PLoS ONE: Terpenoider fra Zingiber officinale (ingefær) inducere apoptose i endometriecancer Celler gennem Aktivering af p53

Abstrakt

Nye strategier er nødvendige for at forbedre kemoterapi respons i avancerede og tilbagevendende endometriecancer. Her vil vi vise, at terpenoider stede i Destilleret Steam Uddrag af Ginger (SDGE) er potente hæmmere af spredning af endometriecancer celler. SDGE, isoleret fra seks forskellige partier af ingefær jordstængler, konsekvent hæmmede spredning af de endometriecancer cellelinjer Ishikawa og ECC-1 ved IC

50 1,25 pg /ml. SDGE også forbedret antiproliferativ virkning af stråling og cisplatin. Nedsat proliferation af Ishikawa og ECC-1-celler blev et direkte resultat af SDGE apoptose som påvist af FITC-annexin V-farvning og ekspression af spaltede caspase 3. GC /MS-analyse identificeret i alt 22 forskellige terpenoidforbindelserne i SDGE, med isomerer neral og geranial udgør 30-40%. Citral en blanding af neral og geranial inhiberede proliferationen af ​​Ishikawa og ECC-1-celler på en IC

50 10 uM (2,3 ug /ml). Phenolforbindelser såsom gingerol og shogaol blev ikke påvist i SDGE og 6-GINGEROL var en svagere inhibitor af spredning af de endometrie kræftceller. SDGE var mere effektivt inducerer celledød end citral, hvilket antyder, at andre terpener til stede i SDGE også bidrog til endometriecancer celledød. SDGE behandling resulterede i en hurtig og kraftig stigning i intracellulært calcium og et fald i mitochondriemembranpotential 20-40%. Ser-15 i p53 blev phosphoryleret efter 15 min behandling af kræftceller med SDGE. Denne stigning i p53 var forbundet med 90% fald i Bcl2 henviser blev observeret nogen virkning på Bax. Inhibitor af p53, pifithrin-α, svækkede de anti-cancer effekter af SDGE og apoptose blev heller ikke observeret i p53

neg SKOV-3-celler. Vores undersøgelser viser, at terpenoider fra SDGE mægle apoptose ved at aktivere p53 og bør derfor undersøges som midler til behandling af endometriecancer

Henvisning:. Liu Y, Whelan RJ, Pattnaik BR, Ludwig K, Subudhi E, Rowland H, et al. (2012) Terpenoider fra

Zingiber officinale

(Ginger) inducere apoptose i endometriecancer Celler gennem Aktivering af p53. PLoS ONE 7 (12): e53178. doi: 10,1371 /journal.pone.0053178

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Saudi-Arabien

Modtaget: August 10, 2012; Accepteret: November 26, 2012; Udgivet: December 31, 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering af denne forskning blev leveret af tilskud fra Institut for Obstetrik og Gynækologi til AK og MSP, en velgørende donation fra Jean McKenzie og forskningsbevillinger fra Wisconsin kræft i æggestokkene Alliance til MSP og Rebecca Meyer Brown Professorat i UW-Eye Research Institute (Retina Research Foundation) til BRP. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i år 2011, ca 8010 kvinder døde på grund af endometriecancer og næsten 47.130 patienter var nyligt diagnosticeret med denne kræft [1]. I omkring 70% af kvinderne med en diagnose for endometriecancer, sygdommen er fundet lokaliseret til den uterine corpus og fem års overlevelse er så høj som 85% [2]. Avancerede og tilbagevendende livmoderkræft, indskrevet i flere gynækologisk onkologi gruppe (GOG) forsøg for agenter, herunder platin, taxaner og antracykliner, sjældent har fuldstændig svar på terapi [3] – [9]. Kombination regimer viser højere responsrater, men progressionsfri periode med disse behandlinger er relativt lav (5-7 måneder) med højere sygelighed og fortsatte mangel på helbredelse [10]. Disse statistikker understreger behovet for udvikling af nye og effektive kemoforebyggende og kemoterapeutiske midler til endometriecancer.

