PLoS ONE: Silencing af hTERT Gene af shRNA Hæmmer Colon Cancer SW480 Cell Growth in vitro og in Vivo

Abstrakt

Menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) er nøglen enzym ansvarlig for syntese og vedligeholdelse af telomerer på enderne af kromosomer, og det er vigtigt for celleproliferation. Dette har gjort hTERT fokus på onkologi forskning og et attraktivt mål for udvikling anticancer lægemiddel. I denne undersøgelse har vi designet en lille interfererende RNA (siRNA) målretning den katalytiske subunit af hTERT og testet dens virkninger på væksten af ​​telomerase-positive humane coloncarcinom SW480-celler in vitro, såvel som på tumorigeniciteten af ​​disse celler i nøgne mus . Forbigående og stabil transfektion af hTERT siRNA i kolon kræft SW480 celler undertrykt hTERT udtryk, reduceret telomerase aktivitet og hæmmede cellevækst og proliferation. Vælte hTERT udtryk i SW480 tumorer xenotransplanteret i nøgne mus bremset betydeligt tumorvækst og fremmet tumorceller apoptose. Vores resultater tyder på, at hTERT er involveret i carcinogenese af menneskelig coloncarcinom, og de fremhæver det terapeutiske potentiale af en hTERT knock-down tilgang

Henvisning:. Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, Cai YL Ye XQ, et al. (2014) Silencing af hTERT Gene af shRNA Hæmmer Colon Cancer SW480 Cell Growth

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e107019. doi: 10,1371 /journal.pone.0107019

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 10. oktober 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet 10. september, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Natural Science Foundation of Guangxi (tilskud 2010GXNSF013238, https://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) og programmer til Changjiang Scholars og innovative forskergrupper på universitetet (No. IRT1119). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorectalt carcinom er det tredje mest almindelige cancer verdensplan og den fjerde mest almindelige dødsårsag [1] – [2]. Alene i 2008 blev ca. 1.230.000 nye tilfælde af kolorektal cancer diagnosticeret rundt om i verden, og 608.000 mennesker døde af sygdommen [3]. Den standard behandling for denne kræftform er kirurgisk, men resultaterne er langt fra tilfredsstillende, med op til 50% af patienter, der lider tilbagefald eller død inden for 5 år fra kirurgi [4].

Målretning telomerase i colon carcinom kan give en effektivt alternativ eller supplement til kirurgisk behandling. Telomerase, et Ribonukleoproteinkompleks indeholdende en intern RNA-template (hTR) og en katalytisk protein med telomer-specifikke revers transkriptase-aktivitet (hTERT), strækker telomerer ved enden af ​​eukaryote kromosomer, hvilket forhindrer celleældning og død. Telomerase synes at spille en nøglerolle i tumorvækst og proliferation: ekspression og aktivitet af enzymet er unormalt forhøjede i de fleste kræftformer [5] – [6], og nedregulering enzymet inhiberer vækst og proliferation [7]. Mens hTR er konstitutivt til stede i normale celler og tumorceller, hTERT er det hastighedsbegrænsende komponent i telomerase kompleks, og dets ekspression korrelerer med telomeraseaktivitet [8]. I normale somatiske væv, er hTERT aktivitet undertrykkes, men både hTERT-ekspression og telomeraseaktivitet er forhøjede i de fleste humane tumorer [9] – [10]. Adskillige undersøgelser viser, at telomerase kan være nøglen til at udødeliggøre celler som et nødvendigt skridt i onkogenese [11] – [12]., Hvilket gør hTERT et potentielt nyttigt klinisk biomarkør [13] og mål for anticancer forskning [14]

i colorektal cancer, op til 85% af celler indeholder aktive telomerase, mens kun omkring 5% af normale colorektale celler indeholder aktivt enzym. Derfor målrette ekspressionen eller aktiviteten af ​​telomerase kan tilvejebringe en hidtil ukendt terapi for colorectal cancer. Da der ikke meget selektive telomerase-inhibitorer er tilgængelige til behandling af enhver kræft, vi fokuseret på genterapi tilgange. Genterapi forventes at spille en central rolle i næste generation cancerterapi sammen med konventionelle behandlinger såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling [15]. En genterapi er RNA-interferens (RNAi), der kan nedregulere ( “knock-down”) ekspressionen af ​​specifikke gener, således funktionerne af de gener, der skal analyseres eller blokeret til terapeutiske formål [16] – [18].

