PLoS ONE: Apoptose Induktion af MEK Inhibering i Human Lung Cancer Cells medieres af Bim

abstrakt

AZD6244 (Arry-142.886) er en inhibitor af MEK1 /2 og kan inhibere celleproliferation eller inducerer apoptose i en celletypespecifik måde. Den præcise molekylære mekanisme AZD6244 apoptose er ikke klart. For at undersøge mekanismerne for AZD6244 induceret apoptose i human lungecancer, bestemte vi de molekylære ændringer i to undergrupper af humane lungecancer-cellelinjer, der enten følsomme eller resistente over for AZD6244 behandling. Vi fandt, at AZD6244 fremkaldte en stor stigning af Bim proteiner og en mindre stigning i PUMA og NOXA proteiner og inducerede celledød i følsomme lungekræft cellelinier, men havde ingen effekt på andre Bcl-2-beslægtede proteiner i disse cellelinjer. Knockdown af Bim af siRNA stærkt forøget IC

50 og reduceret apoptose for AZD6244 behandlede celler. Vi fandt også, at niveauet af endogen p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a var lavere i AZD6244-sensitive celler end i AZD6244-resistente celler. I de følsomme celler, AZD6244 induceret FOXO3a nukleare translokation kræves for Bim aktivering. Desuden undertrykkelse af FOXO3a af siRNA ophævet AZD6244-induceret celle apoptose. Desuden fandt vi, at transfektion af konstitutivt aktiv AKT opreguleret p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a udtryk og hæmmede AZD6244-induceret Bim udtryk i sensitive celler. Disse resultater viser, Bim spiller en vigtig rolle i AZD6244-induceret apoptose i lungecancerceller og at PI3K /AKT /FOXO3a pathway er involveret i Bim regulering og modtagelighed lungecancerceller til AZD6244. Disse resultater har konsekvenser i udviklingen af ​​strategier for at overvinde modstanden mod MEK-inhibitorer

Henvisning:. Meng J, Fang B, Liao Y, Chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) Apoptose Induktion af MEK Hæmning i humane lungecancerceller medieres af Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10,1371 /journal.pone.0013026

Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA

Modtaget: 23. maj 2010; Accepteret: August 31, 2010; Udgivet: 27 September, 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute Specialized Program for Forskning Excellence (SPORE) Grant CA-70.907 (J. Minna og J. Roth), R01 Grant CA-092.487 (B. Fang), og Cancer center Support Grant CA-16672. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Dette arbejde blev også støttet af en Sponsoreret Research Grant fra AstraZeneca Farmaci der havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev støttet af en Sponsoreret Research Grant fra AstraZeneca Farmaci. Den bidragyder AstraZeneca havde en rolle i enten studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Aktivering af Ras /Raf /MEK /MAP kinase pathway har været impliceret i ukontrolleret celleproliferation og tumorvækst. AZD6244 (Arry-142.886), en hidtil ukendt, selektiv, ATP-konkurrencedygtige inhibitor af mitogenaktiveret proteinkinase kinase 1/2 (MEK1 /2), har udvist aktivitet i nanomolære koncentrationer mod isoleret MEK enzym og talrige cancercellelinier [1] . In vitro undersøgelser viste, at AZD6244 nedreguleres niveauer af p-ERK effektivt. AZD6244 har udvist aktivitet i flere tumor xenograft modeller af human cancer [2] – [4]. I kliniske forsøg, mens patienter fra flere tumortyper har vist reaktioner på MEK inhibitor monoterapi, andre patienters tumorer, især ikke-småcellet lungekræft, er i sagens natur resistente over for MEK hæmning. Derfor er det vigtigt at forstå de underliggende mekanismer, der er ansvarlige for resistens over for MEK hæmning i tilfælde bliver det vigtigt terapeutisk modalitet i denne meget almindelige kræftform.