Naturligt forekommende kostkomponenter en vigtig kilde af bioaktive forbindelser, der kan tjene som både kemopræventive samt kemoterapeutiske midler mod endometrie og andre typer af kræft [11]. Vores laboratorium undersøger i øjeblikket de anti-cancer egenskaber af forbindelser til stede i rodstokke af ingefær (

Zingiber officinale

). Disse undersøgelser understøttes af tidligere undersøgelser, der viser, at tør ingefær pulver eller opløsningsmidler ekstrakter af ingefær rødder inducerer cellecyklusstop og apoptose i huden, bryst-, prostata-, tyktarms-, og ovariecancerceller [12] – [17]. Topisk anvendelse af ethanolekstrakt af ingefær faldt incidensen, størrelse, og antallet af DMBA /TPA inducerede tumorer i Sencar mus [18].

De fleste af de tidligere undersøgelser har konkluderet, at de bioaktive komponenter i tørt pulver og opløsningsmiddelekstrakt af ingefær jordstængler ansvarlig for anti-cancer aktiviteterne er de phenolforbindelser 4-, 6-, 8- og 10-gingeroler, paradol og shogaol, et produkt dannet efter tørring eller opvarmning af rødderne [19] , [20]. Disse phenolforbindelser og især gingeroler udviser anti-proliferativ og anti-angiogene egenskaber som påvist af

in vitro

in vivo

studier i forskellige kræftmodeller [13], [14], [16], [21] – [25]. Humane colorektale cancerceller, når behandlet med 6-gingerol, inhiberede celleproliferation ved at inducere G1 cellecyklusstop og apoptose [26]. Gingerols udvise disse anti-cancer effekter via flere mekanismer, herunder proteinnedbrydning samt β-catenin, PKC delta, og GSK3 beta pathways [26]. Studier i ovariecancer model har vist, at 6-shogaol hæmmer sekretionen af ​​VEGF ved cancercellerne [16]. 6-gingerol inducerer apoptose i prostatacancer LNCaP ved at øge ekspressionen af ​​p53 og Bax og samtidigt faldende ekspression af Bcl-2 [16], [17], [21].

Udover det pulverformige ingefær og ekstraktion af opløsningsmidlet kan bioaktive forbindelser også isoleres ved dampdestillation af denne jordstængler [27], [28]. Så vidt vi ved, er blevet udført kun begrænsede undersøgelser for at demonstrere de anti-cancer egenskaber af damp destillerede ekstrakter af ingefær. Kemisk analyse af dampen destilleret ekstrakt af ingefær indikerer, at de tidligere identificerede bioaktive phenolforbindelser er til stede i meget lav koncentration i damp destillerede ekstrakter af ingefær [27]. I den aktuelle undersøgelse demonstrerer vi, at dampen destilleret ekstrakter af ingefær er potente mediatorer af apoptose i endometriske cancerceller. Vore undersøgelser tyder på, at en af ​​de vigtigste bioaktive komponenter i damp destilleret ekstrakt af ingefær er citral (en blanding af to terpenoide isomerer, Neral og geranial). Vi viser, at behandling af de endometriske cancerceller med dampen destilleret ekstrakt af ingefær resulterer i signifikant stigning i intracellulært calcium, fald i mitrokondriemembranen, stigning i ekspressionen af ​​caspase 3, phosphorylering af P53, og et betydeligt fald i ekspressionen af Bcl-2. Observationerne er beskrevet i vores undersøgelser viser, at dampen destilleret ekstrakt af ingefær og dets bioaktive komponenter har potentialet til at blive udviklet som kemoforebyggende og kemoterapeutiske midler til endometriecancer.