i den foreliggende undersøgelse, vi designet en roman hTERT lille interfererende RNA (siRNA) og udtrykte den tilsvarende korte hårnål RNA (shRNA) i humane kolorektal celler in vitro og i nøgne mus. Vi fandt, at vælte hTERT udtryk hæmmede human carcinom cellevækst kolon, øge muligheden for genterapi tilgange, der er målrettet hTERT.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig kolon karcinom cellelinjer SW480, DLD-1, og HT29 (Academia Sinica Cell Bank, Shanghai, Kina) blev dyrket i lav-glucose Dulbeccos modificerede Eagle medium (SW480) eller RPMI-1640-medium (DLD-1 og HT29) (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 10 mg /ml streptomycin. Kulturer blev inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C.

Etik erklæring og Dyr

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med vejledning om pasning og anvendelse af Laboratorium Dyr af det amerikanske National Institutes of Health, og forsøgsprotokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Guangxi Medical University. Alle operationer blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og lidelse blev minimeret så meget som muligt. Atymiske nøgne mus (BALB /CA nu /nu) i alderen 4-5 uger (Guangxi Institute of Materia Medica, Nanning, Kina) blev anbragt i sterile bure under laminar luftstrøm emhætter i en SPF-værelse med en 12 h: 12 timer lys-mørke tidsplan. Dyr blev fodret autoklaveret foder og vand ad libitum.

RT-PCR for at måle hTERT mRNA-ekspression i forskellige cellelinier

Totalt RNA blev ekstraheret fra SW480, DLD-1 og HT29-celler under anvendelse af Trizol ( Bio Basic Inc., Canada) ifølge producentens instruktioner. Første-streng cDNA-syntese blev udført med 2 ug RNA fra hver cellelinje og Moloney leukæmivirus RT (MMLV-RT; MBI Fermentas, Amherst, NY, USA), derefter amplificeret i en 50-pi reaktionsblanding indeholdende 50 mM hver af de fire dNTP’er, 3 U Taq DNA-polymerase (Promega), og 0,5 mM af primere (Sangon Co, Shanghai, Kina). Primerne 5′-GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3 ‘og 5′-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3′ blev anvendt til at amplificere et 252 bp region i hTERT-genet. Som en indre kontrol blev ekspression af glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) analyseres under anvendelse af primerne 5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 ‘og 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’ for at amplificere et 450 bp region. Amplifikationsreaktioner blev udført i 30 cykler ved 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 45 s og 72 ° C i 45 s. PCR-produkter blev separeret på en 2,0% agarosegel, som var farvet med nucleinsyrefarve I (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), fotograferet og analyseret semikvantitativt ved hjælp GeneTools Analysis Software (Syngene, Cambridge, UK). Cellelinien viser det højeste niveau af hTERT mRNA blev valgt til yderligere undersøgelse.

Design af siRNA’er rettet mod hTERT

Tre hTERT siRNA sekvenser blev konstrueret som beskrevet [19]. Sekvenserne var som følger, med nukleotid startpositioner baseret på NCBI post for hTERT (accession NM_198253): hTERT-966, 5′-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 ‘;

hTERT-2862, 5′-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT-3 ‘; og hTERT-2985, 5’-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘. Parallelt hermed har vi designet en ubeslægtet sekvens som en negativ kontrol for siRNA specificitet: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. Alle fire sekvenser blev underkastet en BLAST søgning mod det humane genom for at udelukke muligheden for væsentlig homologi til andre gener. Sekvenserne blev kemisk syntetiseret (GenePharma Co, Shanghai, Kina) og transient transficeret ind SW480 kulturer, som var blevet dyrket natten over til 40-60% konfluens i komplet medium uden antibiotika. Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine reagens (GenePharma Co, Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner. Efter 48 timers transfektion, revers transkriptase (RT) -PCR blev anvendt til måling hTERT mRNA-ekspression. HTERT-2985 sekvens viste sig at reducere niveauet af hTERT mRNA i størst omfang og blev derfor udvalgt til yderligere undersøgelse.