Vores tidligere undersøgelse [5] viste, at MEK-inhibitor AZD6244 potent proliferation i nanomolære koncentrationer i Calu-6, H2347 og H3122 lungecancer-cellelinjer, men havde ringe virkning på H196, Calu-3, H522, eller HCC2450 cellelinier. Desuden fandt vi, at følgende sub-G1 cellecyklusstandsning, 20-40% af AZD6244-sensitive celler undergik apoptose, vi observeret nogen apoptose i AZD6244-resistente celler. Vi har tidligere vist, at p-AKT ekspression er lav i AZD6244-sensitive lungekræft cellelinier, men høj i resistente celler, hvilket antyder, at p-AKT er en mediator af resistens over for AZD6244 behandling. I dette papir undersøger vi downstream mæglere i AZD6244-induceret apoptose i humane lunge kræftceller.

Apoptose kunne reguleres via ydre (død receptor) eller iboende (mitokondrier) celledød veje. Intrinsic apoptose medieret af Bcl-2-familien proteiner, der består af tre underfamilier: de pro-overlevelse medlemmer, såsom Bcl-2 eller Mcl-1, den pro-apoptotiske Bax /Bak undergruppe, og den pro-apoptotiske Bcl-2 homologi 3-only (BH3-only) proteiner. Apoptotiske stimuli udløser aktivering af specifikke BH3-only proteiner, som derefter engagere de pro-overlevelse Bcl-2 familiemedlemmer og befri nedstrømseffektorer, Bax og Bak, at fremkalde mitokondrie ydre membranpermeabilisering, udløsningen caspasekaskaden og kulminerede i celledød. Bim, p53-opreguleret modulator af apoptose (PUMA) og NOXA er for nylig blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i kemoterapi og målrettet terapi induceret apoptose i brystcancer [6], leukæmi [7], myeloma [8] og NSCLC [ ,,,0],9] celler.

FOXO transskription faktor medlemmer fremmer eller inaktivere flere mål gener involveret i tumor undertrykkelse, såsom

Bim

,

FasL

, og

TRAIL

gener til at inducere apoptose [10], [11],

p27KIP1

,

cyklin D15

for celle cyklus regulering [12], og

GADD45a

for DNA-skader reparation [13]. FOXO3a er en af ​​de vigtigste FOXO familien af ​​transkriptionsfaktorer, der har en bred vifte af cellulære funktioner. FOXO3a phosphoryleres og inaktiveret ved AKT gennem fosforylering på Thr32, Ser253 og Ser315 som resulterer i nuklear eksport og hæmning af dets transskription aktivitet [14], [15]. FOXO3a har også vist sig at være reguleret af oncoproteinet ERK [16] ved tre ERK phosphoryleringssites, Ser 294, Ser 344, og Ser 425. Som med AKT, phosphorylering af disse serinrester med ERK øget FOXO3a cytoplasmatisk fordeling og nuklear eksport.

Fordi balancen mellem antiapoptotiske og proapoptotiske proteiner er afgørende for lægemiddelinduceret apoptose, vi evaluerede ændringer i Bcl-2-familien proteiner i AZD6244 følsomme og resistente lungekræft cellelinier og fandt, at MEK-inhibitor AZD6244 opregulerer de proapoptotiske BH3-kun proteiner Bim, PUMA og NOXA, en proces forbundet med efterfølgende celledød. Vi fandt også, at silencing enten FOXO3a, en transskriptionel regulator af Bim, eller Bim med lille interfererende RNA (siRNA) i høj grad inhiberet apoptose. Desuden udtryk for konstitutivt aktiv AKT (caAKT) i sensitive celler hæmmede AZD6244-induceret Bim overekspression og førte til AZD6244 modstand. I modsætning hertil stabil transfektion af dominant-negative AKT i resistente celler forbedret AZD6244-induceret Bim over-exrpession.