Materialer og metoder

Reagenser og cellelinier

Pifithrin-α blev købt fra Sigma Life Science. DMEM (Dulbeccos modifikation af Eagles Medium), RPMI-1640, Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), og Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) var fra Cellgro (Manassas, VA). DiOC6, lonomycin og Indo 1-AM blev indkøbt fra Life Technologies (Grand Island, NY). SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate RIPA-buffer og Protease Inhibitor Cocktail var fra ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). Primær caspase-3 Kanin-antistof, Bcl-2 Kanin-antistof, Bax Kaninantistof, Phospho-P53 Mouse antistof og β-actin museantistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Peroxidase-konjugeret AffiniPure gede anti-kanin IgG-antistof og peroxidasekonjugeret AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG-antistof var fra Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). FITC-Annexin V Apoptose Detektion Kit blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA). ECC-1 [29], [30] og Ishikawa [31] celler var en gave fra Drs. Elaine Alarid og David Olive (Madison, WI), hhv. SKOV-3-celler blev indkøbt fra ATCC (Manasas, VA).

Cellekultur

Ishikawa-celler blev dyrket i DMEM og ECC-1 og SKOV-3-celler blev dyrket i RPMI-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotika i en CO 5%

2 inkubator.

Steam Destillation af Ginger jordstængler

Ginger jordstængler blev opnået fra lokale leverandører , renset med destilleret vand og skæres i 0,5 cm stykker. Ca. 250-300 g af afskårne ingefær stykker blev overført til 1000 ml rundbundet kolbe af dampdestillation apparatet Clevenger. Ingefær rødder blev nedsænket i 500 ml deioniseret vand (18 MOhm-cm) og dampdestillation blev udført i 4-6 timer ved kolben opvarmning. Olien separering i Clevenger apparatet var lettere end vand og blev separeret ved periodisk dræning af væske akkumuleres i adskillelsen rør af enheden. Olien blev straks alikvoteret i mikrocentrifugerør og nedfrosset indtil anvendelse i assays. Densiteten af ​​olien blev beregnet til 0,87 g /ml, og denne måling blev anvendt til at beregne koncentrationen af ​​ekstrakten anvendes til at udføre de biologiske assays.

celleproliferationsassays Salg

Virkning af damp destillerede ingefær ekstrakter, citral, og 6-gingerol på proliferationen af ​​cancercellelinier blev bestemt af 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) -optagelse metode [32 ], [33]. Kort fortalt blev cancercellerne udpladet i 96-brønds plade med en tæthed på 5000 celler /brønd i deres respektive medium. Cellerne blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af ingefær ekstrakt (0,025 ug, 0,25 ug, 2,5 ug, 6,25 ug og 12,50 pg /ml) og inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 miljø i 24 timer, 48 h og 72 h. Efter den angivne tidsperiode, blev 20 pi 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromid tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 3 timer. Formazankrystallerne dannet i brøndene blev opløst i 100 pi DMSO. Absorbansen blev målt ved 570 nm under anvendelse af et Spectra MAX 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

kombineret behandling af cancerceller med SDGE og strålebehandling eller kemoterapi

MTT assays blev udført for at bestemme hvis SDGE forbedret anti-spredning effekt af stråling eller kemoterapi i endometrie kræftceller. Ishikawa eller ECC-1-celler blev udpladet i multiple plader med 96 brønde (5 x 10

3 celler /brønd) på dag 1 af forsøget. Efter at have ladet cellerne til at stabilisere sig, medier eller SDGE blev tilsat til brøndene indeholdende de endometriske cancerceller på dag 2. Celler i nogle af brøndene blev også behandlet med cisplatin (5 uM), mens andre blev bestrålet med en enkelt dosis på 4 Gy ved hjælp af et cæsium-137 radiator. Efter disse behandlinger, blev cellerne dyrket i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO

2 miljø. Effekt af behandlingen på proliferation af de endometriske cancerceller blev bestemt ved udførelse af MTT-assays som beskrevet ovenfor.