Konstruktion af en hTERT-shRNA eukaryot ekspressionsplasmid

RNA oligonukleotider 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘(sense) og 5′-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3′ (antisense), blev kemisk syntetiseret (GenePharma Co, Shanghai, Kina) og annealet til dannelse af en duplex med en symmetrisk overhæng to deoxythymidines på 3′ ende (hTERT-siRNA). En siRNA duplex indeholdende ubeslægtet sekvens 5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘(NC-siRNA) blev også syntetiseret som en negativ kontrol for siRNA specificitet. For at konstruere et plasmid, der udtrykker NC eller hTERT-siRNA for stabil transfektion blev de annealede oligonukleotider 5’-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 ‘og 5′-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3’ (mål sekvenser med blokbogstaver) subklones i PGPU6 /GFP /Neo vektor (GenePharma). Denne vektor udtrykker koral grønt fluorescerende protein (cGFP) under kontrol af CMV-promotoren for at tillade overvågning af transfektionseffektivitet. Plasmider der udtrykker NC-og hTERT-siRNA blev betegnet henholdsvis PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (herefter: NC-shRNA) og PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA. (Herefter: hTERT-shRNA)

Transient transfektion af SW480-celler

kulturer af 2 × 10

5 celler per brønd blev dyrket i 6-brønds plader til 90% konfluens og transficeret med 100 nM NC-shRNA eller hTERT-shRNA hjælp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Parallelt blev celler transficeret med den samme mængde Lipofectamine 2000, uden nogen shRNA plasmid som en kontrol. Kulturer blev høstet tre gange efter transfektion i 24, 48 og 72 timer.

RT-PCR for at måle hTERT-mRNA-ekspression efter transfektion

På hvert tidspunkt angivet ovenfor, blev totalt RNA ekstraheret fra transficerede SW480-celler under anvendelse af Trizol og underkastet RT-PCR som beskrevet ovenfor.

Immuncytokemi at måle hTERT-proteinekspression

SW480-celler blev udpladet på 2,5 cm dækglas med en tæthed på 5 x 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde. Efter transfektion i 24, 48 eller 72 timer blev dækglassene fjernet og immunfarvet med kanin polyklonalt anti-hTERT-antistof (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) og Maxvision kittet (Maixin, Fuzhou, Kina). På hver dækglas blev fem visninger tilfældigt udvalgt og fanget anvendelse af billedanalyse-software (Leica, Tyskland). I hver visning, blev gråtoner intensitet målt ved 10 tilfældigt udvalgte punkter og gennemsnit. Den gennemsnitlige gråtone intensitet var omvendt proportional med proteinniveauet.

TRAP-assay af telomeraseaktivitet

Telomerase-aktivitet blev analyseret under anvendelse af et kommercielt Telomerase PCR ELISA-kit (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Stockholm, Sverige) ifølge producentens instruktioner. Dette assay er baseret på den telomere repeat amplifikationsprotokol [20]. Efter SW480-celler var blevet transficeret i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, eller venstre utransficerede i dyrkningsmedium som en blank kontrol blev de samlede cellulære proteiner ekstraheret ved anvendelse CHAPS lysepuffer, og en 0,5-ug portion var analyseret. Assayet bestod af en telomerase-primerforlængelse reaktion, efterfulgt af 26 PCR-cykler. PCR-produkter blev påvist ved anvendelse af et ELISA-baseret farvereaktion [20].