Materialer og metoder

Materialer

AZD6244, leveres af AstraZeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, UK), blev opløst til 25 mM i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret ved -80 ° C. Antistof mod Bim blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). Antistoffer mod p-ERK, FOXO3a, p-FOXO3a (Thr32) blev p-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, NOXA og PUMA, og AKT kinaseassay-kit købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mod Bak, Bcl-xl og caspase-9 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Forhåndsudformede FOXO3a siRNA blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og Bim og kontrol siRNA var fra Qiagene (Valencia, CA). Fuldlængde humant BimEL cDNA, som er klonet i ekspressionsvektoren pCMV6-XL4, blev købt fra OriGene Technologies (Rockville, MD). Proteaseinhibitorcocktail, β-actin antistof og sulforhodamin B (SRB) var fra Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). Proteinassay materialer og SYBR Green Supermix blev indkøbt fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), og Geneticin var fra Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA). Lipofactamin 2000 og Trizol-reagens blev købt hos Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), og revers transskription reagenser var fra Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Deadend ™ Flurometic TUNEL System blev købt fra Promega (Madison, WI).

Cell kultur

Cellelinjer H2347, H3122, H196, HCC2450, og H522 blev tilvejebragt af Drs. A. Gazdar og J. Minna, Hamon Center for Therapeutic Oncology Research, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Alle lungekræft cellelinier blev opretholdt i høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 pg /ml ampicillin og 0,1 mg /ml streptomycin; cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 og 95% luft.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af SRB-assayet, og hvert assay blev udført firdobbelt. Lungecancerceller blev podet ved ca. 3.000 per brønd i 96-brønds plader og inkuberet i 24 timer i DMEM suppleret med 10% FBS. Cellerne blev derefter behandlet med AZD6244 i de angivne koncentrationer, der var ækvivalent med serumkoncentrationer opnået i patienter efter oral administration. Celler behandlet med DMSO blev anvendt som kontroller. Celler blev fikseret 96 timer efter behandling ved tilsætning af 50 pi 10% trichloreddikesyre ved 4 ° C i 1 time. De blev derefter farvet med 70 pi af 0,4% SRB i 60 minutter og vasket med 1% eddikesyre; 200 pi Tris-base (10 mmol /l; pH 10,5) blev tilsat. Absorbansaflæsninger ved 570 nm blev bestemt ved anvendelse af en mikroplade analysator. Den relative overlevelsesrate (%) blev beregnet ved hjælp af ligningen OD

T /OD

C x 100% (med OD

T repræsenterer absorbansen af ​​behandlingsgrupper, og OD

C absorbansen af ​​kontrol grupper). Median inhiberende koncentrationer (IC

50 værdier) blev bestemt ved anvendelse CurveExpert 1.3 software og afbildet i dosisresponskurver. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Western blot-analyse

helcellelysater blev fremstillet ved vask af cellerne med phosphatbufret saltvand (PBS) og udsætte dem for lysis med Laemmli-prøvebuffer suppleret med protease inhibitor cocktail. Efter lysaterne blev sonikeret i 15 sekunder, blev proteinkoncentrationer kvantificeres ved anvendelse af Bio-Rad protein assay kit. Ækvivalente proteiner blev indlæst, separeret med 10% eller 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) gelelektroforese, og derefter overført til nitrocellulosemembraner ved 80 V i 2 timer. Membranerne blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i Tris-buffer indeholdende 0,1% Tween (TBST) og probet med fortyndet primært antistof ved 4 ° C natten over. Membranerne blev derefter vasket tre gange i TBST-puffer og probet med infrarøde farvestofmærkede sekundære antistoffer; De immunreaktive bånd blev visualiseret med anvendelse af Odyssey® Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Cell cyklus og apoptose-assay

Celler blev høstet ved trypsinisering, vasket to gange i kold PBS, fikseret med iskold 70% methanol, og inkuberet ved 4 ° C natten over. Celler blev derefter vasket med PBS og inkuberet med 25 pg /ml propidiumiodid indeholdende 30 ug /ml ribonuklease i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev analyseret på en EPICS Profile II flowcytometer (Coulter Corp., Hialeah, FL) med Multicycle Phoenix Flow Systems program (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Forsøgene blev gentaget mindst tre gange.