gaskromatografi-massespektrometri af SDGE

Separation og identifikation af forbindelser i SDGE prøver anvendes en Shimadzu GC-17A gaschromatograf udstyret med en QP-5000 kvadrupol masseanalysator (Shimadzu Scientific Instruments, Colombia, MD). Før analyse blev 20 pi af frisk optøet SDGE opløst i 1000 pi pentan. 1 pi af denne opløste ekstrakt blev injiceret manuelt til gaskromatografen anvendelse af en 01:50 indløb delingsforholdet og helium som bæregas med en strømningshastighed på 1,4 ml /min. Gaskromatografen indeholdt en ikke-polær RTX-5MS søjle (30 m længde, 0,25 mm ID, 0,25 um filmtykkelse,. Restek, Bellefonte, PA) Søjletemperatur blev oprindeligt 70 ° C efterfulgt af en rampe ved 4 ° C /min til 180 ° C. Elektron ionisering detektion var i fuld-scanning, positiv ion-mode over et masse-til-ladningsforhold (m /z) området fra 41 til 300. Forbindelser blev tentativt identificeret ved at søge en NIST bibliotek og ved sammenligning af aritmetiske opbevaring indekser til værdier rapporteret af Adams [34].

Måling af apoptose ved flowcytometri

Apoptose blev målt ved anvendelse af FITC-Annexin V Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, San Diego, CA). Kort fortalt, 2 × 10

6 celler blev behandlet med 0,25 ug /ml ingefær ekstrakt med eller uden 100 pM Pifithrin-α. Efter inkubation ved 37 ° C i 0-16 timer blev cellerne vasket to gange med kold PBS og resuspenderet i 1 × bindingsbuffer (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2) ved en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. Derefter 1 x 10

5 celler i 100 pi bindingspuffer, blev overført til 5 ml rør og farvet med 5 pi FITC-Annexin V og 5 pi propidiumiodid (PI). Cellerne blev forsigtigt hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter vask af cellerne med 1 × bindingsbuffer for at fjerne overskuddet FITC-Annexin V og PI blev cellerne analyseret på en FACSCalibur flowcytometer. Data blev analyseret under anvendelse FlowJo software.

Cell cyklus assay.

endometriecancer-celler blev behandlet med SDGE (250 ng /ml eller 2,5 ug /ml) i 24, 48 og 72 h. Efter behandling blev cellerne høstet, vasket med PBS og fikseret i 75% ethanol, vasket med PBS og farvet med propidiumiodid. Flowcytometri blev derefter udført for at analysere prøverne for både apoptose og cellecyklus status som tidligere beskrevet [35].

Western blot analyse

Efter behandling af cellerne med dampen destillerede ekstrakter af ingefær blev kræftcellerne vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) og lyseret med RIPA-buffer (Pierce, Rockford, IL) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). Den totale mængde af protein i lysatet blev bestemt ved anvendelse af BCA-assay (Pierce). Cellelysater blev fyldt ved 25 ug /brønd på en 7,5 eller 12% løse polyacrylamidgel og separeret ved elektroforese, hvorefter blev proteinerne overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% mælk i Tris-bufret saltvand og probet med passende primære antistoffer. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL) blev anvendt til påvisning af proteinerne på blottene. Filmene blev scannet ved hjælp FLUORCHEM 890 og Image J software blev anvendt til at kvantificere intensiteter af båndene.

mitokondriemembranen Potential Assay

De endometriecancer blev dyrket i T25 vævskulturkolber. Eksponentielt voksende celler blev behandlet med 0,025 ug /ml eller 0,25 pg /ml ingefær ekstrakt i 24 timer. Cellerne blev derefter vasket og høstet. 1 × 10

6 celler blev sat til hver strømningsrør fra ubehandlet, 0,025 ug /ml og 0,25 ug /ml ingefærekstrakt behandlede celler. Cellerne blev behandlet med 40 nM DiOC6 ved 37 ° C i 30 minutter. Cellerne blev derefter vasket, resuspenderet i 400 pi PBS indeholdende 2% FBS og analyseret ved FACSCalibur flowcytometer at vurdere det mitokondrielle membran potentiale.DEH blev analyseret under anvendelse FlowJo software.

calciumflux Målinger

de Ishikawa-celler i log-fase af vækst blev høstet under anvendelse af trypsin. Cellerne (1,2 x 10

7) blev vasket tre gange og suspenderet i 1 ml 0,5% bovint serumalbumin (BSA) indeholdende Hanks saltvand, der ikke indeholdt nogen divalente kationer. Cellerne blev fyldt med indo 1-AM (2 uM) i nærvær af 4 mM probenecid i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO

