PLoS ONE: βArrestin-1 og Mcl-1 Modulate Self-fornyelse Vækst af Cancer Stem-Ligesom Side-Befolkning Celler i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Side befolkning (SP) celler er blevet rapporteret at have egenskaber af cancer stamceller-lignende celler (CSCS) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), men deres molekylære funktioner er ikke blevet fuldstændigt belyst. Her viser vi, at, NSCLC-SP-celler blev beriget med G

0 /G

1 fase af cellecyklus, havde højere aldehyddehydrogenase aktivitet samt højere klonogene og selvfornyende evne i forhold til vigtigste population (MP) celler. Interessant, SP-celler var også i stand til trans-differentiere i angiogene tubuli

in vitro

og var meget tumorigen i forhold til MP celler. SP-afledte tumorer demonstrerede intratumoral heterogenitet bestående af både SP og MP-celler, hvilket tyder på selvfornyelse og differentiering evne af SP-celler manifesterer

in vivo

samt. βArrestin-1 (βArr1) er involveret i udviklingen af ​​forskellige kræftformer, herunder NSCLCs og vi finder, at udtømning af βArr1 betydeligt blokeret SP fænotype; hvorimod udtømning af parr2 havde relativt små effekter. Ektopisk udtryk for βArr1 medførte øget SP frekvens og ABCG2 udtryk mens ophævelse af βArr1 udtryk undertrykte selvfornyelse vækst og ekspansion af A549 celler. Anti-apoptotisk protein Mcl-1 er kendt for at være en af ​​de vigtigste regulatorer af selv-fornyelse af væv stamceller og menes at bidrage til overlevelsen af ​​NSCLC celler. Vores eksperimenter viser, at højere niveauer af Mcl-1 blev udtrykt i SP-celler sammenlignet med MP-celler ved begge transkriptionelle og translationelle niveau. Desuden kunne Obatoclax, en farmakologisk hæmmer af Mcl-1, effektivt forhindre selv-fornyelse af både EGFR-inhibitor følsomme og resistente NSCLC celler. Afslutningsvis vores resultater tyder på, at βArr1 og Mcl-1 er involveret i selv-fornyelse og udvidelse af NSCLC-CSCS og er potentielle mål for anti-cancer terapi

Henvisning:. Singh S, Bora-Singhal N , Kroeger J, Laklai H, Chellappan SP (2013) βArrestin-1 og Mcl-1 Modulate Self-fornyelse vækst af Cancer Stem-Ligesom Side-Befolkning celler i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10,1371 /journal.pone.0055982

Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA

Modtaget: 10. september 2012; Accepteret: 4 Jan 2013; Publiceret: 13. februar 2013 |

Copyright: © 2013 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskuddet CA127725 fra National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Srikumar P. Chellappan er en akademisk Editor for PLoS ONE; Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

På trods af betydelige terapeutiske fremskridt, lungekræft forårsager maksimale antal kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [1 ], [2]. Ifølge World Health Organization (WHO), vil lungekræft forårsage omkring 2,5 millioner dødsfald om året inden år 2030 [3]. I USA, ca. 85% af patienter diagnosticeret med NSCLCs, dør af denne sygdom inden for fem år [4], [5]. Disse kendsgerninger fremhæve et behov for en bedre forståelse af de cellulære og molekylære begivenheder, der ligger til grund for tilblivelsen af ​​denne sygdom for udviklingen af ​​mere effektive lægemidler. Kræft stamceller model har vist sig som en levedygtig forklaring på initiering og progression af de aggressive kræftformer som NSCLCs og er potentielle terapeutiske mål [6], [7], [8], [9], [10].

