrykkende celler. I fravær af BDNF, kun vildtype TRKB-, trkB

L138F- og trkB

P507L udtrykker RIE-1 celler (figur 5A, B, figur S2A, B) og RK3E celler (figur S2E, F ) dannet store tumorer med korte latenstider, men ingen af ​​trkB

T695I- eller trkB

D751N-udtrykkende celler gjorde. Svarende til denne, også i nærvær af co-udtrykkes BDNF, trkB

L138F og trkB

P507L forårsaget tumorer på samme måde som vildtype-trkB i RIE-1 og RK3E celler (figur 5C, D, figur S2C, D og Figur S2G, H). I denne indstilling, RIE-1 trkB

T695I + BDNF-udtrykkende celler også dannede tumorer, men med en statistisk signifikant forsinkelse i forhold til RIE-1 trkB

vægt + BDNF-udtrykkende celler (figur 5C, S2C). Af note, når 1 * 10

5-celler blev podet, også RIE-1 trkB

D751N + BDNF-udtrykkende celler dannede tumorer, men med betydelig længere latenstid end dem induceret af RIE-1 trkB

vægt- + BDNF-udtrykkende celler (data ikke vist). I RK3E celler, havde ekspression af trkB

D751N ikke føre til tumordannelse, selv med høj celleantal og i nærvær af BDNF, hvorimod RK3E trkB

T695I + BDNF-udtrykkende celler dannede tumorer med en signifikant længere latenstid sammenlignet til RK3E trkB

wt + BDNF-udtrykkende celler (Figur S2G). Uanset visse forskelle mellem de to cellelinjer, generelt, disse resultater viser, at trkB

T695I og trkB

D751N er svækket i transformere rotte epitelceller også

in vivo

. Endvidere hverken trkB

L138F eller trkB

P507L displays forøget onkogen aktivitet sammenlignet med vildtype-trkB.

(A) 1 * 10

6 RIE-1 celler, der udtrykker trkB (Wild- type eller mutant) blev subkutant injiceret i begge flanker af nøgne mus. n = 5 for wt og P507L, n = 4 for T695I og D751N. (B) 1 * 10

6 RIE-1-celler, der udtrykker trkB (vildtype eller mutant) blev subkutant injiceret i begge flanker af nøgne mus. n = 4 for begge cellelinier. (C) 1 * 10

4 RIE-1-celler co-udtrykkende BDNF og trkB (vildtype eller mutant) blev subkutant injiceret i nøgne mus. n = 6 for wt og P507L, n = 3 for T695I og D751N. (D) 1 * 10

5 RIE-1-celler co-udtrykkende BDNF og trkB (vildtype eller mutant) blev subkutant injiceret i nøgne mus. n = 4 for begge cellelinier. I alle eksperimenter blev mus aflivet, når tumorbyrde nåede 2 cm

2 og Kaplan-Meier overlevelse kurve er vist. Statistisk signifikans blev bestemt med en log-rank test.

BDNF reaktionsevne human tyktarmskræft afledt trkB

T695I og trkB

D751N udtrykt i kolon kræftceller

en mulig forklaring på det svækkede aktivitet af trkB

T695I og trkB

D751N i assayene beskrevet ovenfor er, at vi udførte dem i en aphysiological cellulære kontekst. Faktisk kan ledninger af de intracellulære signalsystemer net og ekspressionsmønsteret for trkB regulatoriske faktorer ikke identiske på tværs celletyper. Ideelt set bør man vurdere funktionen af ​​trkB mutanter i deres oprindelige sammenhæng, der er i tumorcellerne, som de oprindeligt blev identificeret. Men der er ingen cellelinier tilgængelige, der udtrykker trkB

T695I eller trkB

D751N endogent. Endvidere så vidt vi ved er der ingen primære humane colon epitelcellelinie rådighed. Målet er at bruge en fysiologisk relevant celle-system, vi transducerede COLO 205 og Caco-2 humane tyktarmscarcinomceller med trkB

T695I eller trkB

D751N og opnåede polyklonale populationer stabilt udtrykker enten receptor. Vi stimulerede disse celler med rekombinant BDNF og måles efterfølgende trkB autophosphorylering og aktivering af nedstrømseffektorer. Svarende til hvad der blev observeret i RIE-1-celler, i begge COLO 205 og Caco-2-celler, trkB

