PLoS ONE: Karakterisering af mesotheliom-initierende celler og deres Modtagelighed for Anti-Cancer Agents

Abstrakt

malignt mesotheliom (MM) er en aggressiv form for tumor forårsager høj dødelighed. En årsag til dette paradigme kan være eksistensen af ​​en delpopulation af tumor-initierende celler (tics), der udstyrer MM med resistens og gentagelse. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og karakterisere en TIC subpopulation i MM celler, ved hjælp af sfæroide kulturer, mesospheres, som en model af MM TIC. Mesospheres, typiske for stemness markører CD24, ABCG2 og Oct4 indledte tumorer i immundefekte mus mere effektivt end klæbende celler. CD24 knock-down celler tabt kuglen-dannende kapacitet og fremhævede lavere tumorigenicitet. Ved seriel transplantation, blev mesospheres gradvist mere effektivt tumrigenic med øget niveau af stamcelle markører. Vi viser også, at mesospheres har mitochondriske og metaboliske egenskaber svarende til dem af normale og cancer stamceller. Endelig viser vi, at lungehindekræft-initierende celler er meget modtagelige for mitokondrier målrettet vitamin E succinat. Denne undersøgelse dokumenterer, at mesospheres kan bruges som en plausibel model for lungehindekræft-initierende celler, og at de kan udnyttes i søgningen efter effektive midler mod MM

Henvisning:. Pasdar EA, Smits M, Stapelberg M, Bajzikova M, Stantič M, Goodwin, J., et al. (2015) Karakterisering af mesotheliom-initierende celler og deres Modtagelighed for anticancer-midler. PLoS ONE 10 (5): e0119549. doi: 10,1371 /journal.pone.0119549

Academic Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 8, 2014 Accepteret: 14 Jan 2015; Udgivet: 1. maj 2015

Copyright: © 2015 Pasdar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. De oprindelige rå data lagres i Griffith University systemet. https://research-storage.griffith.edu.au/owncloud/index.php/apps/files/?dir=%2Fdocuments%2FPasdar%20et%20al%20PLoS%20One.

Funding: Arbejdet blev støttet delvist af tilskud fra den australske Forskningsråd, Cancer Råd Queensland, og Den Europæiske Fond for Regional Udvikling (den BIOCEV projektet, CZ.1.05 /1.1.00 /02.0109) til JN. EAP blev støttet af Douglas Francis Green ph.d.-stipendium fra Queensland Asbest sygdomme Society. LFD blev støttet af Griffith University Research Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

malignt mesotheliom (MM), den primære tumor i lungehinden, er meget aggressiv, med meget lidt, hvis nogen terapeutiske muligheder. Typisk bliver diagnosticeret 20 til 40 år efter udsættelse for asbest, den vigtigste carcinogen af ​​MM, dette neoplastisk sygdom er meget aggressiv og dødeligheden er overordentlig høj med få måneders overlevelse efter diagnose [1, 2], tilbagefald af tumor forekommende kort efter initiering af behandling [3]. Trods den nuværende forbud mod brug af asbest i de industrialiserede lande, og på grund af manglen på restriktiv lovgivning om behandling og anvendelse af asbest i udviklingslandene [4], MM forekomsten fortsætter med at stige som følge af den lange latenstid.

det er blevet foreslået, at tumor heterogenitet, som en konsekvens af genetisk ustabilitet og niche faktorer i tumoren, er en væsentlig årsag til resistens over for behandling i cancerpatienter [5, 6]. Genomisk studier af MM tumorer fremhæver også inter- og intra-tumor heterogenitet af denne type malignitet [7, 8]. De underliggende mekanismer tumor heterogenitet er stadig under intens debat og forskellige modeller er blevet foreslået at definere dette fænomen [9]. Den foreslåede cancer stamceller (CSC) modellen kan plausibelt beskrive heterogeniteten og hierarkiske organisering af celler i tumorer [10]. CSCS (også omtalt som tumor-initierende celler, tics), en lille underpopulation af celler i carcinomer, har evnen til at forny sig selv og generere differentierede celler med høj proliferativ kapacitet, (gen-) danner tumormassen [11 ], samt tilføre tumorer er resistente over for behandling [12, 13]. Tilstedeværelsen af ​​TIC kan også til dels forklare høj modstand MM til terapi, selv om dette aspekt af MM patofysiologi kun delvist forstået [14, 15].