Kræft stamceller model antyder, at en delmængde af celler betegnes som cancer stamceller-lignende celler (CSCS) inden tumoren har de deregulerede egenskaber af normale stamceller med vedvarende selvfornyelse, og kan generere sekundære tumorer, rekapitulere heterogenitet og mangfoldighed af oprindelige tumor [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Hoechst 33342 farvestof eksklusive celler, betegnet side-population (SP) celler, er blevet beskrevet at have CSC lignende egenskaber i en række tumorer, herunder NSCLCs [16], hvor de udviste forøget tumorigenicitet når transplanteret til immunkompromitterede mus [17], [ ,,,0],18] i forhold til den primære population (MP). SP fænotype er afhængig af forskellen cellernes evne til at udstrømning Hoechst 33342 farvestof via ATP-bindende kassette (ABC) familie af transportproteiner, hovedsagelig ABCG2 (også kendt som brystkræft resistens protein, BRCP1), der udtrykkes specifikt på cellemembranen i stamcellepopulationer [19]. Tidligere undersøgelser har vist, at der findes SP celler i visse etablerede humane NSCLC cellelinjer [16] men deres detaljerede molekylære karakterisering samt funktionel evne til at generere heterogene tumorer stadig at blive belyst. I denne undersøgelse, giver vi en omfattende dokumentation for, at SP celler isoleret fra etablerede humane NSCLC cellelinjer og tumorer er stærkt beriget med NSCLC-CSCS. Desuden finder vi, at ALDH1, som er blevet identificeret som en markør for CSC fra andre typer af tumorer, er beriget med SP celler fra NSCLC. Vores molekylære analyser viser, at stamcelle lignende egenskaber af SP-celler er reguleret i det mindste delvist af stilladset protein, β-arrestin-1; desuden overlevelse protein Mcl-1 spiller en rolle i selvfornyelse af disse celler. Således fremgår det, at målrette β-arrestin-1 eller Mcl1 kunne være levedygtig middel til at hæmme stamceller-lignende egenskaber af SP celler fra NSCLC.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

Ikke-småcellet lunge adenocarcinom cellelinjer, A549, blev H1650, H460 og H1975 opnået fra ATCC og vedligeholdes i RPMI eller DMEM containing10% føtalt bovint serum (FBS, Mediatech) i 5% CO

2 ved 37 ° C. Selv om disse cellelinjer oprindeligt blev købt fra ATCC, vi ikke forny dem. Fumitremorgin C (FTC) blev købt fra Sigma Inc og Obatoclax blev købt fra Selleck Chemicals LLC.

RNA Forberedelse og Real Time qPCR Analyse

RNA ekstraktion og cDNA præparat blev fulgt som beskrevet tidligere [20 ], [21], [22]. Real-time PCR blev udført med 1 pi af cDNA i en MyiQ real-time PCR detection system (Bio-Rad) ved anvendelse iQ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) ifølge producentens anvisninger. Fold induktioner blev beregnet ved hjælp af formlen 2

– (ΔΔCt) ved hjælp af GAPDH som intern kontrol gen. De genspecifikke primerpar var som følger. CD31 (F) 5’CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 «, CD31 (R) 5’AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT -3« βArr1 (F) 5’AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3 «, βArr1 (R) 5’GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3″, Mcl-1 (F) 5’ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3 “, Mcl-1 (R) 5’TCCTGATGCCACCTTCTAGG -3 ‘, GAPDH (F) 5′-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3′, GAPDH (R) 5’-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3 ‘.

Western blot-analyse

Lysater fra sorterede SP og MP-celler blev fremstillet ved NP40 lysis som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt blev sorterede celler vasket to gange med iskold PBS. Cellerne blev spundet ved 800

g

og lyseret under anvendelse af M2 lysepuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA og 3 mM EDTA) indeholdende protease inhibitorer. Lige store mængder proteiner (50 ug) blev separeret på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad), blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og inkuberet med de passende primære antistoffer. Monoklonale antistoffer mod ABCG2 og βArr1 blev indkøbt fra Millipore og polyklonale antistof mod E2F1 og Mcl1 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology Inc.

Hoechst 33342 Dye efflux Assay for SP Analyse og Celle Sortering

klæbende celler blev høstet under anvendelse Accutase reagens (Sigma Inc.). For tumoreksplantater, blev primære humane tumorvæv dyrkes i athymiske nøgne mus hakket, enzymatisk fordøjet med 0,2% collagenase IV (Worthington Biochemical Corporation) fremstillet i 10% FBS indeholdende medium i 60 minutter ved 37 ° C. Fordøjelsen blev yderligere opdelt ved passage gennem 10 ml pipette flere gange og filtreret gennem 100/70 um cellefilter til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Celler blev vasket og resuspenderet i DMEM /F12K med 2% FBS ved 1 × 10