2 miljø. Cellerne blev derefter vasket og resuspenderet i Dulbeccos phosphatbufret saltvand indeholdende 0,5% BSA og 1 mM CaCl

2 til en slutkoncentration på 2 × 10

6 celler /ml. Cellerne blev filtreret gennem et 35 mikron membranfilter før flowcytometri på LSR-II cytometer. Celler blev indledningsvis analyseret for 3 min til bestemmelse af basislinje intracellulære calciumkoncentration. SDGE (0,025, 0,25 eller 2,5 ug /ml) eller Ionomycin (1 uM anvendt som en positiv kontrol) blev efterfølgende tilsat til cellerne, og ændringen i den Indo-1 fluorescens blev bestemt ved kontinuerligt streaming cellerne gennem flowcytometeret for ca. 7 minutter. De opnåede data blev analyseret ved hjælp FlowJo software.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prizm software. Tærsklen for statistisk signifikans er en sandsynlighed på 0,05. Dataene blev analyseret ved hjælp af uparrede t-test.

Resultater

Isolering af Steam Destilleret Uddrag fra Ginger Roots

æteriske olier kan nemt isoleres fra ingefær rødder ved dampdestillation i et modificeret Clevenger apparat. Vi har været i stand til at isolere ca. 300 mg af essentielle olier fra 250 g ingefær rødder stammer fra lokale kommercielle leverandører. I alt fem partier af ingefær jordstængler, hver opnået fra en separat kommerciel kilde, blev anvendt til at isolere de æteriske olier ved dampdestillation. To af disse fem partier af ingefær blev opnået fra lokale leverandører i Bhubaneshwar, Indien og damp destillation blev også udført på stedet. De resterende tre batcher af ingefær blev opnået fra leverandører i Wisconsin og dampdestillation af ingefær blev udført i laboratorie- ved University of Wisconsin. Udbyttet af den æteriske olie var sammenlignelig mellem alle partier af ingefær rødder anvendt i denne undersøgelse, og tætheden af ​​SDGE blev bestemt til at være ca. 0,87 g /l.

Destilleret Steam Ginger Extract er en potent hæmmer af endometriecancer Cell proliferation

de æteriske olier af ingefær blev først testet for deres effekt på udbredelsen af ​​to endometriecancer (ECC-1 og Ishikawa) cellelinjer. Begge endometriecancer cellelinier var følsomme over for SDGE ved koncentration så lav som 250 ng /ml (Fig 1A og B.), Celleproliferationen blev signifikant inhiberet (P 0,05) ved 2,5 ug /ml koncentration. Celleproliferationen data for begge cellelinier er vist i fig. 1A og B repræsenterer kumulative data fra eksperimenter udført med SDGE isoleret fra tre forskellige partier af ingefær jordstængler. Seksten gentagelser blev anvendt til hver testet for hver batch af SDGE tilstand. Derfor hvert datapunkt i fig. 1 er et gennemsnit af 48 særskilte aflæsninger og viser kun mindre variationer i målingerne, klart viser de meget reproducerbare virkninger af SDGE partier om spredning af ECC-1 og Ishikawa celler. Analyse af dataene fra proliferationsanalysen vist, at ved den 72 timer tidspunkterne, IC

50 af SDGE for begge cellelinier var ca. 1,25 ug /ml.

Virkning af SDGE på celleproliferation blev bestemt ved ledende MTT-assays. Den celler Ishikawa (A), og ECC-1 (B) blev inkuberet med de afbildede koncentrationer af SDGE til 24, 48 og 72 timer. Optisk densitet ved 570 nm blev bestemt til kvantificering af antallet af levende celler i kulturerne. Kontrolsystemer (con) brønde i alle eksperimenter blev behandlet med DMSO, vehikelkontrollen. Kumulative data for SDGE isoleret fra tre forskellige partier af ingefær jordstængler vises. Hvert datapunkt i alle figurer er gennemsnit af 48 individuelle målinger. Antiproliferativ virkning produceret af SDGE (2,5 ug /ml) i Ishikawa (C og E) og ECC-1 (D og F) celler var sammenlignelig med behandlingen af ​​disse to cellelinjer med stråling (C og D) eller cisplatin (E og F). Cellerne blev samtidig behandlet med SDGE og stråling (4 Gy) eller cisplatin (5 uM). MTT-assays blev udført for at bestemme virkningen af ​​disse behandlinger på proliferationen af ​​Ishikawa og ECC-1 cellelinier. Hver søjle i C-F betegner en middelværdi på otte gentagelser. * P 0,001,