I denne meddelelse, rapporterer vi om eksistensen af TIC i lungehindekræft ved at karakterisere kugler stammer fra forskellige mesotheliom cellelinjer som en tidligere etableret model for dyrkning af stamceller og TIC [16-18]. Vi har også nuværende karakterisering af MM TIC og deres modtagelighed for anti-cancer.

Materialer og metoder

Cell kultur

De etablerede humane MM cellelinier Ist-Mes-2 (epithelioid histotype), Meso-2 (sarcomatoid histotype), MM-BI (bifasisk histotype) [19], og den murine AE17 cellelinje (epithelioid histotype) [20] blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS og det antimykotiske /antibiotisk cocktail (Invitrogen). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. For sfære dannelse, adhærente celler blev dyrket med en densitet på 10

4 til 2×10

4 celler /ml serumfrit medium (SFM) omfattende DMEM-F12-medium (Invitrogen) suppleret med musen NeuroCult Proliferation Supplement (StemCell Technologies), 20 ng /ml humant rekombinant EGF og 20 ng /ml FGF2 (R OCT4: fremadrettede CCC CAG GTT GGA GTG GGG CT, reverse-GGA GGC CCC ATC GGA GTT GC; ABCG2: fremadrettede ACG AAC GGA TTA ACA GGG TCA, reverse-CTC CAG ACA CAC CAC GGA T; SOX4: videresende GAT TCC GCC CAC AGA GAG TC, reverse-GGT AGC TCA GGA AAG CGA CA; KLF4: CTG GGT CTT GAG GAA GTG CT, reverse-GGC ATG AGC TCT TGG TAA TGG; c-myc: fremadrettede GGA CTT GTT GCG GAA ACG AC, reverse-CTC AGC CAA GGT TGT GAG GT; ABCB5: fremadrettede ACT GAG AAA GGA AGC AGT TGG A, reverse-TAA AGG AAG GCA GGC TCC AT; GAPDH: fremadrettede TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC, reverse-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG

Transfektion med lille hårnål RNA (shRNA)

Menneskelig CD24-specifikke shRNA konstruktionerne i det. prs rygraden under kontrol af U6 promotoren og den relevante tom vektor blev opnået fra OriGene Technologies (Rockville). The FuGENE HD transfektionsreagens (Promega) blev anvendt til stabilt at transficere Ist-Mes-2-celler med shRNA CD24 og tom vektor (mock-transficerede celler) ifølge producentens anvisninger. De stabile enkelt celle-afledte kloner blev udvalgt ved tilsætning af 4 ug /ml puromycin til dyrkningsmediet og overvåges for transfektion under anvendelse qPCR eller Western blotting.

Vurdering af superoxidgenerering, mitochondriemembranpotential, mitokondriemasse , cellecyklus, blev apoptose og cellestørrelse

Intracellulær superoxid anion niveauer evalueret ved brug af fluorescerende probe MitoSOX. 10

5-celler blev dyrket i plader med 24 brønde og ved 70% konfluens, blev behandlet med 20 pM MitoSOX i 30 minutter, vasket resuspenderet i PBS og analyseret ved flowcytometri (FACS Fortessa, Becton Dickinson). Superoxid niveauer blev udtrykt som gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). Mitokondriemasse blev vurderet ved behandling af cellerne med 50 pM MitoTracker Green FM i 30 minutter og analysere ved flowcytometri. Til vurdering af cellecyklus, 10

6 levedygtige celler blev vasket og fikseret i 70% EtOH natten over og farvet med 100 pg /ml propidiumiodid (PI), og analyseret ved en FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson). Signaler, der udsendes fra en enkelt kerne og aggregerede celler blev udelukket ved anvendelse af en dobbelt-gating modul. Apoptose blev vurderet ved standard annexin V /PI metode. Cellestørrelse blev estimeret ved anvendelse af Scepter håndholdte automatiseret celletæller (Millipore) ifølge producentens instruktioner.