6 celler /ml densitet og inkuberet med 4 ug /ml Hoechst 33342 farvestof (Invitrogen) i 90 minutter ved 37 ° C i nærvær eller fravær af 1 pM FTC, som beskrevet af Goodell et al. [23]. Celler blev inkuberet med 2 ug /ml propidiumiodid (PI; Sigma Inc.) før analyse for at visualisere og udelukke de ikke-levedygtige celler. Hoechst 33342 farvestof blev anslået ved 350 nm ved anvendelse af UV-laser og dens fluorescens blev analyseret under anvendelse af 400-500 nm BP filter for blå emission og 640-680 nm BP filter i kombination med 655 nm LP-filter for rød emission. Flowcytometre fra BD Biosciences blev brugt til dataopsamling. Data blev erhvervet ved hjælp LSRII eller FACS Vantage (DIVA), og sorteres ved hjælp af FACS Vantage (DIVA) celle sorteringsanlæg. Data analyser blev udført ved hjælp FlowJo software (Tree stjerne).

Aldefluor Assay

Aldefluor kit blev brugt til at profilere og separate celler med høj ALDH aktivitet som pr instruktion af producenten (Stem Cell Technologies). Kort fortalt blev Hoechst 33342 farvede celler inkuberet med ALDH proteinsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa) i Aldefluor assaybuffer suppleret med 1 pM FTC at forhindre udstrømningen af ​​Hoechst farvestof. Efter 45 minutters inkubering ved 37 ° C blev celler, der kan konvertere Baaa til dens fluorescerende produkt BODIPY-aminoacetat (BAA) betragtes ALDH-Hi. Portene til flowcytometrisk analyse blev trukket i forhold til baseline fluorescens, hvilket blev bestemt ved tilsætning af ALDH-specifik inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Prøver behandlet med DEAB alene tjente som negativ kontrol.

Sphere Dannelse eller Self-fornyelse Assay

Sorteret SP eller MP-celler blev forgyldt med ultralav friktion brøndsplader 96 (Corning) på tæthed 10.000 celler /ml (1000 celler /brønd i 100 pi medium) i serumfrit DMEM /F12K (1:1) (Invitrogen), som suppleres med 1X-N2 supplement (Invitrogen), 10 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF (Sigma) og fik lov at vokse i 10 dage. Billeder af kuglerne blev taget under anvendelse af fasekontrast-mikroskop (Nikon) og det totale antal sfærer mere at 60 um blev talt. For at undersøge effekten af ​​lægemidler på selv-fornyelse af SP celler blev narkotika føjet til de respektive brønde på dag 1 og 5 og størrelse ( 60 pm) og antallet af kugler blev analyseret på dag 10.

In vivo

tumordannelse assay.

5-uger gammel kvinde SCID-beige mus blev anvendt til disse eksperimenter under en protokol, der blev godkendt af Institutional Animal brug og Omsorgsudvalget på University of South Florida (Animal Welfare Assurance Number A4100-01). Sorteret SP eller MP-celler fra H1650 cellelinje blev vasket med serum-frit DMEM-F12K og suspenderes i en 01:01 blanding af vækstfaktor reduceres Matrigel (BD) og HBSS ved angivne tal og implanteret subkutant. Tumorvolumener blev bestemt en gang om ugen ved at måle længden (

L

) og bredde (

W

), og volumen beregnes ved hjælp af formlen

V =

1/2 ×

L

×

W

2AS beskrevet tidligere [21], [22], [24], [25]. Den sundhedsstatus mus blev overvåget dagligt for tegn på ubehag, herunder inaktivitet, hypoaktivitet, hyperaktivitet, rastløshed, selv-traumer, aggressivitet, isolation fra bur kammerater, ataksi, overfladisk, hurtig og /eller besværet vejrtrækning, blege slimhinder, cyanose , manglende groom, kakeksi, snavsede anogenital område, manglende respons på stimuli, manglende nysgerrighed, vokalisering, ascites, og /eller bøjet kropsholdning. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Ved afslutningen af ​​forsøget, vil dyrene blive eutaniseret ved udsættelse for stigende koncentrationer af CO

2 i en dedikeret CO

2 kammer; komprimeret gas blev anvendt en kilde til CO

2.

statistiske metoder

Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). For at vurdere den statistiske signifikans af forskelle, blev studerendes

t

test. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af Microsoft Excel-software. Dataene blev betragtet som statistisk signifikant, når

s Drømmeholdet værdi var mindre end 0,05.