# p 0,05 og

† p . 0,05 (ikke signifikant)

Kombineret Behandling med SDGE og Stråling eller Cisplatin Producerer Enhanced Anti-proliferativ Effect

Avanceret endometriecancer behandles ved hjælp stråling og kemoterapi. Vi undersøgte derfor hvis den kombinerede behandling af de endometriske cancerceller med SDGE og stråling eller cisplatin frembragte en forøget anti-proliferativ virkning på ECC-1 og Ishikawa-celler. Resultaterne af MTT assay viste, at SDGE behandling reducerede proliferation af de to cellelinier ved 40% og dette fald i proliferation, i ECC-1-celler, var sammenlignelig med den observeret i celler, som blev behandlet med stråling alene (fig. 1C og D). I tilfælde af Ishikawa-celler, inhibering af proliferation produceret af SDGE var ca. 10% højere end den observeret med stråling alene (fig. 1C). Endelig i tilfældet med begge ECC-1 og Ishikawa-celler, den kombinerede behandling med SDGE og stråling forstærket inhibitorisk virkning på proliferation med 23-25% sammenlignet med de celler, der kun blev behandlet med stråling (fig. 1C og D) .

Næste vi også testet den kombinerede effekt af SDGE og cisplatin på Ishikawa og ECC-1 celler. MTT-assays udført efter 72 timers behandling viste, at kombineret behandling med SDGE og cisplatin faldt proliferationen af ​​Ishikawa-celler med yderligere 26% i sammenligning med cisplatin alene behandling (fig. 1E). I modsætning hertil har vi ikke observere yderligere forbedring i hæmning af spredning, når ECC-1 celler blev behandlet med en kombination af SDGE og cisplatin (fig. 1 F).

Disse eksperimenter også tilladt os at foretage en relativ sammenligning af de cytotoksiske virkninger af SDGE med dem af cisplatin. Når det bruges som et enkelt middel, Cisplatin (5 uM; 1,5 ug /ml) nedsætter proliferation af Ishikawa og ECC-1-celler med 59% og 61%, henholdsvis i sammenligning med kontrollen (Fig 1E og F.). Når SDGE (2,5 ug /ml) blev anvendt som et enkelt middel, inhibering af proliferation af Ishikawa og ECC-1-celler var 37% og 42%, henholdsvis i forhold til kontrollerne (fig. 1 E og F). Disse resultater antydede, at ligner cisplatin, SDGE var også meget potent hæmme endometriecancer celleproliferation, der giver en stærk begrundelse for yderligere undersøgelse af den mekanisme, hvormed denne botanisk ekstrakt producerede sine anti-cancer effekter.