CS, SDH og SQR aktivitet

CS aktivitet blev vurderet ved reduktion af DTNB [5,5 ‘ -dithiobis- (2-nitrobenzoesyre)] af enzymet og dets koblet reaktion med oxaloacetat og acetyl-CoA. Kort beskrevet 10 ug protein lysat blev tilsat til en blanding af 10 mM DTNB og 30 mM acetyl coenzym A. Ændringen i absorbans DTNB måltes i Tecan Infinite 200 PRO læser i 90 s ved 412 nm efter tilsætningen af ​​10 mM oxalacetat i en 200 pi reaktionsvolumen. SDH-aktivitet blev vurderet som beskrevet tidligere (Dong et al., 2011). For SQR aktivitet, 40 ug protein lysat blev sat til 1 ml af SQR assaybuffer (10 mM KH2PO4, pH 7,8, 2 mM EDTA, 1 mg /ml BSA), 80 uM dichlorphenolindophenol, 0,2 mM ATP, 4 uM rotenon og 10 mM succinat, og inkuberet ved 30 ° C i 10 minutter. Absorbansen blev målt hvert minut i 30 minutter efter initiering af reaktionen ved decylubiquinone (80 uM) [23].

Høj opløsning respirometri

Oxygen forbruget blev vurderet ved hjælp af Oxygraph-2k høj- beslutning respirometer og dataene analyseret ved anvendelse af Datlab software (begge Oroboros), i det væsentlige som beskrevet [24]. Alle målinger blev udført ved 37 ° C i 2 ml kamre. Til bedømmelse af intakte celler, blev serumfrit DMEM medier anvendes, mens digitonin-permeabiliseres celler blev suspenderet i MiR05 mitokondrielle respiration medium. For alle eksperimenter blev 10

6 celler anvendes per kammer. Satsen for iltforbrug (oxygen flux) blev beregnet som den negative hældning af iltkoncentrationen. Cellulær oxygen flux blev korrigeret for den instrumentelle baggrund, der skyldes den ikke-specifikke sensor iltforbrug. Betingelserne for respiration var som følger: GM_L-glutamat (2 mM) /malat (10 mM); GM_P-som før plus ADP (2,5 mM); GMS_P-som før plus succinat (10 mM); GMS_E-som før plus CCCP (5 uM); S (Rot) _E-som før plus rotenon (0,5 uM). Symbolerne står for: GM_L-lækage (oxygenforbrug ikke er koblet til ATP-produktion); GM_P-respiration via CI; GMS_P-respiration via CI + CII; GMS_E-frakoblet respiration; S (Rot) _E-afkoblet respiration via CII.

glukoseoptagelse, ATP niveau og laktat analyser

For glukoseoptagelse, cellerne blev inkuberet i lav glukose (1 g /l) DMEM natten over på 5% CO

2 og 37 ° C. De blev derefter inkuberet i 30 minutter med 50 uM 2-nitrobenzodeoxyglucose (2-NBDG) i lav-glucose DMEM. Niveauet af fluorescerende glukoseanaloge i cellerne blev evalueret ved flowcytometri og udtrykt som MFI. For ATP estimering blev celler podet i 96-brønds plader ved 10

4 celle per brønd og intracellulære ATP-niveauer analyseres med en luciferase-baserede kit (CellTiter-Glo Luminescent Assay, Promega). Resultaterne blev normaliseret til totalt protein. For lactat assay blev cellerne udsået ved 10

4 per brønd i 96-brønds plader. Efter 24 timers inkubation blev celledyrkningsmediet anvendes til evaluering af lactat under anvendelse af et fluorometrisk kit (Cayman Chemicals). Resultaterne blev normaliseret til totalt protein

Statistisk analyse

Den parrede t-test blev anvendt til at vurdere forskellene mellem eksperimentelle resultater, med forskelle med

s

0,05 betragtes som statistisk signifikant.