Resultater

SP Celler fra NSCLC Demonstrer stamcelle-lignende egenskaber

det blev forsøgt at vurdere procentdelen af ​​SP-celler i fire forskellige humane NSCLC cellelinjer, valgt på grundlag af K-Ras eller EGFR mutation status. A549 (K-Ras mutant vildtype EGFR forstærkning) og H460 (K-Ras mutant) samt H1650 (EGFR mutant; Exon 20 deletion: delE746-A750) og H1975 (EGFR mutant, L858R og T790M mutationer) celler indeholdt SP -celler med varierende frekvens i området fra ca. 8% (H1975) til 40% (H460). En specifik inhibitor af ABCG2 [26], Fumitremorgin C (FTC) kunne blokere udseendet af SP-celler (figur 1A), hvilket antyder, at denne særlige transportør spiller en særlig rolle i at opretholde SP fænotype. Disse resultater antyder, at SP-celler er til stede i NSCLC linjer, og forekomsten heraf er uafhængig af K-Ras eller EGFR mutation status.

(A) FACS-analyse på enkelt cellesuspension af humane NSCLC cellelinjer farvet med Hoechst 33342 farvestof viser SP-celler. SP celler er indkapslet i det område afgrænset i pink. Fumitremorgin C inhiberede udstrømningen af ​​farvestoffet og forårsagede forsvinden af ​​SP-celler. Hyppigheden af ​​SP-celler er repræsenteret. (B, C) Cellecyklusanalyse under anvendelse område-histogram parameter for blå emission af Hoechst 33342 som beskrevet i teksten. Vist i B-profil er repræsentant for alle fire cellelinier. (D) Aldefluor assay på Hoechst 33342 farves H1975 og H1650 celler. Basislinjen fluorescens blev etableret ved inhibering ALDH aktivitet med DEAB (venstre) til at generere porten til at identificere ALDH-Hi celler i alt samt SP og MP-celler, som ikke er inkuberet med DEAB (tre højre paneler). Alle ALDH-Hi celler er indesluttet inden for det område afgrænset i pink. Den fold forskel i hyppigheden af ​​ALDH-Hi celler mellem SP og MP-celler er plottet.

Det er blevet foreslået, at den normale væv stamceller og stamceller-lignende tumorfremkaldende celler har forskellige cellecyklus profiler sammenlignet med differentierede celler, og de fremskridt gennem cellecyklus langsommere [27], [28]. På denne baggrund, vi gjort forsøg på at undersøge, om cellecyklus profil af SP celler afveg fra de differentierede MP celler. For at undersøge fordelingen cellecyklus blev histogrammet profil dannet fra parameter område for blå emission af Hoechst 33342 anvendt til at undersøge cellecyklus fase fordeling for SP og MP-celler. Eftersom FTC behandling tillader både SP og MP-celler at bevare Hoechst 33342 farvestof, blev denne prøve bruges til at markere grænserne for G

1 og S-G

2 /M faser på grundlag af deres DNA-indhold. Lignende portene blev anvendt for de prøver, hvor FTC ikke blev tilsat, og dermed SP celler optrådte som en sub-G

0 /G

1 populationen (figur 1B). Ved sammenligning af fordelingen af ​​FTC behandlede og ubehandlede celler, blev det konstateret, at 80-100% af SP-celler var i G

0 /G

1 fase af cellecyklussen, afhænger af cellelinien (figur 1C). I alle tilfælde, SP-celler havde mere G

0 /G

1 celler end MP-celler fra samme cellelinie, hvilket antyder, at de har svækket cellecyklusprogression karakteristisk for stamceller-lignende celler.