Telomerase-aktivitet blev udtrykt som en justeret absorbans, givet ved absorbans i arbitrære enheder ved 450 nm minus absorbansen ved reference bølgelængden 690 nm . Ifølge producentens anvisninger, bør den maksimale justerede absorbans for den negative kontrol være 0,25, mens den justerede absorbans for den positive kontrol reaktion leveres i sættet skal være 1,5 efter 20 min reaktion. Prøver blev defineret som telomerase-positiv, hvis korrigeret absorbans var . 0.2

Flowcytometri at måle cellevækst og proliferation

SW480 celler transficeret i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA eller venstre utransficerede i dyrkningsmedium som en blank kontrol blev høstet, vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret natten over med 66% ethanol. Celler blev centrifugeret og vasket med PBS, derefter inkuberet med 50 pg /ml propidiumiodid og 2,5 ug /ml RNase i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri på en emissionsbølgelængde på 488 nm ved anvendelse Multicycle software (BD Biosciences, USA) [21]. Proliferationsindekset (PI) blev beregnet ifølge formlen:

PI = [S + (G2 /M)] /{(G0 /G1) + [S + (G2 /M)]} x 100 %.

flowcytometri at måle apoptose

apoptose blev målt ved dobbelt-farvning celler til annexin V og DNA (propidiumiodid) og analysere dem ved flowcytometri. SW480-celler transficeret i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA blev dyrket i nærværelse af de angivne koncentrationer af pristimerin, høstet, vasket med PBS og inkuberet i Annexin V Binding Buffer (BD Pharmingen) indeholdende 0,3% FITC-konjugeret Annexin V i 15 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev vasket og resuspenderet i Annexin V Binding Buffer. Propidiumiodid blev tilsat umiddelbart før flowcytometri [21] – [22]. Data blev analyseret ved hjælp FACSDiva Software (BD Biosciences).

TUNEL assay til måling af apoptose

The Dead End Kolorimetrisk TUNEL System (Kaiji, Nanjing, Kina) blev anvendt til at måle apoptose i SW480 kulturer transficeret med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, samt i nøgne mus injiceret med saltvand, NC-shRNA eller hTERT-shRNA plasmider (se nedenfor). Til in vitro-eksperimenter blev SW480-celler udpladet på 2,5 cm dækglas og transficeret i 48 timer, hvorefter dækglas blev fjernet og fikseret for TUNEL assay ifølge producentens protokol. Til in vivo eksperimenter, tumor vævssnit (5 um tykke) blev fremstillet. Slides blev fikseret i 10% PBS-buffer formalin (Kaiji, Nanjing, Kina) og permeabiliseret med proteinase K (Kaiji). Derefter objektglas blev forarbejdet som beskrevet af producenten.

Objektglas blev analyseret for apoptotiske celler efter producentens protokol. Kort fortalt blev rekombinant terminal deoxynucleotidyltransferase bruges til at tilføje biotinylerede nukleotider til DNA’et, natriumchlorid og natriumcitrat blev tilsat for at standse reaktionen, og derefter blev glassene inkuberet med peberrodsperoxidase-mærket streptavidin. Endelig blev objektglassene inkuberet med en blanding af hydrogenperoxid, diaminobenzidin chromogen, og peroxidasesubstrat for at farve kerner mørkebrun. Farvede objektglas blev derefter analyseret ved lysmikroskopi under anvendelse af et billedoptagelsessystem (Leica, Tyskland). Mindst 3 stor forstørrelse felter blev undersøgt på hvert dias ( 500 celler i alt)., Og det apoptotiske indeks (AI) blev beregnet som den procentdel af observerede celler farvning TUNEL-positive

Transmission elektronmikroskopi ( TEM) for at vurdere apoptotisk morfologi

SW480-celler blev transficeret i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA og derefter høstet. Cellerne blev pelleteret, straks fikseret i 3% (vol /vol) glutaraldehyd, efterfikseret i 1% (v /v) osmiumtetroxid og farvet med 4,8% uranylacetat. Efter dehydrering gennem en gradueret række af alkoholopløsninger blev prøver skyllet i propylenoxid og imprægneret med epoxyharpiks. De ultratynde snit blev behandlet med uranylacetat og blycitrat at tilvejebringe kontrast til TEM, som blev udført under anvendelse af et JEM-1230 (JEOL, Japan).