Måling af apoptose ved TUNEL (terminal deoxynukleotidyltransferase medieret nick-end mærkning) assay

TUNEL-analysen blev udført efter anvisningerne fra producenten af ​​en kommercielt tilgængeligt kit (deadend ™ fluorometrisk TUNEL System) fra Promega. Apoptotiske celler udviser en stærk nuklear grøn fluorescens, som kunne påvises ved anvendelse af et standard fluorescein filter. Alle celler farvet med DAPI udviser en stærk blå nuklear fluorescens. Objektglassene blev observeret under fluorescensmikroskopi med relative apoptotiske celler bestemt ved tælling TUNEL-positive celler i fem tilfældige felter (ved x 100 forstørrelse) for hver prøve.

Real-time PCR

Total RNA blev isoleret ved anvendelse af Trizol-reagens og revers transkriberet til cDNA. Som tidligere beskrevet, anvendte vi Bim primere [6] i vores undersøgelse. Kvantitativ polymerase-kædereaktion (PCR) blev udført i 25 pi blanding, med 12,5 pi 2 x SYBR Green Supermix, 1 uM af hver forward og reverse primer og 4 til 12 ng template, ved anvendelse af CFX96 realtids-PCR detektion systemet (Bio-Rad). PCR blev udført i en indledende denaturering på 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 39 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer, og human glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en endogen kontrol. Relativ udtryk blev beregnet ved hjælp af 2-δδCt metoden.

siRNA og Bim cDNA transfektion

Celler blev dyrket i 6-brønds plader indtil 70% sammenflydende og transficeret med 200 nmol /l af kontrol uspecifik siRNA, Bim-målrettet siRNA, eller FOXO3a målrettet siRNA ved anvendelse af lipofectamin ™ 2000 i overensstemmelse med producentens anvisninger. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med DMSO (kontrol) eller AZD6244 ved angivne doser og tidspunkter. Cellerne blev derefter opsamlet og bearbejdet til immunoblotting eller propidiumiodidfarvning for cellecyklus-assayet.

I Bim cDNA transfektion blev celler også dyrket i 6-brønds plader i 70% konfluente og transficeret med kontrolvektor eller BimEL ekspressionsvektor, i en koncentration på 4 pg i 250 pi medium, ved anvendelse af Lipofectamine 2000. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne høstet til immunoblotting eller fikseret med 4% formaldehyd for TUNEL-assay.

AKT kinaseaktivitet assay

Cell blev vasket to gange med PBS, underkastes lysis i celle lysis buffer og sonikeret i 15 sekunder. Ekstrakterne blev centrifugeret for at fjerne cellulært debris, og proteinet koncentrationer af supernatanterne blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay reagens. En 200 pi cellelysat prøve blev inkuberet med 20 pi af immobiliseret anti-AKT antistof ved 4 ° C natten over under forsigtig vipning. De resulterende immunopræcipitater blev vasket tre gange med lysepuffer og to gange med AKT kinasepuffer. Kinase assays blev udført i 30 minutter ved 30 ° C under kontinuerlig omrøring i kinasepuffer indeholdende 200 uM ATP og 1 ug af GSK-3-fusionsprotein. Reaktionsprodukter blev adskilt ved 10% SDS-PGAE, efterfulgt af Western blotting med et anti-phospho-GSK-3α /β antistof ifølge producentens anvisninger for ikke-radioaktive AKT kinase assay. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Immunfluorescensfarvning

Celler blev dyrket på CultureSlides (BD Biosciences, CA). Mediet blev aspireret, og cellerne blev vasket tre gange med PBS og derefter fikseret med frisk fremstillet 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter endnu vasketrinnet med PBS blev cellerne permeabiliseret i 20 minutter ved stuetemperatur ved anvendelse af PBS-buffer indeholdende 0,2% Triton X-100 og 0,1% natriumcitrat. Derefter blev cellerne inkuberet i PBS indeholdende 5% fedtfri tørmælk ved stuetemperatur i 1 time. Primært antistof inkubation blev udført med anti-FOXO3a (1:100 fortyndinger) ved 4 ° C natten over. Efter endnu vasketrinnet med PBS blev cellerne inkuberet med det sekundære antistof, FITC-konjugeret anti-kanin-antistof (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Alle antistoffer blev fortyndet i PBS plus 5% fedtfri tørmælk. Objektglassene blev derefter farvet med Prolong antifade opløsning (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 5 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af vask tre gange i PBS. Billeder blev erhvervet af fluorescens mikroskopi med en omvendt Zeiss laser-scanning mikroskop. Individuelle kerner blev skitseret ved hjælp DAPI fluorescens, og det nukleare fluorescens af Cy3 blev kvantificeret ved hjælp af Zeiss KS400 billedanalysesoftware (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Tyskland). Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som middelværdi ± SD og beregnet som middelværdier med 95% konfidensintervaller. Statistisk sammenligning mellem forsøgsgrupper blev udført ved to-vejs ANOVA-test ved hjælp af Microsoft Excel software. Værdier på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

