PLoS ONE: PFTK1 Fremmer Gastric Cancer Progression ved Regulering spredning, migration og invasion

abstrakt

PFTK1, også kendt som PFTAIRE1, CDK14, er et hidtil ukendt medlem af Cdc2-relaterede serin /threonin-proteinkinaser. Nylige undersøgelser viser, at PFTK1 i høj grad udtrykkes i flere maligne tumorer, såsom hepatocellulært carcinom, esophageal cancer, brystcancer, og er involveret i regulering af cellecyklus, tumorer proliferation, migration og invasion, som yderligere påvirke prognosen af ​​tumorer. Men udtrykket og fysiologiske betydning af PFTK1 i mavekræft fortsat uklare. I denne undersøgelse analyserede vi ekspressionen og kliniske betydning af PFTK1 ved Western blot i 8 parrede friske mavekræft væv, nontumorous gastriske mucosale væv og immunohistokemi på 161 paraffinembedded skiver. Høj PFTK1 ekspression blev korreleret med tumorklassificering, lymfeknude invasion samt Ki-67. Gennem Cell Counting Kit (CCK) -8 assay, flowcytometri, kolonidannelse, sårheling og transwell assays, de vitro studier viste, at PFTK1 overekspression fremmet proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller, mens PFTK1 knockdown ført til det modsatte resultat. Vores resultater for første gang støttet, at PFTK1 kunne spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​mavekræft proliferation, migration og ville tilvejebringe et nyt lovende terapeutisk strategi mod human mavekræft

Henvisning:. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J., Wang Q, et al. (2015) PFTK1 Fremmer Gastric Cancer Progression ved Regulering spredning, migration og invasion. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10,1371 /journal.pone.0140451

Redaktør: keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: May 7, 2015; Accepteret: September 25, 2015; Udgivet 21. oktober, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation of China (nr 81.302.285, No. 81.402.015)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige ondartet svulst og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i alle former for kræft på verdensplan [1]. Det er vanskeligt at hærde medmindre det konstateres på et tidligt stadium [2]. På grund af den manglende specificitet, tidlig diagnose er lav, og hovedparten af ​​mavecancerpatienter er i midt-sent tidspunkt, når diagnosen. 40% -60% patienter med mavekræft fik mavekræft radikal operation vil ofte have postoperative gentagelse og metastase, disse egenskaber alvorligt påvirke overlevelsen hos patienter med mavekræft [3,4] langsigtet. Trods stor fremgang af nye diagnose og behandlingsstrategier for mavekræft, forbliver de nøjagtige molekylære mekanismer i mavekræft dårligt forstå. Således kan identifikationen af ​​den molekylære mekanisme under mavekræft progression og metastase give patienter med nye diagnostiske og terapeutiske strategier.

PFTK1 (også kendt som PFTAIRE1, CDK14) er et hidtil ukendt medlem af Cdc2-relateret serin /threonin proteinkinaser, der først er identificeret i mus nervesystem og er en afgørende regulator af cycliner og cellecyklus [5,6]. Kun få undersøgelser er blevet udført for at karakterisere sin fysiologiske funktion eller biologisk betydning. Det forlyder, at PFTK1 er højt udtrykt i hjerne, pancreas, nyre og æggestok. CDK’er binder til specifikke cyclin boksen til dannelse funktionelle protein kinase komplekser og reguleres delvist af sin subcellulære lokalisering [7]. For eksempel cyklin Y, et hidtil ukendt membranassocieret cyclin, interagerer med PFTK1 forøger PFTK1 kinaseaktivitet og rekrutterer PFTK1 til plasmamembranen [8]. PFTK1 interagerer med cyclin B2 co-lokalisering i kernen i hepatocellulært carcinom [9]. Den grundlæggende funktion af PFTK1 rapporteres som en cyclin-afhængig kinase (CDK), der regulerer cellecyklusprogression og celleproliferation ved specifikt at interagere med medlemmer af cyclin proteiner, såsom cyclin D3 (CCND3), cyklin Y (CCNY) og danner et ternært kompleks med cellecyklus-inhibitoren p21, phosphorylerer således tumor suppressor Rb for G1 /S overgang [10]. Knockout Cyclin Y i gliomcellelinier gør cellecyklus blokeres i S periode [11]. Cyclin Y interagerer med PFTK1 justere M fase af mitose [12]. Disse opdagelser sammen implicerer, at PFTK1 kan fungere som en tumor promoter via regulering cellecyklus. I flere studier viser, at PFTK1 har også andre vigtige funktioner. PFTK1 modulerer oligodendrocyt differentiering via PI3K /AKT-vejen [13]. Senest PFTK1 giver HCC cellemotilitet gennem inaktivering af actinbindende motile undertrykkende funktion af TAGLN2 via phosphorylering [14]. PFTK1-medieret phosphorylering muliggør associering CAD til F-actinfilamenter, hvilket resulterer i forbedring polymerisation af actin stress fibre og dermed fremme cellemigration og invasion i HCC-celler [15,16]. Overekspression af PFTK1 kan give en bevægelig fænotype i maligne hepatocytter [9]. Efter aftale med de molekylære resultater, CCNY og /eller PFTK1 alene kan aktivere noncanonical Wnt signalering at øge celle motilitet hos HCC celler [17]. Alle disse undersøgelser indebærer, at PFTK1 kan være involveret i celledeling og motilitet, men udtryk og betydning PFTK1 i gastriske kræftceller er stadig uklar.