Måling af mitokondrisk membranpotentiale (MMP) for at vurdere apoptose

MMP blev målt ved anvendelse rhodamin 123 fluorescerende farvestof som indikator (CAS 83702, Sigma, Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet [23]. Dette farvestof har en excitation maksimum ved 488 nm og en maksimal emission på 526 nm. I denne fremgangsmåde antages MMP at variere omvendt proportionalt med rhodamin 123 fluorescens. SW480-celler blev transficeret i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, derefter vasket to gange med PBS for at fjerne de døde celler og inkuberet med rhodamin 123 (0,1 ug /ml) ved 37 ° C i 30 minutter. Rhodamin 123 fluorescensintensitet blev målt ved anvendelse af konfokal scanning mikroskopi (NIKON-AE, Japan). For hver eksperimentel betingelse blev gennemsnitlig fluorescensintensitet bestemmes for 500 celler.

hTERT-knockdown i en nøgen mus tumormodel

SW480-celler blev subkutant injiceret i den højre flanke af nøgne mus ved en dosis på 5 × 10

7 celler pr mus i 200 pi DMEM fortyndet 1:02 i PBS [24]. Når tumorknuder var vokset til 7 mm, blev musene tilfældigt inddelt i tre grupper på 8 dyr, hvor hver gruppe modtager i alt 6 intratumor injektioner af normal saltopløsning, 20 ug NC-shRNA eller 20 ug hTERT-shRNA hver 2 dage . Dyrene blev observeret i 6 dage efter den sidste injektion shRNA [25]. Tumor længde (L), bredde (W) og diameter blev målt to gange om ugen; tumor volumen (cm

3) blev beregnet ved hjælp af formlen W

2 × (L /2) [26]. Musene blev dræbt og neutrale formalin-fikserede tumorprøver blev farvet med hæmatoxylin-eosin og undersøgt ved lysmikroskopi.

Niveauer af hTERT mRNA og protein i de tre grupper af nøgne mus blev bestemt henholdsvis ved RT- PCR og immunohistokemi som beskrevet ovenfor. Telomeraseaktivitet og omfanget af apoptose ved hjælp af TUNEL-assayet blev også målt som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 16.0 (IBM, USA). Forskelle mellem behandlingsbetingelser blev vurderet for statistisk signifikans under anvendelse af envejs ANOVA efterfulgt af LSD eller Dunnetts t-test metode. Tærsklen for signifikans blev defineret som

P

. 0,05

Resultater

Endogen hTERT udtryk i colon cancer cellelinjer

Først skal vi screenet SW480 , DLD-1, og HT29 linjer til at identificere, hvilke havde tilstrækkelig høj hTERT mRNA udtryk for at lette RNA-interferens og analyse af virkningerne på cellevækst. RT-PCR viste, at hTERT mRNA-niveauer var knap påviselige i DLD-1 celler og signifikant højere i SW480 celler end i HT29-celler (0,827 ± 0,037

vs

0,705 ± 0,051,

P.

0,05;. figur 1A). Derfor SW480-celler blev valgt til yderligere undersøgelse.

(A) Endogen hTERT mRNA-ekspression i SW480, DLD-1 og HT29-cellelinier. Der var signifikante forskelle mellem SW480, HT29 og DLD-1 celler (

#

P

0,01) og mellem SW480 og HT29-celler (*

P

0,05). (B) Styrken af ​​hTERT siRNAs i SW480-celler. Niveauer af hTERT-mRNA var signifikant lavere i cellerne transficeret med hTERT siRNAs end i celler transficeret med negativ kontrol (NC) shRNA eller lipofectamin alene (Lipo). *

P

0,05,

#

P

0,01, sammenlignet med de NC-shRNA og Lipo grupper. Resultaterne er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Screening for det mest potente hTERT siRNA i SW480 kulturer

Tre hTERT-siRNA’er (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) og et ubeslægtet siRNA som en negativ kontrol (NC-siRNA) blev transient transficeret ind SW480-celler til at identificere siRNA at de fleste potent undertrykt hTERT mRNA-niveau, samt at bekræfte hTERT specificiteten af ​​vores siRNA tilgang. Kontrol celler transficeret med Lipofectamine reagens alene ( “Lipo”) eller med NC-siRNA viste lignende niveauer af hTERT mRNA (0,823 ± 0,025 og 0,815 ± 0,043, henholdsvis;

P

0,05). Transfektion med nogen af ​​de tre hTERT-siRNA’erne førte til betydeligt lavere hTERT mRNA niveauer end transfektion med NC-siRNA eller Lipo alene (Fig 1B.): HTERT-966, 0,395 ± 0,075; hTERT-2862, 0.650 ± 0,064; hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (alle

P

0,05). Af de tre hTERT siRNA sekvenser testede, var hTERT-2985 identificeret som den mest potente og blev derfor anvendt til at konstruere en hTERT-shRNA eukaryot ekspressionsplasmid for yderligere in vitro og in vivo undersøgelser.