Eksperimenter blev udført for at undersøge, om andre cancer stamceller markører udtrykkes på SP celler. Omhandler dette formål, flowcytometri blev udført for aktiviteten af ​​aldehyd-dehydrogenase (ALDH-Hi), som for nylig er blevet anvendt som en potentiel markør for at identificere CSCS i NSCLCs [29], [30]. Analyse under anvendelse af Aldefluor assay kit på H1650 og H1975 cellelinier viste 8 og 6 gange højere frekvens af ALDH-Hi celler i SP-celler sammenlignet med MP-celler, hvilket antyder, at SP-celler isoleret fra NSCLC cellelinier beriget med stamceller lignende celler (figur 1D), som set ved ekspressionen af ​​en anden markør. Samlet set ca. 1,3% af H1650-SP celler og 2% af H1975-SP celler ALDH-Hi celler.

SP Cells Display stamcelle-lignende egenskaber

in vitro

In vitro blev udført Salg forsøg på yderligere at karakterisere SP og MP-celler. Ved cellesortering blev celler udpladet ved høj densitet (10.000 celler /brønd i 96-brønds plade) i komplette medier og overvåges i 6 dage ved MTT-assayet. H1650-SP og MP-celler havde sammenlignelig proliferation kapacitet ved dyrkning i komplette medier under adhærerende betingelser (figur 2A), hvilket tyder på, at både de sorterede cellefraktioner er lige sunde og Hoechst 33342 farvestof farvning for SP analyse og cellesortering protokol havde nogen skadelig virkning på disse celler. Et karakteristisk træk ved stamceller er deres evne til at forny sig selv og også at give anledning til mere differentierede celler, gennem asymmetrisk division [15]. Selvfornyende normale eller cancer-stamceller lignende celler kan vokse som ikke-adhærente sfærer, når de dyrkes ved lav densitet i serumfrit, stamcellefaktor selektivt medium; differentierede celler vokser ikke eller danner kugler i dette medium [13], [31], [32]. Den selv-fornyelse ejendom af SP-celler blev undersøgt ved at udføre sfære dannelse under anvendelse SP og MP celler isoleret fra H1650 celler. Mens SP-celler var i stand til at vokse som sfærer, MP-celler havde markant mindre kapacitet til at vokse under lignende betingelser (figur 2B) antyder, at selvfornyelse evne karakteristisk for stamceller vises kun ved SP-celler. Vi undersøgte derpå klonogene potentiale både SP og MP-celler ved udpladning af cellerne og dyrkning ved klonal densitet (1000 celler i 60 mm-plade) i 21 dage i FBS indeholdende medier. I dette panel celler udpladet med meget lav densitet, og deres langsigtede proliferation og kolonidannende evne blev kontrolleret. Som vist i figur 2C, dannelse af store kolonier var væsentligt større blandt SP celler end det var blandt MP-celler. Levedygtighed kolonidannende celler blev bestemt ved MTT-assay (figur 2D), kollektivt det dokumenteres, at SP-celler udviser øget clonogenicity.

(A) Vækst kurve på 10.000 H1650-SP eller MP-celler blev dannet ved anvendelse MTT celleproliferationsassay i regelmæssig vækstmedium [22]. (B) SP eller MP-celler fra H1650 cellelinje blev udpladet i serumfrit medium suppleret med EGF og bFGF i 10 dage. Den gennemsnitlige (± SD) antal kugler fra 1000 celler er plottet. (C) H1650-SP-celler resulterede i større og flere kolonier sammenlignet med MP-celler, når udpladet med en densitet på 1000 celler pr 60 mm plade. (D) Cellelevedygtighed blev analyseret efter 21 dages plating via MTT assay. (E) SP eller MP-celler blev udpladet på Matrigel og dyrket i endotel-vækstmedium (Lonza) natten over. SP celler gav anledning til angiogene ligesom tubuli effektivt. (F) Real time qPCR analyse på SP og MP celler udføres for

CD31

mRNA-ekspression. (G) CD31 ekspression på angiogene tubuli som visualiseret ved immunofluorescens.