I vores undersøgelse, vi havde til formål at gennemføre en omfattende analyse af PFTK1 udtrykket og prognose rolle i gastriske cancerceller. Vi undersøgte udtryk for PFTK1 og dets samarbejde med de kliniske karakteristika og Ki-67 ved Western blot og immunhistokemi (IHC). Vores undersøgelse viste, at PFTK1 forøget proliferation, migration og invasivitet af gastriske cancerceller ved CCK-8, flowcytometri analyser, kolonidannelse analyser, Transwell assay, påvirkede ekspression af beslægtede proteiner. Disse resultater blev først rapporteret i gastriske cancerceller og kan tilvejebringe et nyt indblik i udviklingen af ​​eksperimentelle behandlingsformer i mavekræft.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Et hundrede og tres -one gastrisk cancer vævsprøver og matchede tilstødende noncancer væv blev udvalgt fra patienter, som gennemgik kirurgi mellem 2007 og 2013 ved Institut for Patologi, Nantong Tumor Hospital. Disse væv blev opbevaret ved -80 ° C umiddelbart efter kirurgisk fjernelse. Til histologisk undersøgelse blev alle gastriske vævsprøver fikseret i 10% pufret formalin og indlejret i paraffin til sektionering. Resektion prøver blev klassificeret i henhold til syvende udgave af TNM klassifikation af gastrisk kræft [1] .Alle de klinisk-patologisk oplysningerne alder, køn, infiltration dybde, differentiering status, lymfeknude invasion, nerve invasion og TNM stadie. Godkendelsen af ​​fjernede væv til forskningsformål blev opnået fra den etiske komité i Nantong Tumor Hospital. Underskrevet informeret samtykke blev også opnået fra hver patient. De vigtigste kliniske og patologiske variabler blev opsummeret i tabel 1.

Western blot-analyse

Western blot-assay blev anvendt til at detektere nogle proteiner [18-20]. For det første blev de gastriske caner væv og celler krakket i lysepuffer (1 M Tris-HCI pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% natriumsulfat (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% natrium deoxycholat, 10 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF, 10 ug /ml leupeptin) og derefter centrifugeret ved 10.000 x g i 30 minutter for at opsamle supernatanten. Supernatanten blev fortyndet i 2 x SDS loading buffer og kogt. En ækvivalent mængde af proteiner fra hver prøve blev elektroforesebehandlet på 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til en Polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore, Bedford, MA). Derefter blev membranerne blokeret i ca. 2 timer ved stuetemperatur og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer. Efter vask med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% Tween 20 tre gange, hver gang i 5 minutter blev membranerne derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-koblet IgG som det sekundære antistof i yderligere 2 timer ved stuetemperatur. Membranerne blev derefter fremkaldt under anvendelse af ECL Detection Systems (Imaging Technology, Ontario, Canada). Antistofferne anvendt i denne undersøgelse omfattede: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-cyclin E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenin (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