Hæmning af endometriecancer celleproliferation via apoptose

MTT-assays viste, at SDGE var en potent inhibitor af proliferation af de endometriske cancercellelinjer. Den reducerede proliferation af endometriecancer cellelinjer var et direkte resultat af apoptose induceret i celler efter SDGE behandling. SDGE ved koncentrationer så lave som 250 ng /ml forårsagede en forøgelse i overfladen binding af FITC-Annexin V og propidiumiodid-farvning som bestemt ved flowcytometri (fig. 2A). Stigning i FITC-Annexin V-positive celler blev observeret så tidligt som 30 minutter efter SDGE blev tilsat til cellekulturerne (Fig. 2A). Western blot-analyse bekræftede den forøgede ekspression af caspase 3 i ECC-1 (data ikke vist) og Ishikawa-celler, som blev behandlet i 24, 48 og 72 timer med 250 ng /ml koncentration af SDGE (fig. 2B). Næste testede vi, hvis SDGE også var inducere cellecyklus arrest i endometrie kræftceller. Ishikawa-celler blev derfor behandlet med 250 ng /ml eller 2,5 ug /ml SDGE til 24, 48 og 72 timer. Celler blev mærket med propidiumiodid og cellecyklus status blev overvåget ved flowcytometri (fig. 2C). Denne analyse viste, at SDGE ikke inducerer nogen større effekt på cellecyklus status af cellerne. Kun marginalt fald blev observeret i procentdelen af ​​celler i S-fasen af ​​cellens cyklus. dette fald blev imidlertid observeret, når de Ishikawa-celler blev behandlet med 2,5 ug /ml. Behandling af cellerne med 250 ng /ml ikke inducerede nogen ændring i cellecyklus status selvom denne koncentration af SDGE induceret apoptose i cancercellerne.

Ishikawa-celler blev behandlet med 250 ng /ml SDGE for 30 min, 2 timer, 4 timer, og 16 timer. Efter inkubering med SDGE blev celleoverlevelse bestemt ved mærkning af cellerne med FITC-konjugeret FITC-Annexin V og propidiumiodid (A). Cellerne blev analyseret ved flowcytometri og celledød og apoptose blev identificeret som de begivenheder, som var enkelt positiv for FITC-Annexin V (nederste højre kvadrant) eller dobbelt positive for både FITC-Annexin V og proidium iodid (øverste højre kvadrant). SDGE-induceret apoptotisk celledød i de endometriske cancerceller blev bekræftet ved detektering spaltet caspase 3 i Western blot-analyse (B). En stigning i spaltet caspase 3 niveauer blev observeret, når de Ishikawa-celler blev behandlet med SDGE (250 ng /ml) i 0, 24, 48 og 72 timer. Data i A og B er repræsentativ for resultater opnået i tre separate forsøg,

Kemisk sammensætning SDGE

De potente anti-cancer effekter af SDGE fik os til at undersøge de potentielle bioaktive komponenter af ingefær, der sandsynligvis inducerer apoptose i de endometriske cancercellelinier. SDGE isoleret fra tre separate portioner af ingefær rødder blev analyseret ved GC-MS. Ingefær ekstrakt blev fortyndet i pentan, og de flygtige bestanddele blev separeret gennem en ikke-polær RTX-5MS søjle (fig. 3). De enkelte toppe eluerede fra søjlen blev analyseret ved elektronmikroskopi ionisering massespektrometri. En analyse af tilbageholdelse indekser og massespektre tilladt os at identificere i alt 22 forbindelser i SDGE (tabel 1). Den relative procentdel af hver af de identificerede komponent blev også bestemt i denne analyse. Dataene viste, at SDGE isoleret fra forskellige partier af ingefær jordstængler var sammenlignelig i sine kemiske bestanddele.

Tre separate præparater af SDGE, to fra USA (betegnet Wisconsin 1 og 2) og en fra Indien blev adskilt på en ikke-polære gaskromatografi kolonne. Forbindelserne adskiller på denne kolonne blev identificeret ved massespektrometri. Forbindelser identificeret gennem denne analyse sammen med deres relative mængder er vist i tabel 1.

GC-MS-analyse førte også til den konklusion, at SDGE ikke indeholder signifikante mængder af phenolforbindelser, gINGEROL, shogaol, og paradol som tidligere er blevet identificeret som de anticancer-midler til stede i ingefær pulver og solvent ekstrakter af ingefær rhizomer [20], [24], [25], [36]. Disse data er understøttet af vores observation, at 6-gingerol ikke inhiberer proliferation af Ishikawa og ECC-1-celler, selv når de testes ved koncentrationer så høje som 150 uM (fig. 4A og B).

MTT-assays var udført for at bestemme virkningen af ​​6-gingerol (A og B) og citral (C og D) på proliferation af Ishikawa og ECC-1-celler. Hvert datapunkt er en middelværdi af 16 individuelle målinger. Baseret på disse data IC

50 af citral blev beregnet til 15-25 uM.