Visse typer tumorer er blevet rapporteret at demonstrere vaskulær mimicry, skyldes muligheden af ​​tumorceller til at erhverve egenskaber af endothelceller og andre cellulære komponenter i vaskulaturen [33], [34], [35]. Rolle cancer stamceller i denne sammenhæng er blevet undersøgt, og de seneste beviser tyder på, at CSCS fra gliomer kunne transeuropæiske differentiere til endotel afstamning [33], [34], [35]. På denne baggrund undersøgte vi kapaciteten af ​​H1650 SP celler til at danne angiogene tubuli

in vitro

. H1650-SP udpladet på matrigel dannet et netværk af angiogene tubuli efter behandling med VEGF, mens MP celler blev væsentligt forringet i denne evne (figur 2E). Det blev konstateret, at MP-celler forblev relativt uorganiseret, sammenlignet med den organiserede tubulus lignende strukturer dannet af SP-celler. Eksperimenter blev udført for at vurdere, om tubulus lignende strukturer dannet af SP celler udviser biokemiske træk ved angiogene fartøjer. Mod dette formål, en real-time PCR-analyse blev først gennemført, hvilket viste en højere udtryk for endotel specifik

CD31

mRNA i SP celler sammenlignet med MP-celler (Figur 2F). Endvidere immunfluorescensfarvning af tubuliene viste, at disse tubuli dannes af SP-celler var stærkt positive for CD31-ekspression (figur 2G), hvilket antyder, at SP-celler kan nå et endothelial afstamning. Disse eksperimenter svælgede at SP celler isoleret fra en NSCLC cellelinje kan transdifferentiate i endotel-lignende celler og kan være i stand til at give anledning til angiogene tubuli i tumorer.

SP Celler Beriget med Tumordannende Cells og Demonstreret Selv- fornyelse og Differentiering af SP celler

in vivo

i betragtning evne SP celler til selv forny og differentiere i angiogene tubuli samt MP celler, vi næste undersøgt evne SP eller MP celler til at danne tumorer i SCID-mus. SP og MP celler fra H1650-cellelinje blev implanteret subkutant på den dorsale flanker af SCID mus og tumorvækst vurderes ugentligt af tykkelsesmålinger. Som vist i figur 3A, fire mus (n = 5) injiceret med 10.000 SP celler produceret store tumorer (volumen ~1400 mm

3) inden for 11 uger efter implantation. Imidlertid blev et tilsvarende antal MP celler væsentligt forringet i deres evne til at danne tumorer inden for samme tidsramme; tumorerne var relativt mindre og forblev tæt på den implanterede størrelse (volume~100 mm

3) (figur 3B). Endvidere SP-celler dannede tumorer selv med 1.000 celler (volumen ~471 ± 141 mm

3) efter 19 ugers implantation, hvorimod tilsvarende antal MP-celler blev ikke opnået nogen tumorer (figur 3A).

(A) Sorted SP og MP-celler fra H1650-cellelinje blev implanteret i flankerne af SCID-mus. Tumorforekomst og den gennemsnitlige mængde (± standardfejl) af tumorerne dannet inden for den angivne tid er tabuleret. (B) Vækst kinetik tumorer fra SP og MP-celler, målt ugentligt. De punkter repræsenterer gennemsnittet (± standardfejl). (C) subkutane tumorer afledt af 10.000 H1650-SP-celler eller 100.000 H1650-MP-celler blev reseceret og analyseret for SP fænotype i nærvær eller fravær af FTC. Tumorer fra SP og MP celler indeholdt overvejende differentierede MP celler.

For at belyse, om tumorer genereret fra SP celler havde heterogene SP og MP celler blev Hoechst 33342 farvning og SP analyse udført efter enzymatisk dissociation af subkutan tumor xenografter. Tumorer genereret fra 10.000 H1650-SP-celler blev hovedsageligt sammensat af MP-celler henviser SP celler blev opretholdt ved ca. 3% frekvens i tumoren (figur 3C, øvre panel). Disse resultater indikerer, at SP-celler stærkt beriget med CSCS der er i stand giver anledning til tumorer samt forny sig selv og differentiere sig

in vivo

. Dog tumorer genereres i en mus (ud af tre) ved implantation af 100.000 H1650-MP celler demonstrerede dedifferentieringen af ​​MP celler til at generere SP celler

in vivo

(figur 3C, nederste panel), efter 9 uger i disse mus (figur 3B). Faktisk er det blevet rapporteret, at differentierede kræftceller kan være i stand til at de-differentiere og erhverve stamceller-lignende egenskaber i visse tilfælde [36], formentlig lette forsinket væksten af ​​tumorer.