AZD6244 øger Bim udtryk i lungekræft-cellelinjer

Vores tidligere undersøgelse [5 ] viste, at AZD6244 inhiberede proliferation i Calu-6, H2347 og H3122 lungecancer-cellelinjer, men havde ringe virkning på H196, Calu-3, H522, eller HCC2450 cellelinier. Desuden fandt vi, at følgende sub-G

1 cellecyklusstandsning, 20-40% af AZD6244-sensitive celler undergik apoptose, men vi observeret nogen apoptose i AZD6244-resistente celler. I denne undersøgelse anvendte vi disse samme cellelinier yderligere at fastlægge mekanismerne i AZD6244 apoptose

mitokondriske apoptosecyklus vides at spille en kritisk rolle i tyrosinkinaseinhibitoren apoptose [6] -. [ ,,,0],9]. For at vurdere, hvilke Bcl-2 familiemedlemmer kritisk påvirket af AZD6244 behandling, vi bestemt deres protein niveauer i de tre følsomme lunge kræft cellelinier efter behandling med 3 uM AZD6244 koncentrationen nåede i serum fra patienter, der får oral AZD6244. Calu-6 har en mutant KRAS og vildtype BRAF mens H2347 i mutant nationale tilsynsmyndigheder og H3122 [17] har både vildtype KRAS og BRAF. Western blot-analyse viste, at behandling med AZD6244 inducerede hurtige og vedvarende stigninger i niveauet af BimEL og, i mindre grad, af BimL og Bims, i alle følsomme cellelinjer (Fig. 1A). Endvidere behandling med sub-mikromolære koncentrationer (0,03, 0,1, 0,3, 1 og 3 uM) af AZD6244 i 24 timer inducerede markant stigning i niveauet af Bim (fig. 1C). Disse resultater viste, at AZD6244 inducerede dens virkninger på Bim ekspression i en koncentrations- og tidsafhængig måde. Men i disse celler, niveauerne af andre Bcl-2-familiemedlemmer (Bax, Bak, og Bcl-XL) ændredes ikke mærkbart på ethvert koncentration af AZD6244 eller på ethvert tidspunkt (fig. 1A). I modsætning hertil AZD6244 fremprovokere åbenlyse ændringer i Bim ekspression i resistente cellelinier (fig. 1B). De resistente cellelinier er alle vildtype for BRAF og KRAS. Vi har også påvist undertrykkelse af p-ERK-ekspression med AZD6244 i både sensitive og resistente celler (fig. 1A og 1B). Vi undersøgte også udtryk for BH3-only proteiner PUMA og NOXA følgende 3 pM AZD6244 behandling. PUMA og NOXA udtryk blev forøget ved AZD6244 behandling imidlertid niveauerne af stigningen var meget mindre end den observeret med Bim (fig. 1A). Siden opregulering af Bim er langt mere dramatisk end PUMA og NOXA i AZD6244-behandlede celler, vi fokuserede på den rolle, Bim i efterfølgende undersøgelser.

