PLoS ONE: HPV Genotypebestemmelse og Site of Viral Integration i livmoderhalskræft i Indian Women

Abstrakt

Vedvarende HPV-infektion spiller en stor rolle i livmoderhalskræft. Denne undersøgelse blev foretaget for at identificere HPV-typer i en kohorte af indiske kvinder med lokalt fremskreden livmoderhalskræft samt at bestemme den fysiske tilstand og /eller stedet for viral integration i værtsgenomet. Forbehandling biopsier (n = 270) fra patienter blev screenet for HPV-infektion af en high throughput HPV-genotypebestemmelse assay baseret på Luminex xMAP teknologi samt MY09 /11 PCR og SPF1 /2 PCR. Samlet HPV positivitet blev observeret at være 95%, med HPV16 er mest almindelige (63%) efterfulgt af infektion med HPV18. status Integration af virus blev identificeret ved hjælp Forstærkning af Papillomavirus Oncogene Afskrifter (APOT) assay i en delmængde af prøver positive for HPV 16 og /eller HPV 18 (n = 86), og med en passende opfølgning. Dataene blev korreleret med kliniske resultat af patienterne. Integration af det virale genom blev observeret i 79% af tilfældene og en præference for integration i den kromosomale loci 1p, 3q, 6Q, 11q, 13q og 20q blev set. Kliniske data viste, at den fysiske tilstand af virus (integreret eller episomalt) kunne være et vigtigt prognostisk markør for livmoderhalskræft

Henvisning:. Das P, Thomas A, Mahantshetty U, Shrivastava SK, Deodhar K, Mulherkar R (2012) HPV Genotypning og site of Viral Integration i livmoderhalskræft i indiske kvinder. PLoS ONE 7 (7): e41012. doi: 10,1371 /journal.pone.0041012

Redaktør: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: Februar 17, 2012; Accepteret: 15 juni 2012; Udgivet: den 16. juli, 2012 |

Copyright: © 2012 Das et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne ønsker at udtrykke deres taknemmelighed for den finansielle støtte fra Kvinders Cancer Initiative IRG # 634. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den tredje mest almindelige kræftform blandt kvinder i hele verden, og den mest almindelige kræftform findes i indiske kvinder. HPV-infektion er blevet vist at spille en kritisk, men ikke tilstrækkelig, rolle i ætiologien af ​​livmoderhalskræft. Indtil dato er blevet rapporteret mere end 200 HPV-typer, hvoraf HPV16 er mest almindelige, efterfulgt generelt ved HPV18, HPV45, HPV31 og HPV33 [1], [2]. Det meste af den høje risiko HPV (HR-HPV) infektioner (90%) relatere spontant og kun i omkring 10% tilfælde infektionen fortsætter og udvikler sig til high-grade cervikal intraepitelialneoplasi. Det sker generelt gennem integration af HPV-genomet i værtskromosomet med tilhørende tab eller afbrydelse af E2 [3]. Ifølge de foreliggende rapporter, viral E2-genet har evnen til at undertrykke virale E6 og E7 oncogener i celler indeholdende integreret HPV-DNA [4]. Derfor integration af virus med tab af transkriptionel kontrol af E2 resulterer i overekspression af E6 og E7, der fører til immortalisering og transformation af celler [5]. I de fleste af de sager integration af HR-HPV genomet giver anledning til fusion udskrifter bestående af virale onkogener E6, E7 og tilstødende cellulære sekvenser [6], [7], [8], [9]. In vitro studier har vist, at den virale-cellulære fusionstranskripter er mere stabile og bibringe cellerne med en selektiv vækstfordel i forhold til de episomale modstykker [10], [11].