Immunohistokemisk analyse

i korte træk blev vævssnit afvokset i xylen og rehydreret gennem graduerede ethanoler. Derefter sektionerne standset i 3% methanolisk peroxid i ca. 10 minutter for at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Ved højt tryk og temperatur i en autoklav blev dets immunoreaktivitet forøget i 0,1 M citratpuffer i 3 min. Vævssnit blev inkuberet med anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) og anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) i 120 minutter ved stuetemperatur. Ifølge producentens anvisninger, efter vask i phosphatbufret saltvand (PBS), blev vævene inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-Ig polymer som et andet antistof (Envision kit, Dako) i 20 min ved stuetemperatur. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret i harpiks mount. For at kvantificere PFTK1 og Ki-67-protein-ekspression, både omfanget af immunreaktivitet og intensiteten blev evalueret og afsluttet. Fem high-power felter blev valgt tilfældigt for hver sektion og mindst 300 celler blev talt pr felt. Til statistisk analyse af PFTK1, blev hvert objektglas evalueret under anvendelse af en semikvantitativ Pointsystemet for både intensiteten af ​​pletten og procentdelen af ​​positive maligne celler. Cellerne blev scoret som følger: 1 (≤25% tumor celler farvet), 2 (26% -50% tumor celler farvet), 3 (51% -75% tumor celler farvet), 4 (76% -100% tumorceller farvet). For tæthed evaluering: 1 svag farvning; 2 moderat farvning; 3 stærk farvning. Derefter multipliceres vi de to scoringer og klassificeret dem i to grupper: lav udtryk og høj ekspression. Som for statistisk analyse af Ki-67, 50% tumorceller farvet så lavt udtryk og ≥ 50% tumorceller farvet som high udtryk. For at undgå tekniske fejl, blev farvning gentaget tre gange, og lignende resultater blev opnået.

cellekulturer og transient transfektion

MGC803 og HGC27 var gastriske cellelinier, som blev købt fra cellen biblioteket af det kinesiske Academy of Sciences. Begge blev dyrket i RPMI-1640 medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). SGC7901 og GES1 var en anden gastrisk cellelinjer, som venligt blev leveret af Patologisk Institut Forskning Nantong Universitet. SGC7901 og GES1 blev dyrket i DMEM-medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). Alle mediet blev fremstillet med 10% føtalt bovint serum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin-streptomycin-blanding (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), ved 37 ° C og 5% CO

2. PFTK1 små interfererende RNA (siRNA) blev designet og syntetiseret ved Shanghai Genechem (Kina). SiRNA targeting PFTK1 sekvenser var som følger: 5′-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ‘, 5′-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3′, 5’-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ‘, 5′-ACCCATACAGGAAATCCAA-3’. Den Flag-PFTK1 plasmid blev købt fra Shanghai Genechem (Kina). Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Life Technologies) blev anvendt til celler transfektion efter producentens anvisninger.

Flowcytometrisk analyse

For det første blev alle gastriske cellelinjer fikseret i 70% ethanol natten over ved -20 ° C. sekund, efter vasket ved citratphosphatpuffer og PBS blev cellerne inkuberet med 1 mg /ml RNaseA i 30 minutter ved 37 ° C. Derefter blev cellerne farvet med 50 pg /ml propidiumiodid i phosphatpufret saltvand (PBS) -Triton i yderligere 20 minutter ved 4 ° C. Endelig blev cellerne analyseret ved anvendelse af en Becton Dickinson flowcytometer BD FACScan (San Jose, CA) og CellQuest erhvervelse analyse programmer. Eksperimentet blev udført tre gange.

kolonidannelse assays

MGC803 celler blev dyrket i seks-brønds dyrkningsplader (Corning Inc, Corning NY) ved en densitet på 200 celler /brønd efter transfektion PFTK1 #siRNA og Flag-PFTK1 ifølge producentens anvisninger. Efter to uger blev cellekolonier (≥ 50 celler /koloni) tælles ved farvning med 0,5% krystalviolet.

celleproliferation assays Salg

MGC803 celler som omfattede normal, transfektion af PFTK1 # siRNA og Flag-PFTK1 podedes på 96-brønds cellekultur klynge-plader (Corning Inc, Corning NY) ved en densitet på 2 x 10