βArr1 Regulerer Self-fornyelse vækst af SP Celler Salg

βarrestin-1 (βArr1) er et stillads protein, der spiller en stor rolle i desensibilisering af G-protein-koblede receptorer [20], [37], [38], [39], [40]. Nylige undersøgelser har vist, at βArr1 spiller en rolle i aktiveringen af ​​Src kinaser ved forskellige receptorer og kan lette spredningen af ​​lungecancerceller [38], [41]. Endvidere fandtes βArr1 niveauer at være forhøjet i metastatisk NSCLC og andre kræftformer i forhold til normalt væv eller primære tumorer [20], [39], [40], [41]. Givet korrelationen mellem βArr1 med tumorudvikling og metastase, undersøgte vi, om dette protein spiller en rolle i de stamcellelignende egenskaber af SP-celler. I det første sæt eksperimenter blev siRNAs til βArr1 eller de relaterede parr2 gener transficeret i H1650, H1975 og A549-celler; en ikke-targeting siRNA blev anvendt som kontrol. Det konstateredes, at transient transfektion af βArr1 specifik siRNA faldt hyppigheden af ​​SP-celler med ca. 40 til 70%; reduktionen var kun 10 til 20%, når parr2 siRNA blev transficeret (figur 4A); antyder en vigtig rolle βArr1 i reguleringen af ​​SP frekvens. For yderligere at belyse den rolle, βArr1 i stamme-lignende funktioner af SP-celler, genereret vi A549-celler, der stabilt overeksprimeres rotte βArr1, eller dem, der var stabilt transficeret med en shRNA til βArr1. Det blev konstateret, at celler, der stabilt overudtrykker βArr1 havde cirka tre gange mere SP-celler sammenlignet med kontrolgruppen A549-celler, der stabilt udtrykte GFP (A549-GFP). En stabil udtømning af βArr1 hjælp af en specifik shRNA (A549-shβArr1) resulterede i et signifikant fald i SP frekvens sammenlignet med en kontrol cellelinie, som blev stabilt transficeret med en ikke-målrettet shRNA (A549-kontrol) (figur 4B). blev gennemført Real-time PCR-forsøg for at vurdere, om ændringerne i SP frekvens korreleret med forskellige niveauer af ABCG2. Det konstateredes, at A549 stabilt overudtrykker βArr1 havde to gange mere ABCG2 besked sammenlignet med celler transficeret med GFP. Omvendt celler depleteret for βArr1 havde signifikant lavere ABCG2 besked sammenlignet med kontrol shRNA udtrykkende celler (figur 4C). Disse resultater blev bekræftet ved Western blotting (figur 4D); Det viste sig, at βArr1 nul-celler havde lavere mængder af ABCG2 samt βArr1, men sammenlignelige mængder af β-actin og E2F1, der blev anvendt som kontroller.

(A) H1650, H1975 og A549-celler blev transficeret med siRNA mod βArr1 og parr2. Hyppighed af SP-celler blev sammenlignet med ikke-targeting kontrol siRNA transficerede celler. SP celler er indkapslet i det område afgrænset i pink. Bar diagrammer repræsenterer fold forskel i frekvens i siRNA transficerede celler i respektive cellelinier. (B) SP frekvens blev analyseret og repræsenteret A549 celler ektopisk udtrykker rotte-βArr1 eller GFP og shRNA mod βArr1 eller ikke-targeting kontrol shRNA. (C) Real-time PCR og (D) Western-blot-analyse for ABCG2 ekspression blev udført for disse stabile cellelinier. (E, F, G) A549 celler stabilt udtrykker shRNA mod βArr1 og ikke-målrettet shRNA udpladedes for selvfornyelse assay. (E) fasekontrastmikroskopi billeder af kugler i nærvær eller fravær af lægemidler præsenteres. (F, G) Gennemsnitligt antal og størrelse af de sfærer genereret per brønd fra 1000 celler er plottet (middelværdi ± SD).

I betragtning af den rolle βArr1 i generation af SP celler, vi næste undersøgt, om dette protein letter selvfornyelse så godt. Mod dette formål blev SP celler isoleret fra A549 celler stabilt udtrykker en shRNA mod βArr1 eller en ikke-målrettet kontrol shRNA og selvfornyelse ejendom vurderet af kugle dannelse analyser. Det blev konstateret, at celler, der mangler βArr1 havde markant lavere antal kugler (fig 4E); Endvidere er størrelsen af ​​de dannede kugler af βArr1 nul-celler var markant lavere end de, der dannes af SP-celler fra kontrolceller (figur 4F, G). Disse forsøg viser tydeligt, at stilladset protein βArr1 spiller en rolle i etableringen af ​​SP celler gennem reguleringen af ​​ABCG2 udtryk og også letter selvfornyelse ejendom af disse NSCLC stamceller-lignende celler.