Undersøgelser rapporterer, at integrationen begivenhed er tilfældig involverer næsten alle kromosomer, og derfor flere virus-vært integration sites er blevet kortlagt indtil dato [12]. Men der er visse hotspots fx skrøbelige steder, translokation break point og transkriptionelt aktive regioner [3], [13], [14], [15], som er foretrukket af virussen for dens integration i det humane genom. På integration i eller i nærheden af ​​et gen, kan virussen medføre en ændring i sit udtryk, som i sidste ende kan føre til ændringer i cellulær vækst og proliferation. Desuden kan viral integration bringe både virale kodende gener samt de cellulære gener modtagelige for epigenetiske ændringer, der kunne regulere deres ekspression. Derfor er integrationen af ​​HPV i det humane genom betragtes som en vigtig begivenhed i cervical carcinogenese.

Formålet med denne undersøgelse var HPV genotypebestemmelse og identifikation af stedet for integration af to HR-HPV-typer (16 og 18) sammen med evalueringen af ​​den prognostiske værdi af integration site, i lokalt fremskredne livmoderhalskræft i indiske kvinder.

Materialer og metoder

kliniske prøver

Forbehandling cervikal tumor biopsier, overvejende fra FIGO stadie IIIB, blev opnået fra patienter (median alder, 50 år, aldersgruppe, 33-80 år), der gennemgår strålebehandling alene eller samtidig kemo-strålebehandling ved Radiation Oncology Department, Tata Memorial Hospital, Mumbai, efter at have indhentet IRB godkendelse. Et generisk samtykke til grundforskning blev opnået forud for opnåelse af biopsier. Men for den aktuelle undersøgelse blev opnået et samtykke dispensation fra Hospital etiske komité. De biopsier blev opnået fra histologisk påvist, primær cervikal tumor, før starten af ​​radikal strålebehandling og blev kodet for de-identifikation ved før testning lægen. Prøverne blev opsamlet i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Alle prøverne blev tildelt et laboratorium kode for at bevare fortroligheden.

Behandling af tumor prøver

Frosne væv blev cryocut til ekstraktion af DNA og RNA. Til DNA-ekstraktion blev fem 30 um snit opsamlet i STE-buffer (0,1 M NaCl, 0,05 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 1% SDS) indeholdende 10 mg /ml proteinase K (USB, Cleveland, OH, USA). DNA blev isoleret ved standard phenol-chloroform-metoden. Til isolering af total RNA blev RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) anvendes. Ti 30 um snit blev opsamlet i RLT buffer indeholdende guanidinthiocyanat tilvejebragt i kittet og behandles efter fabrikantens anvisninger. DNAse behandling af RNA-prøver blev udført ved anvendelse DNA free kit (Ambion, Austin, TX, US).

HPV-genotypebestemmelse ved højt gennemløb luminex matrix

Genotypebestemmelse af 24 HPV-typer, som omfattede 15 højrisiko typer (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73, og 82), 3 formodede højrisiko-typer (26, 53 og 66 ), og 6 lavrisiko-typer (6, 11, 42, 43, 44 og 70) [1], [2] blev udført under anvendelse multiplex HPV-genotypebestemmelse array (Multimetrix GmbH, Heidelberg, Tyskland) baseret på Luminex xMAP-teknologi . I henhold til fabrikantens anvisninger, blev PCR udført ved anvendelse af sæt af biotinylerede bredspektrede primere i et totalt volumen på 50 pi indeholdende 3,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP’er, 0,75 enhed Taq-DNA-polymerase og 1 pi primerblanding. De amplifikationstrin omfattede en initial DNA denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler denaturering i 20 s ved 94 ° C, annealing i 30 sek ved 38 ° C og ekstension i 1 min 20 s ved 71 ° C , før en endelig forlængelse i 4 minutter ved 71 ° C. PCR-positive prøver blev derefter underkastet Luminex løb. Ti mikroliter af PCR-produktet blev blandet med Luminex perleblanding indeholdende distinkte perle populationer koblet til 24 HPV-typer. Efter termisk denaturering blev målsekvenserne hybridiseret til perle-bundne prober. De hybridiserede PCR-produkter blev mærket ved binding til R-phycoerythrin konjugeret streptavidin. Udlæsningen opnåedes i Luminex Bioanalyzer (Luminex Corporation, Austin, TX, USA). HPV-typer blev skelnes ifølge den unikke perle signatur, mens tilstedeværelsen af ​​PCR-produkter blev bestemt ved phycoerythrin fluorescens. En analytisk sensitivitet cut-off blev beregnet på grundlag af den negative kontrol, som blev fratrukket hver af de udlæsning.