4 celler /brønd i 100 pi kultur og dyrket natten over. Ifølge producentens instruktioner, blev cellerne målt under anvendelse af et kommercielt CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). CCK-8 reagenser blev tilsat til hver brønd i 2 timer inkubation ved 37 ° C. Absorbansen blev aflæst ved en bølgelængde på 450 nm i en automatiseret pladeaflæser. Forsøgene skal gentage mindst tre gange.

sårheling assay

MGC803 celler blev dyrket i seks-brønds dyrkningsplader (Corning Inc, Corning NY) ved en densitet på 5 x 10

5 celler /brønd og dyrket til konfluens natten over. Efter transficeret 48 timer blev celler inkuberet med serumfrit medium. En linje blev ridset i Conflent cellelag hjælp af fie slutningen af ​​en 10 ml pipettespids (tid 0), og celler blev vasket med PBS. Billeder af migrerende celler blev sekventielt taget efter 24 timer, 48 timer under lukning af såret region.

Trans-brønd migration assay

Cell migration assay blev udført under anvendelse af trans-brønd kammer (8,0 lm porestørrelse ; Costar, Cambridge, NY, USA). Ca. 1 x 10

5 celler /ml blev podet i de øvre kamre i medium, og RPMI-1640 blev sat til de nederste kamre. Efter 24 timer blev de øverste celler, som ikke blev migreret fjernet og de nederste celler, som blev migrerede blev fikseret med paraformaldehyd og farvet med krystalviolet. Antallet af migrerende celler i 5 felter blev talt under 200 × forstørrelse, og midlerne til hvert kammer blev bestemt. Alle forsøg blev gentaget tre gange

Trans-brønd invasion assay

Cell migration assay blev udført under anvendelse af trans-brønd kammer (8,0 lm porestørrelse, Costar, Cambridge, NY, USA).. BD MatrigelTM basalmembranmatrix blev tilsat til det øvre kammer i 1 time ved 37 ° C. Derefter blev 500 pi medium indeholdende kemotaktisk faktor anbragt i det nedre kammer. Ca. 1 x 10

5 celler /ml blev podet i de øvre kamre ved 37 ° C i 24 h.Cells blev derefter fikseret med paraformaldehyd og farvet med krystalviolet. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS statistik 19 softwarepakke. Den PFTK1, Ki-67 udtryk og de clinicopathologic funktioner blev analyseret ved hjælp af χ

2 test. Total overlevelse kurver blev beregnet med Kaplan-Meier-metoden og blev testet med log-rank test. Multivariat analyse blev analyseret Cox ‘proportionale farer model, er risikoen ratio med og dens 95% konfidensinterval blev registreret for hver markør. Værdierne blev udtrykt som gennemsnit ± SE, og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

PFTK1 er overudtrykt i gastrisk tumorvæv

Det forlyder, at PFTK1 er en vigtig cyclin kinase, som kan regulere cellecyklus, men forskningen i mavekræft er aldrig blevet undersøgt. Da overekspression af PFTK1 blev fundet i leverkræft og esophageal cancer sammenlignet med normale væv. Så det er interessant at analyse ekspressionen af ​​PFTK1 i gastriske tumorvæv og dens coorelation med prolifererende cellekerneantigen (PCNA). Først undersøgte vi ekspressionen af ​​PFTK1 i 8 par gastriske tumorvæv og deres tilsvarende nontumorous gastriske mucosale væv ved Western blot. Som vist i figur 1, sammenlignet med tilstødende normale væv blev opregulering af PFTK1 detekteret i alle otte gastriske væv i overensstemmelse med PCNA. For at bekræfte den kliniske betydning af PFTK1 i gastrisk cancer progression, analyser immunhistokemisk (IHC) blev anvendt til at observere ekspressionen af ​​PFTK1 protein i 161 mavekræft væv. Som forventet blev udtryk for PFTK1 og tumor kvalitet negativt relateret. PFTK1 havde en signifikant højere udtryk i dårligt differentierede prøver end i godt differentierede prøver, hvilket var i overensstemmelse med Ki-67. PFTK1 blev udtrykt i cellemembranen, mens cytoplasma, Ki-67 hovedsagelig i kernen. Resultatet blev vist i FIG 2. Derefter undersøgte vi sammenhængen mellem PFTK1 og Ki-67 af Pearsons korrelationskoefficient. Vi kan se i figur 3A, at PFTK1 var positivt associeret med Ki-67 (Pearsons γ = 0,833,