Ekspression af hTERT-shRNA i SW480-celler nedregulerer mRNA og proteinekspression

Vi transficerede SW480-celler med hTERT-shRNA eller NC-shRNA i 24, 48 og 72 timer, derefter målt ekspression af hTERT-mRNA og protein. Ved 48-h transfektion viste kontrolkulturer lignende mRNA-niveauer: dyrkningsmedium alene (blind), 0,530 ± 0,032; Lipofectamin alene (Lipo), 0,483 ± 0,075; NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. Niveauer af mRNA var signifikant lavere efter 48-h transfektion med hTERT-shRNA (0,322 ± 0,030;

P

0,05 eller

P

0,01;. Figur 2A). Faktisk reduktionen i hTERT-mRNA var allerede kan observeres efter 24-h transfektion. Dog blev der ikke fundet forskelle i hTERT mRNA-ekspression mellem grupperne efter 72-h transfektion (Fig. 2A).

(A) RT-PCR-analyse af hTERT mRNA-ekspression i SW480 kulturer efter mock-transfektion med kultur medium alene (Blank), Lipofectamine alene (Lipo), negativ kontrol siRNA (NC-shRNA), eller hTERT-shRNA. Niveauer af mRNA-niveauer var signifikant lavere efter 48-h transfektion med hTERT-shRNA end efter kontrol transfektioner.

▴

P

0,05,

#

P

0,01, sammenlignet med den Blank; *

P

0,05 sammenlignet med Lipo og NC-shRNA. (B) Immuncytokemi af hTERT-protein-ekspression. (A) Tomme celler, (b) Lipo-celler, (c) NC-shRNA celler, og (d) hTERT-shRNA celler. Alle synspunkter, × 400. Højere gråtoner værdi angiver lavere proteinniveau. Protein-niveauer signifikant lavere efter 48-h transfektion med hTERT-shRNA end efter kontrol transfektioner.

#

P

0,01, sammenlignet med de andre grupper; *

P

0,05, sammenlignet med den Blank. (C) hTERT nedregulering inhiberer telomeraseaktivitet. Telomeraseaktivitet [korrigerede absorbans (450 nm-630 nm)] var signifikant lavere i celler transficeret med hTERT-shRNA end i kontrolceller. *

P

0,05, sammenlignet med den Lipo og blanke kontroller. Resultaterne er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Lignende resultater blev opnået når vi undersøgte hTERT proteinekspression. Mens de tre kontrolpunkter transfektioner førte til stærk gul kernemembranen farvning med rigelige brune partikler i kernerne, transfektion med hTERT-shRNA førte til meget svagere farvning (fig. 2B, a-d). Kvantificering af gråskala intensiteter, som varierede omvendt med niveauet af hTERT-protein, viste, at 48-h transfektion med hTERT-shRNA førte til meget lavere proteinniveauer (209.600 ± 17,101) end transfektion med dyrkningsmedium alene (146,500 ± 22,325), alene Lipofectamin (151,800 ± 24,478) eller NC-shRNA (167,350 ± 37,754) (

P

0,01;. figur 2B). Efter 72-h transfektion, selv om en væsentlig forskel varede mellem hTERT-shRNA og blindprøvekontrollen (239,500 ± 9,546 vs. 223,950 ± 10,259,

P

0,05;. Figur 2B), var der ingen signifikant forskel mellem hTERT-shRNA og NC-shRNA. Disse resultater sandsynligvis afspejler, at vores ekspressionsvektor er beregnet til kortvarige ekspressionsundersøgelser fordi den ikke integreres i værtsgenomet. Derfor udførte vi alle yderligere in vitro eksperimenter ud til 48 h.