HPV genotypning ved PCR ved hjælp af MY09 /11 og SPF1 /2 primere

Siden mængden af ​​DNA til rådighed for undersøgelsen var begrænsende, β-actin PCR blev udført kun i de prøver, som ikke viste amplifikation ved GP5

+ /6

+ primere (n = 92). Disse blev yderligere screenet for HPV ved PCR under anvendelse MY09 /11 L1-primere (tabel S1) og SPF1 /2 primere [16]. PCR blev udført i et reaktionsvolumen på 25 pi indeholdende 1,5 mM MgCl

2, 10 pM af hver primer, 200 pM dNTP’er og 0,75 enhed Taq-DNA-polymerase. De prøver, som blev testet positive for HPV enten ved MY09 /11 eller SPF1 /2 eller begge blev yderligere genotypebestemt for de to mest almindelige HR-HPV typer-HPV16 og 18 ved hjælp af HPV16 /18 specifikke primere (Tabel S1). Da mængden af ​​DNA blev begrænsende, SPF 1/2 PCR kunne ikke gennemføres i fire af de 92 prøver.

Foreningen af ​​HPV16, HPV18 og HPV16 /18-infektion med kliniske resultat

genotypebestemmelse data for de to HR-HPV-typer, HPV 16, HPV 18 og HPV 16/18 sammen, hvor var foreligger tilstrækkelige opfølgende data blev sammenlignet med det kliniske resultat af patienterne. Kaplan-Meier-analyse (SPSS 15.0) blev udført for at bestemme sammenhængen mellem infektion med disse HR-HPV-typer og fornyet sygdom. Sygdomsfri overlevelse blev betragtet fra start af strålebehandling til det tidspunkt, hvor tilbagefald fandt sted, eller indtil sidste opfølgning. Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af log-rank test (SPSS 15,0).

Identifikation af integration websted ved APOT assay

Prøver (n = 86) positive for HPV 16, HPV 18 eller begge, og med en fyldestgørende klinisk opfølgning (minimum 1 års eller indtil forekomsten af ​​første begivenhed, alt efter hvad var tidligere) blev taget til at studere viral integration ved hjælp Forstærkning af papillomavirus Oncogene Afskrifter (APOT) assay, som beskrevet af Klaes

et al

[6 ]. Kort fortalt, total RNA (0,5-1 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af oligo (dT) 17-primer koblet til en linkersekvens [(dT) 17-p3] [17] og 50 enheder af Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 1 time ved 42 ° C. PCR med p-actin-primere blev udført for at kontrollere integriteten af ​​cDNA’et. Første streng cDNA blev amplificeret under anvendelse af HPV E7-specifik primer (P1-16 specifik for HPV16 og p1-18 specifik for HPV 18) som fremadrettede primere og linker p3 som den reverse primer (tabel S1). PCR-amplifikation blev udført i et reaktionsvolumen på 50 pi indeholdende 2,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP’er, 25 pM af hver primer og 1 enhed Taq-DNA-polymerase. Reaktionen består af en indledende denatureringstrin ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 35 cykler af denaturering ved 94 ° C i 30 s, annealing ved 58 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 4 min. Dette blev efterfulgt af en endelig ekstension ved 72 ° C i 20 min. Dernæst blev 7 pi af PCR-produktet anvendt som template til nested PCR under anvendelse af fremadrettede primere p2-16 specifikke for HPV16 eller p2-18 specifikt for HPV18 og (dT) 17-p3 som revers primer (tabel S1). PCR-betingelserne var samme som den for første PCR, bortset fra at annealing temperaturen var 66 ° C.