P

0,001)

(A) Proteinet niveau PFTK1 var høj i. otte repræsentative parrede prøver af gastrisk cancer væv (T) i forhold til nontumorous tilstødende væv (N). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (B) Søjlediagrammet viste at forholdet mellem PFTK1 protein til GADPH. Middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. (*

P

0,05 sammenlignet med kontrol nontumorous tilstødende væv).

(A-H) Paraffinembedded vævssnit blev farvet med antistoffer for PFTK1 og Ki-67 og modfarvet med hæmatoxylin. (A, E) negativ farvning af PFTK1, Ki-67 i tilstødende normale væv (× 200); (B, F) svag farvning af PFTK1, Ki-67 i godt differentierede gastrisk kræft væv; (C, G) moderat farvning af PFTK1, Ki-67 i moderate differentierede gastrisk kræft væv; (D, H) stærk farvning af PFTK1, Ki-67 i fattige differentierede gastrisk kræft væv, forstærkning (× 100, × 400).

(A) Sammenhæng mellem PFTK1 og Ki-67-ekspression i mavekræft tissues.The korrelation mellem PFTK1 og Ki-67-ekspression blev vurderet ved Pearson korrelation test (r = 0,833,

P

0,001). (B) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af 161 mavecancerpatienter baseret på PFTK1 ekspressionsniveau. Ifølge PFTK1 procenter, blev patienterne opdelt i høje PFTK1 expressers og lave PFTK1 expressers. Og median overlevelse tid og hazard ratio blev vist. Patienter i høj udtryk PFTK1 gruppe havde en signifikant kortere samlet overlevelse (

P

0,01).

PFTK1 er forbundet med uønskede kliniske karakteristika og dårlig gastrisk tumor patienternes overlevelse

Klinisk forening undersøgelse blev udforsket for at analysere sammenhængen af ​​PFTK1 med gastrisk kræft klinisk-patologiske træk blandt 161 væv. De klinisk-patologiske data blev anført i tabel 1. Høj udtryk for PFTK1 var relateret med tumor bedømmelse (

P

= 0,009), infiltration dybde (

P

= 0,002), lymfeknude invasion (

P

= 0,000) samt Ki-67 (

P

= 0,000). Men der var ingen korrelation mellem PFTK1 udtryk og andre kliniske variabler, såsom alder, køn, nerve invasion, og TNM stadie.

Desuden blev Kaplan-Meier-analyse anvendes til at analysere sammenhængen mellem PFTK1 udtryk og 161 patienternes overlevelse. Ifølge overlevelseskurverne blev høj ekspression af PFTK1 tydeligvis korreleret med dårlig samlet overlevelse, mens lav udtryk for PFTK1 var korreleret med bedre samlet overlevelse. Og median overlevelse tid og hazard ratio blev vist i fig 3B. Desuden univariat analyse i mavekræft væv viste, at tumor bedømmelse (

P

= 0,020), infiltration dybde (

P

= 0,011), lymfeknude invasion (

P

= 0,011), TNM stadie (P = 0,031), PFTK1 udtryk (

P

= 0,002), og Ki-67-ekspression (

P

= 0,013) var prognostiske faktorer af samlet overlevelse (tabel 2 ). Multivariat analyse ved hjælp af Cox ‘proportionale farer model foreslog PFTK1 var en uafhængig prognostiske indikatorer for patienternes samlede overlevelse (

P

= 0,048, tabel 3). For at opsummere, vores resultater viste, at ekspressionen af ​​PFTK1 er signifikant associeret med kliniske karakteristika og dårlig samlet overlevelse.