T695I og trkB

D751N var mindre rigeligt phosphoryleret end vildtype trkB ved stimulering med BDNF (figur 6). ERK blev phosphoryleret ved trkB stimulation kun i Caco-2 celler, men ikke i COLO 205 celler (figur 6C, D). Det er sandsynligvis fordi COLO 205 celler huser en BRAF

V600E mutation (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), som er konstitutivt aktiv og stimulerer MAPK signalering [16]. Ved stimulering af Caco-2-celler med BDNF, hverken trkB

T695I eller trkB

D751N induceret ERK-phosphorylering (fig 6D). Tilsammen viser disse resultater, at trkB

T695I og trkB

D751N mutanter er mindre aktive, ikke blot i rotte epitelceller, men også i to humane coloncarcinom-cellelinier. Salg

(A) COLO 205 celler og (B) Caco-2 celler, der udtrykker vildtype eller mutant trkB blev stimuleret med 10 ng /ml rekombinant BDNF og analyseret for phospho-tyrosin (pY) indhold ved immunpræcipitering (IP) og efterfølgende immunoblot (IB) analyse. (C) Cellelysater af COLO 205 celler fra (A) og (D) lysater af Caco-2 celler fra (B) blev analyseret for phospho (P) og total TRK og (p) ERK. MEK-inhibitor U0126 blev påført for at bekræfte identiteten af ​​de Perk signaler. β-actin tjener som lastning kontrol.

Knockdown af endogen trkB

L138F og trkB

P507L i human tumorcellelinjer

Det faktum, at trkB

L138F og trkB

P507L er endogent udtrykt i tumorcellelinier gav os mulighed for at undersøge, om de er nødvendige for deres onkogene fænotype. Vi forarmet trkB

L138F og trkB

P507L fra NCI-H2009 og MDA-MB-435 celler, henholdsvis ved RNA-interferens med to uafhængige, ikke-overlappende kort hårnål (SH) RNA-konstruktioner. Vi opnåede -75% nedregulering af trkB i NCI-H2009 celler (figur 7A). Men dette påvirkede hverken cellemorfologien (figur 7B øverste panel) eller anoikis resistens (Figur 7B bundpanel). Ligeledes -80% nedregulering af trkB i MDA-MB-435 celler (figur 7C) havde ingen virkning på cellemorfologien (figur 7D øverste felt) og anoikis resistens (Figur 7D bundpanel). I overensstemmelse med disse observationer, E-cadherin niveauer blev ikke ændret ved trkB knockdown i enten cellelinje (figur 7E). Endvidere blev der ikke observeret nogen virkning på celleproliferation (data ikke vist). Uanset at trkB ikke var helt tomt i nogen cellelinie, disse resultater tyder på, at (mutant) trkB i NCI-H2009 og MDA-MB-435 celler er ikke en væsentlig drivkraft for deres transformerede fænotype.

(A) QRT-PCR demonstrerer knockdown af trkB mRNA niveauer med to ikke-overlappende korte hårnåle (SH). Middelværdier af tre uafhængige målinger er vist, fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. (B) Knockdown af trkB hverken påvirker morfologi adhærent voksende NCI-H2009 celler, fotograferet ved 50x forstørrelse (øverste panel), eller anoikis modstand NCI-H2009 celler i suspension (nederste panel). ULC plader blev scannet ved 1x forstørrelse 6 dage efter såning. (C) QRT-PCR demonstrerer knockdown af trkB mRNA niveauer med to ikke-overlappende korte hårnåle. Middelværdier af tre uafhængige målinger er vist, fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. (D) Knockdown af trkB hverken påvirker morfologien af ​​adhærent voksende MDA-MB-435-celler, fotograferet ved 50x forstørrelse, eller anoikis modstand MDA-MB-435-celler i suspension (nederste panel). ULC plader blev scannet ved 1x forstørrelse 6 dage efter såning. (E) Knockdown af trkB i NCI-H2009 og MDA-MB-435 celler påvirker ikke E-cadherin protein niveauer, som vurderet ved immunoblot (IB) analyse. Lange og korte eksponeringer af det samme blot er vist. β-actin tjener som lastning kontrol