Western blots af Bcl-2 familiemedlemmer efter behandling med AZD6244. (A) human lunge cancercellelinier (Calu-6, H2347 og H3122) blev behandlet med 3 uM AZD6244 til 4, 8, 24, 48 og 72 timer. (B) human lunge cancercellelinier (Calu-3, H196, H522, og HCC2450) blev behandlet med 3 uM AZD6244 for 4, 24 og 72 timer. (C) Calu-6, H2347, H196 og H522-celler blev behandlet med 0,03, 0,1, 0,3, 1 og 3 uM AZD6244 i 24 timer. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

AZD6244-induceret Bim overekspression skyldes både øget transskription og forøget protein stabilitet

For at undersøge mekanismerne i AZD6244-induceret Bim udtryk, vi analyserede niveauerne af Bim mRNA efter behandling med AZD6244. Sensitive og resistente celler blev behandlet med 3 uM AZD6244 i 4 og 24 timer, og cellerne blev høstet for real-time PCR-analyse. MRNA-niveauerne af GAPDH blev anvendt som intern kontrol. Resultatet viste, at behandling med AZD6244 efter normalisering med interne kontroller, førte til en betydelig stigning i mRNA-niveauer af Bim i en tidsafhængig måde i de følsomme Calu-6, H2347, og H3122 celler. AZD6244, ved en koncentration på 3 uM, steg Bim mRNA mellem 2.2- til 2,5 gange efter 4 timer, og 2.9- til 3,8 gange efter 24 timer inkubation i disse tre cellelinier (fig. 2A). Der er signifikant forskel i Bim mRNA-ekspression mellem behandlings- og kontrolgrupper eller mellem 4 timer og 24 timer behandlingsgrupper (

P

0,05 blandt alle parvise sammenligning). I modsætning hertil kunne AZD6244 fremprovokere Bim mRNA-ekspression i de fire resistente cellelinier H196, HCC2450, Calu-3 og H522.

(A) Totalt RNA blev isoleret parallelt. Angivelse af

Bim

blev målt ved real-time PCR, og normaliseret til niveauet af

GAPDH

. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD. *,

P

0,05, sammenlignet med ubehandlede celler. (B) Calu-6, H2347, H3122 og H196-celler blev behandlet med 30 pM MG132 for 2 blev 4, 6 og 8 timer og Western blot analyse med Bim ekspression udføres. (C) Calu-6, H2347, H3122 og H196-celler blev behandlet med DMSO, 3 pM AZD6244, eller 30 uM MG132 i 6 timer, og derefter med 25 ug /ml cycloheximid til blokering proteinsyntese. Western blot-analyse med Bim ekspression blev udført. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Fordi ERK1 /2 signaleringsvej aktivering phosphorylerer Bim og fremmer proteasom-afhængig nedbrydning af Bim [18], testede vi, om Bim protein blev stabiliseret ved AZD6244 behandling. Til dette formål vi først behandlet for følsomme (Calu-6, H2347 og H3122) og resistente (H196) celler med proteosom inhibitor MG132 ved 30 uM for 2, 4, 6 og 8 timer, høstede celler og detekteret Bim ekspression ved Western blot ( fig. 2B). BIM proteinniveauer steg 2 timer efter udsættelse for MG132 og fortsatte med at stige i 6-8 timer. Vi derefter behandlet disse celler med DMSO, 3 pM AZD6244, eller 30 uM MG132 i 4 timer og derefter tilsat 25 ug /ml cycloheximid til blokering proteinsyntese i cellerne. Celler blev derefter høstet over tid og Bim ekspression blev detekteret ved Western blot-analyse (fig. 2C). Vi fandt, at Bim protein nedbrydes hurtigt i celler behandlet med DMSO i alle fire testede cellelinier. I modsætning hertil i celler behandlet med AZD6244 eller MG132 blev Bim proteinniveauer stabiliseret selv efter 6 timers cycloheximid behandling, hvilket indikerer, at nedbrydning af Bim protein blev blokeret ved behandling med AZD6244. Sammen vore resultater indikerer, at den forøgede BimEL ekspression induceret af AZD6244 behandling kan skyldes to mekanismer: en stigning på

Bim

gentransskription og en inhibering af Bim proteinnedbrydning. Som AZD6244 kan inhibere Bim proteinnedbrydning i både følsomme og resistente cellelinier, stigningen i

Bim

gentransskription kan have større betydning ved fremkaldelse AZD6244-induceret apoptose.