Kloning af fusionstranskripter andre

Amplikoner end de store episomale transkripter (~1050 bp for HPV16 og ~1000 bp for HPV 18), blev mistænkt for at være afledt af de integrerede HPV genomer. Disse blev udskåret fra gelen og DNA isoleret ved anvendelse GFX PCR DNA og Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Det isolerede DNA blev enten sekventeret direkte eller efter kloning i pTZ57R /T-vektor ved anvendelse af INSTA PCR Cloning Kit (Fermentas, Litauen, EU), på DNA sequencer (3100 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De kromosomale integration loci blev bestemt ved hjælp af Nationalt Center for Biotechnology Information (BLAST) og University of California, Santa Cruz (UCSC) hg19 (feb 2009) (BLAT) humane genom forsamlinger. Endvidere blev integration sites kontrolleret for tilstedeværelse af skrøbelige steder og eventuelle gener med kendt identitet ved hjælp af NCBI skrøbelige oversigtskort seeren og UCSC Blat værktøjet hhv.

Foreningen af ​​viral integration med kliniske resultater

de opnåede data blev sammenlignet med det kliniske resultat af patienterne. Kaplan-Meier analyse (SPSS 15,0) blev gjort for at bestemme sammenslutning af den virale tilstand (episomale /integreret) med recidiv af sygdommen. Sygdomsfri overlevelse blev betragtet fra start af strålebehandling til det tidspunkt, hvor tilbagefald fandt sted, eller indtil sidste opfølgning (median follow-up for 86 tilfælde var 44 måneder). Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af log-rank test (SPSS 15,0).

Resultater

HPV genotypning af high throughput Luminex vifte

Selvom der er et par rapporter om forskellige høj risiko HPV’er i indiske kvinder, her rapporterer vi 15 høj risiko HPV’er, 3 mellemliggende risiko og 6 lave risiko HPV-typer ved hjælp af high throughput Luminex array. Primerne leveres i Luminex vifte kit til HPV genotypning blev biotinyleret, bred vifte GP5

+ /GP6

+ primere. Brug af denne primer sæt til PCR, vi opnåede 178 ud af 270 prøver var positive for HPV (figur 1). HPV-positive prøver blev yderligere underkastet hybridisering til perle-bundne prober ved luminex array som beskrevet tidligere. Et hundrede niogtres prøver blev fundet at hybridisere til de forskellige HPV-prober mens 9 prøver var negative. Disse 9 prøver kunne have HPV-infektion ikke er inkluderet i de 24 typer opdaget af sættet. Ud af 169 HPV positive prøver, 168 prøver var positive for en eller flere HR-HPV-typer indikerer en høj sammenslutning af livmoderhalskræft med HR-HPV-infektion. Blandt disse, HPV 16 og /eller HPV 18 infektion var mest almindelige – 114 prøver at være positiv for HPV16 alene, 6 prøver til HPV18 alene og 16 prøver til både HPV 16 og HPV 18 (figur 2)

Genotypning blev udført på. 270 avancerede stadie livmoderhalskræft prøver ved high-throughput, GP5

+ /6

+ primere baseret Luminex-array; konsensus MY09 /11 og SPF1 /2-primere. HPV positivitet var 95% (257/270). APOT assay blev udført på 86 HPV16

+ og /eller HPV18

+ prøver, med god klinisk opfølgning og god kvalitet RNA. I 18 prøver blev kun episomal form for HPV identificeret, hvile 68 antydede retning mulig integration. Site of integration kan forudsiges med høj score ved BLAST og /eller BLAT i 48 prøver.

Grafen viser hyppigheden af ​​24 HPV-typer i 178 livmoderhalskræft biopsi prøver som viste sig at være positiv GP5

+ /6

+ primere. HPV16 infektion dominerede i prøverne. Hver søjle repræsenterer forskellige HPV-typer.