Resultater

Dannelse af mesospheres fra MM-cellelinjer med forskellige fænotyper

En væsentlig egenskab ved TIC er deres evne til selv at forny via asymmetrisk celle afdeling. For at bekræfte at MM celler omfatter en sub-population med karakteristisk selvfornyelse kapacitet, etablerede MM-cellelinjer, herunder Ist-Mes-2 (epitelial histotype), Meso-2 (sarcomatoid histotype) og MM-BI celler (bifasisk histotype), som samt murine AE17 MM celler blev dyrket under betingelser, der til berigelse cellepopulationer i TIC. Til berigelse i TIC blev celler dyrket i serum-frit medium (SFM) [25], en tilstand opretholde celler i en udifferentieret tilstand, der tidligere er blevet anvendt til at isolere forskellige typer stamceller og TIC [26]. I SFM, alle MM-celler voksede i sfæriske kolonier, benævnt mesospheres, med diameter 30-100 um efter 3-5 dage i kultur (figur 1A). For alle MM-cellelinjer undersøgt, adhærente celler prolifererede mindre effektivt end de tilsvarende sphere celler, når de placeres i komplet medium, og Ist-Mes-2-celler var mere proliferativ end MM-BI og Meso-2-celler (Fig 1B). Mesospheres fastholdt evnen til at danne nye sfærer efter mekanisk dissociation og re-seeding til frisk SFM. Hyppigheden af ​​sfære-dannende celler repræsenterer mærker blev vurderet ved begrænsende fortynding som beskrevet tidligere [16, 21, 22]. Det kan beregnes ud fra afbildninger, baseret på skæringspunktet på 37% værdi med skråningerne af individuelle cellelinier, at antallet af celler, der kræves til dannelsen af ​​en kugle var 1,81 ± 0,24 for Ist-Mes-2, 4,54 ± 0,39 til MM-BI og 7,53 ± 0,89 for Meso-2-celler (tabel 1). At en enkelt celle kan danne en kugle, når de placeres på SFM er dokumenteret i figur 1C, viser tidsafhængig sfære dannelse starter med en enkelt Ist-Mes-2 celler.

(A) fasekontrast billeder af mesospheres fra etablerede MM-cellelinjer. (B) Proliferation rate af enkelt celle-afledte kugler re-dyrket i normalt differentiering medium sammenlignet med parentale mesotheliom celler. Til dette eksperiment blev celler podet ved det samme antal i klæbende medium, og proliferation af de oprindeligt adhærente og sfære-celler som vurderet ved anvendelse af MTT-assayet. Forholdet mellem proliferationshastighed i kugle-afledte adhærente celler inkuberet i 72 timer er 3,37 for Ist-Mes-2, 1,72 for Meso-2 og 4,25 for MM-BI celler. (C) En enkelt Ist-Mes-2 celle blev opretholdt i SFM og kugle formation på dag 1, 3, 5 og 7 dokumenterede. Dataene i panel B er middelværdier ± S.D. afledt af tre uafhængige forsøg. Billeder i panel A og C er repræsentative for tre individuelle eksperimenter. Skalaen bar i panel A og C repræsenterer 100 um.

Mesospheres udtrykker stamceller markører og effektivt generere tumorer

Vi har for nylig udført global genekspression analyse af kugle og vedhængende Ist-Mes-2-celler, der dokumenteret en “stemness signatur ‘for Ist-Mes-2 mesospheres [27]. For at verificere resultaterne af microarray data og for yderligere at fastlægge de karakteristika af kuglen celler, vi analyserede både kugler og vedhængende monolag celler til ekspression af markører, der ofte forbinder med TIC [10], og der blev også fundet steget i microarray analyse IST-Mes-2 kugler [27]. Højere udtryk for

CD24

,

OCT4

ABCG2

mRNA (1,5 til 4-dobling) blev fundet i områder sammenlignet med tilsvarende klæbende celler. For at teste for plasticitet MM celler, blev enkelt celle-afledte kugler udsat for normale klæbende dyrkningsbetingelser efter dannelse mesospheres at give deres re-tilknytning. Resultaterne viser, at efter differentiering, adhærente celler afledt fra sfærer viser tilsvarende niveau for ekspression af stamcellemarkører til den i de oprindelige adhærente celler (fig 2A). Mesospheres viste også øget ekspression af flere andre markører for stemness, dvs.