Bim er påkrævet for AZD6244- induceret apoptose i lunge kræftceller

for at undersøge, hvilken rolle Bim i AZD6244-induceret celle apoptose, genereret vi specifikke siRNA-konstruktioner for Bim i Calu-6 og H3122 cellelinjer. Som vist i fig. 3A, siRNA knockdown af Bim inhiberede væsentligt ekspressionen af ​​Bim efter behandling med 3 uM AZD6244 i 48 timer. PARP-spaltning og caspase-9-spaltning /aktivering blev inhiberet.

(A) Calu-6 og H3122-celler blev transficeret med Bim-specifik eller kontrollere siRNA og derefter behandlet med 3 uM AZD6244 i 48 timer. Ekspression af Bim, PARP og caspase-9 blev analyseret ved Western blotting. (B) Celler blev dyrket i medium indeholdende forskellige koncentrationer af AZD6244 i 96 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved sulforhodamin B, og relativ cellelevedygtighed blev plottet som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige assays in triplo. (C) Parallelle celler blev fikseret med ethanol og farvet med propidiumiodid; DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri. Tallene angiver procentdele af apoptotiske sub-G

1-fase celler. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD. *,

P

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen siRNA transfekterede celler. (D) Parallelle celler blev også fastsat for TUNEL og DAPI-farvning. Apoptotiske cellekerner i TUNEL-farvning blev mærket med FITC og visualiseret under fluorescensmikroskopi. De relative apoptotiske celler blev bestemt ved tælling TUNEL-positive celler i fem tilfældige felter (ved 100 ganges forstørrelse) for hver prøve.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD. *,

P

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen siRNA transfekterede celler. De repræsentative fotografier af Calu-6 blev vist i det øverste panel og procentdelen af ​​apoptotiske celler af både Calu-6 og H3122 blev viste i det nederste panel. (E) Calu-6 celler blev transficeret med BimEL ekspressionsvektor og kontrolvektoren i 48 timer. Ekspression af Bim blev analyseret ved Western blotting og apoptotiske celler blev påvist med TUNEL analyse.

Vi testede også antiproliferative effekt af AZD6244 om kontrol og Bim siRNA-transficerede celler ved SRB assay og bestemt IC

50 værdier. Vi fandt, at IC

50 til AZD6244 steg fra 0,7 til 76.3 uM i Calu-6 celler og fra 1.4 til 89.3 uM i H3122-celler (fig. 3B). Kontrollen og Bim siRNA-transficerede celler blev behandlet med 3 uM AZD6244 i 72 timer, og cellerne blev høstet til cellecyklus-analyse. Resultaterne viste, at efter behandling med AZD6244, procentdelen af ​​apoptotiske (sub-G

1) -celler faldt fra 38,6% til 8,4% i Bim siRNA-transficerede Calu-6 celler og fra 29,8% til 7,5% i Bim siRNA-transficerede H3122-celler (fig. 3C). TUNEL-assayet også indikeret Bim siRNA transfektion inhiberede AZD6244-induceret apoptose, fra 56,6% til 12,1% i Calu-6 og fra 65,3% til 18,5% i H3122-celler (fig. 3D).

Vi yderligere testet hvorvidt forøget Bim udtryk er tilstrækkelig til at fremkalde apoptose. Et plasmid kodende for fuld-længde BimEL blev transient transficeret til Calu-6 og apoptose af de transficerede celler blev bestemt ved TUNEL-assay. Vi fandt, at næsten alle celler transficeret med kontrol vektor er TUNEL-negativ efter 48 timer, hvorimod, BimEL udtryk vektor transfekterede celler viste signifikant forøget TUNEL-positive apoptose (fig. 3E).