HPV genotypning ved PCR ved hjælp af MY09 /11 og SPF1 /2 primere

For at estimere den sande HPV positivitet i de 270 tilfælde 92 cervicalcancerbiopsier negative for HPV ved Luminex array, blev først underkastet PCR under anvendelse p-actin-primere for at kontrollere kvaliteten af ​​DNA. Alle viste sig at være positive for β-actin. Næste blev de underkastet PCR under anvendelse MY09 /11 og SPF1 /2-primere. Tyve fem ud af 92 prøver blev fundet at være positive for HPV ved MY09 /11 PCR. Da mængden af ​​DNA blev begrænsende, kunne SPF 1/2 PCR ikke udføres i 4 af de 92 prøver. Screening med SPF1 /2 primere afsløret 79 prøver at være HPV positive. Disse 79 prøver indeholdt også de 25 prøver, som testede HPV positive ved MY09 /11 PCR. HPV positivitet blev derfor beregnet under hensyntagen til resultaterne fra Luminex array og SPF1 /2 PCR. Den overordnede HPV positivitet i denne kohorte blev fundet at være 95% (257/270). Yderligere genotype af de 79 prøver, ved hjælp af HPV 16/18 specifikke primere, viste 49 prøver at være positiv for HPV 16. Ingen af ​​disse 79 prøver var positive for HPV18. Derfor forekomsten af ​​HPV 16 og /eller HPV18 i denne kohorte var 69% (185/270) (figur 1).

Foreningen af ​​HPV 16, 18 og dobbelt infektion med kliniske resultat

Kaplan -Meier overlevelsesanalyse data for 125 patienter med HPV-type16, 18 og dobbelt infektion og med tilstrækkelig klinisk opfølgning (median follow-up for 125 sager var 54 måneder), viste, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem infektion med disse to HR- HPV-typer i form af udfald sygdom (Figur S1).

Fysisk tilstand af virus og klinisk resultat

Ud af 125 HPV 16, HPV18 eller dual HPV positive prøver, en sub-sæt af 86 prøver med god kvalitet RNA, blev taget for at studere den fysiske tilstand og /eller sted for viral integration ved APOT assay. I de fleste tilfælde blev det virale genom vist sig at være integreret (n = 68), mens der i 21% (n = 18) kun episomale transkripter kunne identificeres. I 12 tilfælde med integreret viralt genom, blev episomal form af HPV også detekteret (figur 1). Den fysiske tilstand af virus (episomale /integreret) var forbundet med resultatet sygdom. Overlevelsesdata viste, at 16 ud af 18 patienter med kun episomal form af HPV (16 og /eller 18), havde sygdomsfri overlevelse sammenlignet med dem med integreret form af viruset, hvilket indikerer en god klinisk resultat (p = 0,067, hvilket er en borderline signifikans) (Figur 3). Det kliniske resultat af alle de patienter, hvor den virale integration er undersøgt, er vist i tabel S2.

Kaplan-Meier overlevelseskurve for patienter med episomal form for virus (n = 18) versus integreret form (n = 68 ) er afbildet. De fleste patienter med episomal formular (16 ud af 18) havde en sygdomsfri overlevelse sammenlignet med patienter med integreret form, hvilket indikerer en god klinisk resultat, selv med et grænsetilfælde signifikans (p = 0,067).

Identifikation af viral integrationssted

for at forstå, hvorvidt integration begivenhed er tilfældigt eller der er en vis præference for bestemte sites inden kromosomerne, sekventering data for 68 tilfælde afledt af APOT assay blev undersøgt ved blast og /eller Blat. Stedet for integration kan forudsiges med en høj score i 48 tilfælde (tabel S3A), for de resterende 20 tilfælde scoren var lav (tabel S3B). Kun de tilfælde, hvor integrationen site blev forudsagt med høj score (n = 48) blev analyseret yderligere for forskellige træk forbundet med det samme. Stederne for integration fandtes at være fordelt over genomet. Imidlertid integration var hyppigere ved det kromosomale loci 1p (n = 7), 3q (n = 8), 13q (n = 4), 6Q (n = 4), 11q (n = 4) og 20Q (n = 4 ) (figur 4). Kun en prøve viste HPV integration på to kromosomale loci samtidigt. Nogle af de tilbagevendende integrationssteder blev også kontrolleret ved genomisk niveau ved udførelse af genomisk DNA PCR med HPV E7-primere som forward primer og primere specifikke for en given kromosomal region som den omvendte on (figur S2).