Terpenoider var de vigtigste komponenter i SDGE identificeret i GC-MS-analyse. Neral og geranial er isomerer, der er kollektivt benævnt citral. Disse to forbindelser udgjorde ca. 35-45% af de samlede kemiske komponenter identificeret i vores analyse (tabel 1). I

in vitro

analyser blev det observeret, at behandling med citral resulterede i et signifikant fald i udbredelsen af ​​Ishikawa og ECC-1 celler. IC

50 for citral for begge cellelinier var mellem 15-25 pM (Fig. 4C og D). Denne IC

50 koncentration af citral svarer til 2,28 til 3,8 ug /ml. Til sammenligning SDGE var effektivt til en IC

50 1,25 ug /ml. Da kun 35-45% af SDGE er sammensat af neral plus geranial, IC

50 koncentration af SDGE kun svarer til en 2,8 til 3,7 uM koncentration af citral. Dette niveau af citral er betydeligt lavere end IC

50 koncentration beregnet for dette middel i vores in vitro proliferationsassays (fig. 4C, D). Derfor konkluderede vi, at der ud over citral, er der andre bioaktive komponenter, der bidrager væsentligt til de anti-cancer effekter af SDGE. Derfor gennemførte vi de mekanistiske undersøgelser, der er anført nedenfor ved hjælp SDGE stedet for citral som det bioaktive middel.

SDGE Fremkalde Calcium Flux og forringer mitokondriemembranen Potential

Behandling af Ishkawa celler med SDGE resulterede i en signifikant tilstrømning i intracellulært calcium (fig. 5A). Stigningen i intracellulært calcium blev observeret ca. 3 minutter efter tilsætning af SDGE. Tiden kinetik og den samlede profil af calcium flux var svarende til den observeret i celler behandlet med ionomycin. Amplituden af ​​calciumflux respons var afhængig af koncentrationen af ​​SDGE. Ved den højeste koncentration af SDGE testet, den maksimale calciumflux observeret var ca. 60-70% af responset observeret med ionomycin (1 um). Ionomycin inducerede en pludselig stigning i intracellulære calcium niveauer som derefter faldt inden for et minut, men for alle koncentrationer af SDGE testet stigningen og efterfølgende fald i intracellulært calcium blev relativt langsomt (fig. 5A). Calciumflux faldt 5-6 min efter tilsætning af SDGE men nåede ikke forbehandlingsniveauer (fig. 5A).

Virkning af SDGE på den intracellulære calcium-flux blev bestemt ved at behandle Indo-1 loaded Ishikawa-celler (A) . Umiddelbart efter tilsætning af SDGE til cellesuspensionerne blev Ishikawa-celler strømmet gennem cytometeret og stigning i fluorescens måltes til påvisning af calcium flux. Fald i mitochondriemembranpotential blev påvist ved lastning Ishikawa-celler med DiOC6 (B). SDGE eller vehikelkontrol blev tilsat til cellerne. Efter 24 timers behandling, blev cellerne høstet og inkuberet med DiOC6 i 15 min. Fluorescens blev målt for at bestemme ændringer i mitochondriemembranpotential.

Stigningen i calcium og induktion af apoptose i SDGE behandlede ECC-1 og Ishikawa celler foreslog et underskud i mitokondriefunktionen. Måling af mitochondriemembranpotential indikerede en 2 gange formindskelse i Ishikawa-celler, som blev behandlet i 24 timer med 25 ng /ml eller 250 ng /ml SDGE (fig. 5B).

SDGE behandling resulterer i en forøgelse af Bax /Bcl-2 Ratio

Bcl-2 er en anti-apoptotisk protein, der associerer med mitokondriemembranen. Fald i mitochondriemembranpotential førte os at bestemme virkningen af ​​SDGE (250 ng /ml) på Bcl-2-ekspression. I både ECC-1 (data ikke vist) og de Ishikawa-celler (fig. 6), nedsat Bcl-2-ekspression blev observeret efter 24, 48, og 72 h behandling med SDGE.