hTERT nedregulering hæmmer telomerase-aktivitet i SW480 celler

Der blev observeret lignende niveauer af telomerase-aktivitet i SW480 celler transficeret i 48-h med dyrkningsmedium alene (2,756 ± 0,089), Lipofectamine alene (2,693 ± 0,225) eller NC-shRNA (2,691 ± 0,119). I modsætning hertil 48-h transfektion med hTERT-shRNA medførte signifikant lavere telomerase-aktivitet (2,242 ± 0,284;

P

0,05;. Figur 2C).

hTERT nedregulering reducerer væksten og spredning af SW480 celler

andelen af ​​celler i G0 /G1 fasen var signifikant højere efter 48-h transfektion med hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) end efter transfektion med dyrkningsmedium alene (42,27 ± 2,76%) , Lipofectamine alene (42,43 ± 4,67%) eller NC-shRNA (37,07 ± 1,53%, P 0,05). Samtidig, proliferationsindekset var meget lavere efter transfektion med hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) end efter transfektion med NC-shRNA (59.03 ± 5,86%, P 0,05); indekset var ens for alle tre kontrolgrupper (fig. 3A).

(A) hTERT-shRNA reducerer vækst og proliferation af SW480-celler. Andelen af ​​celler i G0 /G1-fasen var væsentligt højere og spredning indekset var meget lavere efter transfektion med hTERT-shRNA end efter kontrol transfektioner. *

P

0,05, sammenlignet med de tre andre grupper;

#

P

0,05 sammenlignet med NC-shRNA. (B) hTERT-shRNA øger apoptose af SW480-celler. Celler blev transficeret med (a) hTERT-shRNA eller (b) NC-shRNA, farvet med diaminobenzidin (brun) og modfarvet med hematoxylin (blå) til at mærke nuclei. Billeder er repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter. Forstørrelse, × 400. Den apoptotiske indeks (AI) var signifikant højere i celler transficeret med hTERT-shRNA.

#

P

0,01, sammenlignet med de tre andre grupper. (C) Transmissionselektronmikroskopi analyse af SW480-celler transficeret med (a-c) hTERT-shRNA eller (d) NC-shRNA. Apoptotisk morfologi var synlig i celler transficeret med hTERT-shRNA. Forstørrelse, × 3800. (D) Rhodamin 123 fluorescensintensitet analyse af SW480-celler transficeret med (a) dyrkningsmedium alene (Blank), (b) lipofectamin alene (Lipo), (c) NC-shRNA eller (d) hTERT-shRNA. Farvede celler blev analyseret ved konfokal scanning mikroskopi; højere fluorescensintensitet indikerer lavere mitochondriemembranpotential. Forstørrelse, × 400. Celler transficeret med hTERT-shRNA udviste signifikant højere rhodamin 123 fluorescens end gjorde kontrolceller. *

P

0,05 sammenlignet med NC-shRNA eller Lipo;

#

P

0,01 sammenlignet med Blank. Resultaterne er middelværdien ± SD fra tre uafhængige forsøg.

hTERT nedregulering øger apoptose af SW480 celler

I modsætning til Ctrl-transfekterede celler, celler transficeret med hTERT-shRNA var indskrumpet udseende; de viste dyb-brun farvning i cellemembranen, cytoplasmaet eller cellekernen; og de lejlighedsvis indeholdt apoptotiske legemer (fig. 3B, a-b). TUNEL-farvning viste, at andelen af ​​apoptotiske celler var meget højere efter transfektion med hTERT-shRNA [Apoptose indeks (AI) = 22,2 ± 4,25%] end efter transfektion med dyrkningsmedium alene (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine alene (2,2 ± 1,20 %) eller NC-shRNA (2,4 ± 1,25%, alle

P

0,01;. figur 3B). TEM-analyse viste også, at en stor andel af celler transficeret med hTERT-shRNA havde apoptotisk morfologi, herunder reduceret volumen, reduceret antal fremspring og mikrovilli, og ujævn kromatin akkumulering under kernemembranen (fig. 3C, a). Nogle cellekerner var halvmåneformet, cirkulær eller chunky, og mange celler indeholdt mange vakuoler (fig. 3C, b-c). I modsætning hertil udviste kontrol-transficerede celler normale interne struktur (fig. 3C, d).