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

KLF4

(Fig 2B) .

(A) Ist-Mes-2, Meso-2 og MM-BI cellerne fik lov til at danne sfærer, hvorefter disse blev anbragt i det komplette medium til at forårsage differentiering og re-adhæsion af cellerne. Relative niveauer

CD24

,

ABCG2

og

Oct4

mRNA blev vurderet i de oprindelige klæbende celler (angivet som 1), kuglerne og de genindførte vedhængende celler. (B) Ist-Mes-2, Meso-2 og MM-BI celler kugler blev testet for niveauet af

SOX4

,

C-MYC

,

ABCB5

KLF4

mRNA og deres niveau udtrykkes i forhold til den for klæbende celler. Dataene er middelværdier ± standardafvigelse stammer fra tre uafhængige forsøg, symbolet ‘*’ står markant forskellige data med

s

0,05, ‘**’ for dem med

s

. 0,005

for at undersøge om mesospheres og adhærente monolag celler er forskellige i deres evne til at danne tumorer hos immunkompromitterede mus, Ist-Mes-2 mesosfaeren og adhærente celler blev injiceret subkutant i Balb-c /nøgne mus ved 10

4, 10

5 og 10

6 celler pr mus, og tumor initiering og progression blev overvåget ved ultralydsscanning (USI). Sphere-afledte celler var mere effektiv i tumordannelse end deres adhærerende modparter, især for de lavere celleantal (fig 3A-3C). Inspektion af tumor billeder optaget af USI afslørede multilobular karakter sfære-afledte tumorer, som ikke er indlysende i de adhærente celle-afledte carcinomer (figur 3D).

Ist-Mes-2 adhærente og sfære celler blev injiceret s.c. i Balb-c /nøgne mus ved 10

4 (A), 10

5 (B) og 10

6 celler per mus (C). Tumor volumen blev vurderet ved anvendelse USI og udtrykkes i forhold til den initialt detekterede tumor (~ 20 mm

3). (D) Tre forskellige repræsentative billeder taget af ultralyd fra sphere- og vedhængende celle-afledt tumorer er vist for tumorer dyrket fra 10

6 celler pr mus. Den stiplede linie angiver konturerne af USI-visualiserede tumorer. På den højre side, et fotografi af et repræsentativt tumor vokset fra 10

6 sfære (øverste billede) og adhærerende celler (nederste billede) er vist. Data i panel A-C er afledt fra forsøg, der omfatter 4-5 mus pr gruppe og er middelværdier ± S.E.M. Symbolet “*” angiver signifikant forskellige værdier med

s

. 0,05

Mesospheres udbrede serielle tumorer med stadig mere aggressive natur

For at kontrollere, om mesosfæren celler kan danne tumorer sekventielt følge af selvfornyelse kapacitet tics, vi udsatte dem til seriel xenografting i Balb-c /nøgne mus. IST-Mes-2 sfære Cellerne fik lov til at danne en tumor, og MM celler afledt fra tumoren blev derefter anbragt i kultur resulterer i en cellelinie (1

st generation, G1). Disse celler blev anvendt igen til dannelse sfærer, der blev podet i nøgne mus til dannelse af anden generation af tumorer, hvorfra 2

andengenerations cellelinie (G2) blev afledt. Denne procedure blev gentaget to gange mere for at opnå G3 og G4 cellelinier. Med hver generation latenstiden til tumor initiering forkortet sådan, at det var 52 dage for G1, 15 dage for G2, 7 dage til G3 og 5 dage for G4 (Fig 4A). Interessant, fandt vi, at niveauerne fra stamceller markør (CD24, ABCG2, OCT4) mRNA øges gradvist i de enkelte sfære generationer (Fig 4B). Vi har også observeret generation-afhængig stigning i CD24, CD47, EpCAM og Oct3 /4 protein, yderligere underbygger forestillingen om, at stemness stiger med hver generation (Fig 4C og 4D). For at teste mitokondriefunktionen i individuelle generation, studerede vi aktiviteten af ​​CS, en komponent af tricarboxylsyre (TCA) cyklussen og et surrogat mål for mitokondriemasse. Fig 4E viser en gradvis stigning i aktiviteten af ​​enzymet. At dokumentere cancer morfologi af tumorer afledt fra hver sfære generation farvede vi tumorsnit for tilstedeværelsen af ​​en markør for MM, mesothelin, og med H 0,05. Billeder er repræsentative for tre forskellige tumorer.