site of integration som bestemt ved APOT assay i 48 tilfælde er positive for HPV 16, HPV 18 eller begge og med høj forudsigelse scor med BLAST /BLAT. Integrationshændelse viste sig at være mere almindelig i 1p og 3q kromosomale loci. Hver søjle repræsenterer forskellige kromosomale locus.

Features forbundet med HPV integration

Brug NCBI Fragile rejsewebsted Kort Viewer det blev observeret, at 60% af integrationer (29/48) var placeret i eller tæt på en fælles eller sjældne skrøbelig site. Resten af ​​integration steder var ikke associeret med nogen skrøbelige steder (tabel 1). blev observeret ved anvendelse af UCSC Blat værktøjet 58% af sekvenserne (28/48) at være enten inden for eller i nærheden proteinkodende gener. Disse gener tilhørte forskellige kategorier lige fra onkogener, transkriptionsfaktorer, og tumorsuppressorgener (tabel 1).

Diskussion

Det er bevist tvivl om, at infektion med HPV spiller en stor rolle i ætiologien af ​​livmoderhalskræft. Rapporter fra forskellige dele af subkontinentet indikerer en prævalens af HPV i området fra 73-99% [18] – [30]. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi 95% HPV positivitet anvendelse af tre forskellige primersæt. Det fremgår af denne undersøgelse, at et enkelt sæt primere ikke er tilstrækkeligt til at anslå den sande HPV infektivitet. Af de forskellige HPV-genotyper HPV16 var mest almindelige (60%), efterfulgt af infektion med HPV18 alene (2%). Dual infektion med HPV16 /18 (6%) og HPV16 /45 (3%) blev også observeret. Disse resultater er i konkordans med andre undersøgelser fra det indiske subkontinent, der rapporterer 57-65% HPV16 positivitet, efterfulgt af HPV 18, 45, og 33 i cervikal neoplasi [19], [20], [29].

integration af virus er almindelig i sene stadier livmoderhalskræft og betragtes som en vigtig begivenhed i udviklingen af ​​sygdommen. Integration generelt sker nedstrøms for tidlige gener E6 og E7, ofte i E1 eller E2-regionen. E2-genet er transkriptionelt inaktiveret, når virussen bliver integreret følge af forstyrrelserne i sin åbne læseramme. Viral E2-genet er blevet grundigt undersøgt og vides at spille en rolle i virusreplikation samt negativ regulering af E6 og E7 gener [31].

Forskellige teknikker er blevet anvendt til at undersøge integration af virus, såsom som Ligering-medieret PCR [32], restriktionssted-PCR [15] og APOT assay [6]. For at begrænse vores undersøgelse til integration websteder med et transkriptionelt aktiv viralt genom blev APOT assay valgt. Også APOT analysen muliggør detektion af integrerede virale genom i kliniske læsioner selv i nærværelse af et stort overskud af ikke-integreret episomal form af virusgenomer [6], [33]. Hyppigheden af ​​viral integration i værtsgenomet i cervikale carcinomer er blevet rapporteret at være så høj som 100% i HPV18

+ tumorer [34] og op til 80% i HPV16

+ tumorer [35]. I vores undersøgelse fandt vi fire HPV18

+ prøver, hvor virussen blev integreret og én HPV18

+ prøve, hvor virussen var episomale. Forekomsten af ​​integrationen i HPV 16

+ prøver var højere. Mekanismen af ​​HR-HPV integration er ikke fuldt forstået. Det spekuleres, at integration kan udgøre en tilfældighed, at sandsynligheden for hvilket øger med frekvensen af ​​dobbelt-strenget pauser (DSBs) i værten og virus-DNA. Kromosomale skrøbelige steder kunne repræsentere hotspots for HR-HPV integration.