Som en ekstra foranstaltning af apoptose, vi anvendte rhodamin 123 som et indeks for MMP (fig. 3D, a-d) ; i dette assay, højere farvestof intensitet indikerer lavere MMP, som er forbundet med apoptose. Celler transficeret med hTERT-shRNA viste signifikant højere rhodamin 123 fluorescens (719,998 ± 17,083) end gjorde celler transficeret med dyrkningsmedium alene (545,833 ± 6,811,

P

0,01), NC-shRNA (585,361 ± 51,781,

P

0,05) eller lipofectamin alene (632,169 ± 65,635,

P

. . 0,05) (fig 3D)

hTERT-shRNA hæmmer tumorcellevækst

in vivo

En xenograft tumor model blev oprettet ved at injicere nøgne mus med SW480 celler og derefter injicere de resulterende tumorer med NC-shRNA eller hTERT-shRNA. Periodisk måling af tumorstørrelse viste, at 31 dage, tumorer behandlet med hTERT-shRNA (0,248 ± 0,102 cm

3) var betydeligt mindre end tumorer behandlet med saltvand (0,543 ± 0,230 cm

3,

P

0,05) eller NC-shRNA (0.580 ± 0,293 cm

3,

P

0,01;.. figur 4A)

(A) hTERT-shRNA hæmmer tumor cellevækst. Tumor vækst på 31 dage var signifikant langsommere i tumorer behandlet med hTERT-shRNA end i tumorer behandlet med saltvand (*

P

0,05) eller NC-shRNA (

#

P

0,01). (B) histopatologisk undersøgelse af SW480 tumorvæv podet på nøgne mus og behandlet med hTERT-shRNA. Tumorvæv blev biopsi på 31 dage og farvet med hematoxylin-eosin. Pilen i (a) angiver ark nekrose; pilen i (b) angiver inversion af nukleoplasma til cytoplasma volumen, sammen med mitotisk patologi. Forstørrelse, × 200. (C) RT-PCR-analyse til måling af hTERT-mRNA-ekspression i tumorvæv behandlet med saltvand (bane 1-8), NC-shRNA (bane 9-16) eller hTERT-shRNA (bane 17-24). M, 100-bp DNA-stige. Den relative ekspression af hTERT-mRNA var signifikant lavere i de hTERT-shRNA mus. *

P

0,05, sammenlignet med den saltvand og NC-shRNA grupper. (D) Immuncytokemi af hTERT-protein (farves brun) i tumorvæv behandlet med (a) saltopløsning, (b) NC-shRNA, eller (c) hTERT-shRNA. Forstørrelse, × 200. Højere gråtone værdier indikerer lavere proteinniveauer. Den relative ekspression af hTERT-protein var signifikant lavere i hTERT-shRNA mus. # P 0,01, sammenlignet med den saltvand og NC-shRNA grupper. (E) Effekt af hTERT-shRNA på telomerase-aktivitet in vivo. Den justerede absorbans (450 nm – 630 nm) var signifikant lavere i tumorer behandlet med hTERT-shRNA end i tumorer behandlet med saltvand (*

P

0,05) eller NC-shRNA (

#

P

0,01). (F) Virkninger af hTERT-shRNA på apoptose. Tumorer blev injiceret regelmæssigt med (a) saltopløsning, (b) NC-shRNA eller (c) hTERT-shRNA, derefter biopsi og farvet med diaminobenzidin (brun); Kerner blev modfarvet med hematoxylin (blå). Billeder er repræsentative resultater af tre uafhængige eksperimenter. Forstørrelse, × 200. Den apoptotiske indeks (AI) var signifikant højere i tumorer behandlet med hTERT-shRNA end i tumorer behandlet med saltvand eller NC-shRNA.

#

P

. 0,01, sammenlignet med de to kontrolgrupper

hTERT-shRNA hæmmer hTERT udtryk og telomerase-aktivitet

in vivo

Efter 31 dages behandling med saltvand, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, relative udtryk for hTERT mRNA var signifikant lavere i hTERT-shRNA mus (0,388 ± 0,093) end i saltvand (0,809 ± 0,335) eller