Diskussion

Tre somatisk, er der rapporteret ikke-synonyme punktmutationer af trkB i de tidlige store sekventering studier i menneskelige kræftformer:. to i kolorektale tumorer, trkB

T695I og trkB

D751N [17], og en i en lunge adenocarcinom cellelinje, trkB

L138F [19]. Vi identificerede en yderligere trkB punktmutation, trkB

P507L, i MDA-MB-435 human melanoma cellelinie. Selv om nogle af disse mutanter er blevet foreslået som mulige cancer-kørsel gener [17], uventet, vores analyse i rotte epitelceller og i humane tumorcellelinier undladt at give støtte til en forstærkning af funktion virkning for nogen af ​​de fire trkB punktmutationer. Faktisk blev de to colorektale tumorafledte trkB punktmutationer forbundet med endda reduceret kinaseaktivitet og onkogent potentiale, sammenlignet med vildtype-trkB. Som en advarende note, må man huske på, at vi ikke teste kolorektale tumor-afledte trkB mutanter i deres oprindelige sammenhæng, nemlig tumorer, der endogent udtrykker trkB

T695I eller trkB

D751N, mens cellelinjer afledt heraf er ikke tilgængelige. Ikke desto mindre udsættelse for BDNF af både rotte epitelial og menneskelige tyktarmskræft celler, der udtrykker disse mutanter resulterede i reduceret receptor aktivering af trkB

T695I og næsten ingen aktivering af trkB

D751N. Dette tyder stærkt på, at disse mutanter har nedsat enzymaktivitet i forbindelse med BDNF stimulering. Det rejser endda muligheden for, at trkB

T695I og trkB

D751N kan handle i en dominerende negativ måde, og at vildtype trkB kan også have tumor undertrykke aktivitet (eller en dobbelt funktion) i tyktarmskræft, men yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at tage fat på disse vigtige spørgsmål. Vi kan ikke udelukke, at reaktionsevne trkB

T695I og trkB

D751N til andre trkB ligander kan være forskellig fra den til BDNF. Vi kan heller ikke formelt udelukke, at trkB

T695I og trkB

D751N måske er blevet udvalgt til i de oprindelige tumorer, der bidrager til tumordannelse med funktioner, der er forskellige fra dem, vi testede

in vitro

. Disse spørgsmål ikke modstå, vi føler, at det er rimeligt at sige, at disse mutationer ikke opfylder traditionelle kriterier for mutations aktivering af receptorkinaser.

Teoretisk alle mutationer, der er bosiddende i den cytoplasmatiske del af receptoren kan påvirke bindingen af adapter proteiner eller substrater af TrkB, uafhængigt af virkningen på kinaseaktivitet. Tilstedeværelsen og funktionen af ​​disse bindingspartnere vil afhænge af cellulær sammenhæng og kan være forskellig i forskellige cellelinier. Selvom det prototypiske mekanisme for onkogen funktion af tyrosinkinaser er konstitutiv eller forøget kinaseaktivitet med ændret nedstrøms signalering [37], receptortyrosinkinaser kan også have kinase-uafhængige funktioner, der bidrager til cancer. Dette er blevet vist for vildtype EGFR, som, uafhængigt af dens kinase aktivitet, interagerer med og derved stabiliserer natrium /glucose cotransportør 1 (SLGT1) [38]. Nedregulering, men ikke enzymatisk inhibering af EGFR fører til reducerede SLGT1 niveauer, reduceret glucoseoptagelse og autofagi af tumorceller [38]. Om en lignende funktion også er forbundet med trkB er ikke kendt. En nylig undersøgelse viser, at kinasen-deficiente trkB-T1 splejsningsvariant efter kunstig overekspression, kan stimulere metastase af pancreas adenocarcinom-celler [39]. Der kræves mere forskning for at belyse kinase-uafhængige funktioner trkB og deres bidrag til malign sygdom, især for at tage nogen rolle af det endogene protein i kræftceller.

Vi har identificeret og karakteriseret også en roman trkB punktmutation , trkB

P507L, som vi isoleret fra MDA-MB-435 tumor cellelinie.