Inhibitor af Mcl- 1 Mål Self-fornyelse vækst af SP celler

Forbedret celleoverlevelse og narkotika modstand er en funktion i cancer stamceller [10], [42]. Den anti-apoptotiske protein Mcl-1, er blandt de hyppigst opformerede gener i human cancer, herunder NSCLCs [22], [43], [44],. For nylig har undersøgelser også forbundet MCL-1 funktion med regulering af selvfornyelse af hæmatopoietiske stamceller [48], [49]. I betragtning af den potentielle rolle Mcl-1 i bloddannende stamceller, vi næste udforsket, om Mcl-1 funktion bidrager til selvfornyelse egenskab NSCLC-SP celler. Som et første skridt blev QRT-PCR udført på RNA isoleret fra SP og MP celler isoleret fra H1650, A549 og H1975 cellelinjer. MCL-1 besked blev udtrykt ved højere niveauer i SP celler fra alle de tre cellelinjer (figur 5A). MCL-1 proteinniveau blev også forhøjet i SP-celler sammenlignet med MP-celler i alle tre cellelinier, som set ved western blotting (figur 5B).

(A, B) Relativ ekspression af Mcl-1 blev undersøgt på mRNA og protein niveauer for angivne cellelinjer ved RT-PCR og Western blot-analyse. (C) Struktur af Obataoclax og dens behandling tidsplan er repræsenteret. (D) H1650-SP-celler blev sorteret og udpladet for selvfornyelse assay i nærvær eller fravær af Obatoclax ved angivne koncentration. Gennemsnitligt antal sfærer genereret per brønd fra 1000 celler er plottet (middelværdi ± SD). Fasekontrastmikroskopi billeder af kugler i nærvær eller fravær af lægemidler præsenteres. (E) SP-celler blev sorteret fra erlotinib resistent H1975 cellelinje og udpladet til selvfornyelse assay i nærvær eller fravær af angivne lægemidler. Gennemsnitligt antal sfærer genereret per brønd fra 1000 celler afbildes (middelværdi ± SD) og (F) fasekontrastmikroskopi billeder af kugler i nærvær eller fravær af lægemidler præsenteres. (G) Western-blot-analyse af βArr1 og parr2 i Obatoclax behandlede celler. Inhibering af Mcl-1 påvirkede ikke ekspression af βArr1 og parr2 i nogen af ​​de testede cellelinier.

Obatoclax er en hydrofob molekyle (figur 5C), der blev udviklet som et Bcl-2-familien antagonist herunder Mcl-1 [50]. Obatoclax har vist sig at overvinde modstand mod apoptose medieret specifikt af Mcl-1 [51]. Derfor her brugte vi Obatoclax at udforske rollen som Mcl-1 i selvfornyelse af SP celler, ved at foretage kugle dannelse analyser i tilstedeværelse eller fravær af Obatoclax. Som vist i figur 5C blev celler podet på dag 1 for kugle-dannelse assay og Obatoclax blev tilsat på day1 og dag 5 ved angivne dosis. Efter 10 dages udpladning antallet af kugler blev talt og analyseret. Som vist i figur 5D, inhibering af Mcl-1-aktivitet ved 200 nM Obatoclax viste en 4-5 gange fald i antallet af kugler; yderligere størrelsen af ​​kuglerne var også signifikant reduceret som vist på billedet over linjen (figur 5D). 500 nM koncentration af Obatoclax fuldstændig undertrykt kuglen dannelse (figur 5D).

Erlotinib og gefitinib hæmmer EGFR, der viser signifikant effekt i behandling af NSCLC patienter huser EGFR-mutationer [52], [53]. Samtidig er en sekundær punkt mutation i exon 20 af EGFR (T790M) i forbindelse med erhvervet resistens over for EGFR-hæmmere, herunder Erlotinib [52].