Siden sfære kulturer afledt fra forskellige generation tumorer udviste stigende CS aktivitet vurderede vi disse celler for deres mitokondriefunktion mere detaljeret. Vi først afprøvet de individuelle generation sfære celler for respiration. Analyse af respiration af intakt samt permeabiliserede celler under anvendelse af Oxygraph høj opløsning respirometer afslørede, at G1 generation celler indåndes mere (begge via rutinemæssig respiration samt via respiration ved hjælp kompleks I, CI, og CII) end G0 celler (kugler fremstillet ud fra de oprindelige adhærente Ist-Mes-2-celler). Respiration i G2-G4 celler lidt faldet, men var stadig meget højere end i forældrenes sfære celler (Fig 5A og 5B). Denne tendens var meget lig for mitokondriemasse (Fig 5C), superoxidfrembringelse (Fig 5D), glukoseoptagelse (Fig 5E) og mitokondriepotentiale (fig 5G). På den anden side, niveauet af ATP faldt i de enkelte sfære generationer (Fig 5F) og en tilsvarende tendens blev fundet for lactat produktion (Fig 5H). Vi testede også de to aktiviteter i CII, SDH og succinat quinonreduktase (sqr) aktivitet. Fig 5I dokumenterer ingen ændring i SDH og figur 5J et fald i G1 celler SQR aktivitet. Vi observerede en svag gradvis stigning i størrelsen af ​​celler af forskellige generationer (figur 5K). Transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder afslørede morfologiske forskelle i mitokondrier af individuelle generation celler (Fig 5L). Første generation af celler har runde eller ovale mitokondrier med cristae arrangeret parallelt med hinanden, og nogle mitokondrier omgivet med ru endoplasmatiske reticulum. G2-celler har to typer af mitokondrier med samme frekvens: mitokondrier med løsnet matrix, og mitochondrier med tæt matrix og dilateret cristae samt delvis lokalisering af ru ER i nærheden af ​​mitokondrier, der ligner G1 celler. G3 celler viser tætte mitokondrier med lamellar men mindre lige cristae, og G4 celler har forgrenede mitokondrier med dilaterede (vesikulær) cristae og tætte matrix.

Sphere celler repræsenterer individuelle generationer blev evalueret for respiration ved hjælp af den rutinemæssige protokol (A) og protokollen for permeabiliserede celler (B) ved hjælp af Oxygraph 2k høj opløsning respirometer. Symbolerne GM_L, GM_P, GMS_P, GMS_E og S (Rot) _E repræsenterer rutine respiration, respiration via kompleks I, respiration via kompleks I + II, ukoblet respiration og afkoblet respiration via CII hhv. (C) mitokondriemasse blev evalueret ved hjælp MitoTracker Green, som beskrevet i afsnittet Metoder. Superoxid blev evalueret ved brug af fluorescerende probe MitoSOX (D), glucose optagelse ved anvendelse af fluorescerende glucoseanalog 2-NBDG (E), ATP-niveauer ved et luciferase-assay (F), ΔΨ

m hjælp af fluorescerende probe TMRM (G ), laktat niveauer ved hjælp af et kommercielt kit (H), for SDH (i) og SQR (J) aktiviteter ved hjælp af enzymatiske assays, og håndholdte celler counter for cellestørrelse (K). (L) TEM blev udført på de enkelte generation sfære celler som beskrevet i afsnittet Metoder. Data i panel A-K er middelværdier ± S. D.., Og er afledt af tre individuelle eksperimenter. Symbolet ‘*’ angiver statistisk signifikante forskelle med

s

0,05. Billeder i panelet L er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Den hvide bar i panelet K i de øverste billeder repræsenterer 500 nm, i de lavere billeder 200 nm.