Den fysiske tilstand og /eller stedet for integration blev undersøgt i 86 cervikale tumorprøver inficeret med en eller begge af to HR-HPV, HPV 16 og HPV 18, og med en passende klinisk opfølgning. Episomal form af HPV blev observeret i 18 tilfælde. Tilstedeværelse af kun episomal form, hos disse patienter med fremskreden sygdom etape (overvejende FIGO stadie IIIB), kunne tyde på, at enten HPV integration ikke alene ansvarlig for udviklingen af ​​sygdommen; eller det kunne være en begrænsning af den teknik resulterer i svigt af amplifikation af integrant afledt transkript. Nylige undersøgelser har bekræftet forekomst af kun episomal form for virus i avancerede cervikale planocellulært karcinom [33], [36]. Eftersom APOT arbejder på grundlag af annealing af Frohman primeren til polyA halen, i hvilke tilfælde polyA hale er placeret i en stor afstand fra den fremadrettede primer, måske ikke være egnede til amplifikation ved PCR.

i den foreliggende undersøgelse, observerede vi 12 prøver, hvor både integrerede og episomale former af viruset var til stede. I sådanne tilfælde kan E2 være tilgængelige i

trans

at modulere ekspressionsniveauerne af onkogen E6 og E7 [37]. Også ifølge rapporten fra Pett

et al

., Tab af episomer er lige så meget vigtig som integration af virus i værtsgenomet for progression af læsioner til livmoderhalskræft neoplasi [38]. Det ville være interessant at se udtryk for E2 og E6 /E7 i tilfælde, hvor HR-HPV er til stede i episomalt samt integreret form eller i prøver, hvor HPV er kun episomalt.

Der er rapporter om, at HR- andre end E6 /E7 HPV proteiner fremkalde kromosomal ustabilitet og transformation [39]. Det forlyder, at E2 stabiliserer Skp2, et onkogen og dette kunne føre til aktivering af S-fasen post [39]. Hamid et. al., [40] har også foreslået en rolle for E2 i celleproliferation. Da celler i S-fase er mere lydhøre over for stråling, kan kræft med episomal E2 være mere lydhøre over for strålebehandling. Sammenligning af den fysiske tilstand af den virus (episomale /integreret) med det kliniske resultat efter radikal strålebehandling viste, at patienter med episomal form af virussen var steget sygdomsfri overlevelse sammenlignet med dem med integreret form. Denne observation understøttes af forskellige rapporter, der angiver, at integrationen begivenheden er forbundet med en reduceret sygdomsfri overlevelse [41], [42]. Men der er kontrasterende rapporter så godt, hvorefter fysiske tilstand virus ikke korrelerer med sygdomsfri overlevelse [43], [44]. Dette skal undersøges nærmere.

Selvom integration websteder blev fordelt over hele genomet i forskellige prøver, der var en præference for visse kromosomale loci såsom 1p, 3q, 6Q, 11q, 13q, 6Q og 20Q. Visse specifikke områder i nogle af disse loci såsom 1p36.23, 1p36.33, 3q26, 3q28 og 20q11.21 viste gentagne integrationer, hvilket indikerer, at integration er muligvis ikke en tilfældig begivenhed. Rapporter fra undersøgelser med vestlige befolkningsgrupper viser, at integration af virus opstår oftest ved 8Q kromosomale locus [3], [45], [46]. Integration på 8Q locus i vores undersøgelse blev observeret i kun 1 ud af 48 tilfælde. Dette kan skyldes forskellen i etnicitet af de to populationer.