rolle FOXO3a i AZD6244 -induceret Bim ekspression

Det er blevet rapporteret, at aktivering af FOXO transkriptionsfaktorer inducerer Bim mRNA-ekspression og fremmer celle apoptose i en Bim-afhængig måde [19], [20]. FOXO transkriptionsfaktorer fosforyleres af AKT på tre højt konserverede sites, Thr32, Ser253 og Ser315, hvilket fører til cytoplasmatisk fastholdelse og nedskrivning af FOXO nukleare transkriptionsaktivitet. ERK har også vist sig at phosphorylere FOXO3a og øge dens nukleare eksport. I vores tidligere undersøgelse [5], fandt vi, at p-AKT udtryk var meget højere i resistente celler end i sensitive celler. Som forventet, endogene niveauer af p-Thr32-FOXO3a og p-Ser253-FOXO3a var højere i resistente celler end i følsomme celler (Fig. 4A). Konsekvente forskelle blev set mellem de to grupper for samlede FOXO3a.

(A) Endogen ekspression af p-Thr32-FOXO3a, p-Ser253-FOXO3a, og total FOXO3a blev påvist i 8 cellelinier. (B) subcellulære lokalisering af FOXO3a i Calu-6 og H522-celler blev påvist med immunfluorescensfarvning efter AZD6244 behandling. (C) Calu-6-celler blev enten mock-transficeret eller transficeret med en FOXO3a-specifik lille interfererende RNA (siRNA) og derefter behandlet med 3 uM AZD6244 i 4 timer. Ekspression af FOXO3a, Bim, PARP og caspase-9 blev analyseret ved Western blotting. (D) Sideløbende blev Calu-6 celler fikseret med ethanol og farvet med propidiumiodid; DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri. Tallene angiver procentdele af apoptotiske sub-G

1-fase celler. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Kolonner

, middelværdi;

bar

, SD. *,

P

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen siRNA transfekterede celler. (E) TUNEL assays blev udført som beskrevet i fig. 3D. De repræsentative fotografier af Calu-6 er vist.

Transkriptionel aktivering af FOXO3a er stærkt påvirket af sin subcellulære lokalisering i en proces stramt reguleret af AKT og ERK. Vi undersøgte, om AZD6244 behandling forårsagede FOXO3a at flytte til kernen, hvor den aktiveres. Immunofluorescens-farvning viste, at i følsomme Calu-6-celler, behandling med 3 uM AZD6244 inducerede betydelig subcellulære lokalisering af FOXO3a fra cytoplasmaet til kernen. Men i resistente H522 celler, vi har registreret ingen tydelige ændringer i subcellulære lokalisering af FOXO3a efter AZD6244 behandling. Desuden har vi bemærket, at i ubehandlede Calu-6 celler, FOXO3a boet i både cytoplasmaet og kernen; i ubehandlede H522 celler, det meste af FOXO3a bopæl i cytoplasmaet, og nuklear farvning var relativt ubetydelig (fig. 4B). Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der registreres på Western blotting af p-FOXO3a udtryk (fig. 4A).

For at undersøge, hvilken rolle FOXO3a i AZD6244-induceret Bim, vi evaluerede effekten af ​​specifikke siRNA-konstruktioner for FOXO3a i Calu-6 og H3122-celler. Som vist i fig. 4C, siRNA knockdown af FOXO3a inhiberede ekspressionen af ​​FOXO3a, hvilket resulterede i stærk suppression af AZD6244-induceret Bim, PARP-spaltning og caspase-9-spaltning /aktivering efter behandling i 24 timer. Analyse af apoptose efter FOXO3a siRNA transfektion i følsomme celler efter AZD6244 behandling viste procentdelen af ​​sub-G

1 apoptotiske celler faldt fra 32,5% til 10,9% efter behandling med AZD6244 i 72 timer (Fig. 4D). Den TUNEL-analysen viste også, at FOXO3a siRNA transfektion signifikant hæmmede AZD6244-induceret apoptose fra 56,7% til 18,4% i Calu-6 (

P

. 0,05, figur 4E). Vores resultater antydede, at FOXO3a aktivering kræves for AZD6244-induceret Bim ekspression.

caAKT transfektion opregulerer ekspressionen af ​​p-FOXO3a hæmmede AZD6244 apoptose

Vores tidligere undersøgelse viste, at høj Som vist i fig.