CD24 knock-down dæmper evne lungehindekræft celler til at danne kugler og danne tumorer

CD24 er en glycosyl phosphatidylinositol-koblede mucin-lignende celleoverfladeprotein med en rolle i celleadhæsion, og udtrykkes i forskellige kræftformer [28-30]. Denne markør er associeret med dårlig prognose i forskellige tumorer og dets nedregulering hæmmer proliferation og inducerer apoptose i tumorceller [31], mens forøget ekspression af CD24 fremmer tumorvækst og metastase [32].

For yderligere at verificere rolle CD24, stærkt udtrykt i Ist-Mes-2 kugler, i ‘stemness “af MM celler, dens udtryk var stabilt nedreguleret ved hjælp shRNA. Vi valgte flere kloner af knock-down celler, hvoraf klone to CD24

– celler viste omkring 80% fald i CD24, som dokumenteret af både western blotting og qPCR (figur 6A og 6B). Vi derefter udført alle eksperimenter med klonen 2-celler. CD24

– Ist-Mes-2-celler erhvervet epitel-lignende morfologi og viste et tab af stamcellerne tilbøjelighed til at danne kugler (Fig 6C). Mere specifikt blev ingen tegn på kugle dannelse observeret efter at opretholde CD24

– celler i SFM i 7 dage, og cellerne fortsatte med at fortsætte i kulturen for nogle flere dage som løse aggregater, før de døde. CD24 knock-down også signifikant undertrykte proliferation af Ist-Mes-2-celler, som dokumenteret i fig 6D. Vi vurderede næste rolle CD24 i den mitogene MAPK-vejen, som udløses fra den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), og som har vist sig at blive overudtrykt i MM [33]. Vore data viser relativt højt niveau af phosphoryleret EGFR i mesospheres, mens faldet mængder pEGFR blev observeret i CD24

– celler. Af de nedstrøms proteiner af MAPK-vejen, CD24

– celler viser lavere phosphorylering af P38 men ikke ERK1 /2, mens P38 blev fundet phosphoryleret i sfære celler (Fig 6E og 6F). Endelig har vi udført et kontrolforsøg for at udelukke muligheden for, at phosphorylering af EGFR i sfærer er på grund af tilstedeværelsen af ​​EGF i medierne. Adhærente parental, CD24

– og mocktransfekterede Ist-Mes-2-celler blev opretholdt i komplet medium i 24 timer i nærvær eller fravær af tilsat EGF og sammen med sfære celler som blev opretholdt i EGF-holdige SFM , vurderet af WB for EGFR og pEGFR (fig 6G og 6H). Resultaterne indikerer, at tilstedeværelsen af ​​EGF i mediet anvendt til dyrkning af adhærerende celler ikke understøtter phosphorylering af EGFR, hvilket er derfor en iboende egenskab af kuglen celler.

(A) Parental, mock-transficerede, klon 2, klon3 og “blandet” celler (IST-Mes-2 celler transficeret med CD24 shRNA og udvalgt til flere kloner) blev vurderet for CD24 hjælp western blotting med actin som lastning kontrol. Relativ niveau af CD24 i cellerne er vist baseret på densitometrisk evaluering i panel B, som også dokumentere CD24 mRNA-niveau relateret til

GAPDH

. (C) Parental og CD24

– Ist-Mes-2-celler (klon 2) blev dyrket enten i serum medium eller SFM. (D) Parental, mock-transficeret og CD24

– vedhængende og sphere Ist-Mes-2 celler blev vurderet for spredning på 48 timer efter såning i kultur på samme celle nummer ved hjælp af krystalviolet analysen. (E) Parental, mock-transficeret og CD24

– vedhængende og kugle Ist-Mes-2-celler blev evalueret for P38, pP38 MAPK, ERK1 /2, pErk1 /2, EGRF og pEGRF ved western blotting med anti-actin IgG som en loading kontrol, med densitometrisk evaluering af blottene i panelet F. (G) Parental, CD24

– eller mock-transficerede celler dyrket enten i komplet medium eller i komplet medium suppleret med rekombinant EGF, eller sfære celler dyrket i