3q, 13q og 20q loci ud over at være præferentiel mål for HPV integration er blevet rapporteret at være steder for genomisk ustabilitet associeret med livmoderhalskræft. Gain af 3q og 20Q, mens tab af 13q er blevet rapporteret i forskellige stadier af sygdommen [47] – [49]. Også nyere rapporter viser, at der eksisterer en signifikant sammenhæng mellem genomisk omlægning og HPV integration [46]. Det ville derfor være interessant at undersøge, om den foretrukne integration af virus ind i disse loci har en rolle at spille i at fremkalde genomisk ustabilitet.

De fleste af de integrationer (28/48) blev fundet at være placeret i eller i nærheden af visse gener. Dette kunne tyde på, at virussen foretrækker transkriptionelt aktive regioner for integrationen begivenheden. Sådanne gener inkluderet onkogener såsom myc, transkriptionsfaktorer som TP63, Mecom, etc. Denne observation understøttes af tidligere rapport fra Wentzensen

et al

hvor de har vist inddragelse af tumor gener (myc og TP63) i HPV integrationsprocessen [50]. Undersøgelser i vores laboratorium har vist, at nogle af de gener, inden for hvilke integration blev observeret, såsom ABCB10, SLC25A36, IL8, COX4I2, HNF1B, myc, demonstrerede forøget ekspression (upublicerede data), hvilket indikerer, at ved integration i eller nær et bestemt gen virus kan medføre ændringer i genekspression

Integration af virussen i nærheden af ​​eller i skrøbelige steder er ofte blevet rapporteret [15], [45], [50] -. [52]. Skrøbelige steder er specifikke regioner i kromosomerne, der nonrandomly gennemgår pause som reaktion på visse stress. Dette gør gener i eller i nærheden af ​​disse steder er modtagelige for fremmed DNA integration. I vores undersøgelse 29/48 integrationer var placeret inden for eller i nærheden af ​​en almindelig eller sjælden skrøbelig sted, som er i konkordans med tidligere rapporter. En anden observation af vores undersøgelse var, at patienter med viral integration på kromosomale loci 3q, 13q og 20q viste den værste prognose blandt alle. Hvorvidt dette kan have nogen klinisk implikation i prognosen for livmoderhalskræft ville være interessant og udfordrende at studere.

Støtte Information

Figur S1.

Kaplan-Meier analyse for to HR-HPV-typer – HPV16 og /eller HPV18 og udfald sygdom. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for HPV16 og /eller HPV18 i 125 patienter, som havde en god klinisk opfølgning blev udført. Patienter med HPV16 infektion alene viste en tendens mod bedre sygdomsfri overlevelse sammenlignet med HPV18 infektion alene og dobbelt infektion med HPV 16/18

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s001

(TIF)

Figur S2.

Genomisk DNA PCR af de tilbagevendende integration sites. Repræsentative gelbilleder (a, b) viser HPV integration på det genomiske niveau. Tilbagevendende integrationer på kromosomal loci 1p36.23, 3q28, 6q23.3, 8p11.21 og 11q13.1 er afbildet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s002

(TIF)

tabel S1 .

Primersekvenser.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s003

(DOCX)

tabel S2.

klinisk-patologisk data for alle tilfælde, hvor den virale integration blev undersøgt.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s004

(DOCX)

tabel S3.

Sekvens af HPV integration steder i genomet i 68 tilfælde. a) Integration websteder for 48 tilfælde med en høj forudsigelse score. b) steder Integration i 20 sager med en lav forudsigelse score

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s005

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne ønsker at anerkende afdøde Dr. KA Dinshaw og alle personer fra Gynækologi Disease Management Group, Tata Memorial Hospital, som var involveret i velovervejet kompilere den kliniske historie og opsamling og lagring af biopsier fra livmoderhalsen kræftpatienter. Hjælp fra Ms Sadhana Kannan (ACTREC) i statistisk analyse og Ms. Tabish Hussain (ACTREC) for hendes værdifulde input i udarbejdelsen af ​​manuskriptet er taknemmeligt anerkendt.