Udtrykket af PFTK1 i ikke-transficerede og transfekterede gastriske kræftceller

Som PFTK1 er overudtrykt i gastrisk tumorvæv, derefter analyseret vi udtryk for PFTK1 i cellelinjer, herunder MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. Fra fig 4A, ekspressionen af ​​PFTK1 i normal gastrisk cellelinie var GES1 lavere end i gastriske cellelinier MGC803, SGC7901, HGC27. For yderligere at undersøge funktionen af ​​PFTK1 i gastriske kræftceller

in vitro,

MGC803 celler blev transficeret med PFTK1-siRNA og SGC7901 celler blev transficeret med Flag-PFTK1. Western blot blev anvendt til at måle PFTK1 ekspression. Når Flag-PFTK1 blev transficeret i SGC7901, PFTK1 havde en højere udtryk (figur 4B). Mens PFTK1-siRNA blev transficeret i MGC803, PFTK1-siRNA # 4 opnået den højeste knockdown effektivitet sammenlignet med andre PFTK1-siRNA (Fig 4C). Så vi valgte Flag-PFTK1 og PFTK1-siRNA # 4 for at fortsætte de følgende forsøg.

(A) PFTK1 proteinniveauet i SGC7901, MGC803, HGC27, GES1 gastrisk cellelinjer. (B) SGC7901 celler blev transient transficeret med Flag-PFTK1 plasmid som beskrevet ovenfor i 48 timer. Western blot analyse ektopisk ekspression af PFTK1. (C) MGC803 celler blev transient transficeret med PFTK1-siRNA # 1, 2, 3, 4 i 48 timer. Western blot-analyse knockdown ekspression af PFTK1. Søjlediagrammet viser forholdet mellem PFTK1 protein til GADPH. Middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. (*

P

0,05)

PFTK1 kan fremme celler migrere og invasive

in vitro

Det er rapporteret PFTK1 overekspression kan. øge cad phosphorylering og forbedre CAD til at binde til F-aktinerne, der fremmer hepatocellulært migration carcinomaceller [16]. Eftersom PFTK1 var relateret til lymfeknude invasion i gastrisk cancer prøver, studerede vi, om PFTK1 kunne påvirke gastrisk migration og invasion cancerceller. Sårheling assay og transwell analyser viste, at migrationen af ​​Flag-PFTK1 celler især blev øget i sammenligning med kontrol celler. Tværtimod blev migreringen af ​​PFTK1-siRNA # 4 celler reduceret i forhold til kontrolceller (fig 5A og 5B). Endvidere Matrigel invasion assays viste også, at opregulering af PFTK1 ved transficere Flag-PFTK1 kunne rykke den invasive evne, og knockdown af PFTK1 kunne dæmpe den invasive evne gastriske cancerceller (fig 5C). Samlet set kunne vi komme til en konklusion, at PFTK1 fremme migration og invasion af gastriske kræftceller.

(A) Migration af celler transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4was undersøgt ved sårhelende analyser . Såret af celler blev visualiseret ved 0 timer, 24 timer og 48 timer. (B) Cellemigration transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 blev undersøgt ved trans-godt-analyser. (C) Cellen invasive evne transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 blev undersøgt med Matrigel cellekultur kamre. Den venstre del viste MGC803 celler transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1. Den højre del viste MGC803 celler transficeret med Ctrl, PFTK1-siRNA # 4. Middel ± SD af tre uafhængige forsøg (*

P

0,05). Disse resultater viser overekspression af PFTK1 kan forbedre celler migration og invasion, mens knockdown PFTK1 reducere celler migration og invasion.

Angivelse af PFTK1 fremme udbredelsen af ​​gastriske kræftceller

Ifølge resultaterne præsenteret ovenfor blev PFTK1 positivt korreleret med PCNA, Ki-67-ekspression og tumor kvalitet, der var celler proliferationsmarkør. Vi analyserer rolle PFTK1 om regulering spredning evne. Først blev MGC803 celler transficeret med PFTK1-siRNA # 4, Flag-PFTK1 og blev bestemt CCK-8 assay. Overekspression af PFTK1 demonstrerede at øge gastrisk celler vækstrate end kontrol, mens knockdown af PFTK1 viste det modsatte resultat (figur 6A). I overensstemmelse med forøgelse cellevæksthastigheden efter PFTK1 overekspression, kolonidannende assay viste også, at det kunne øge kolonidannelse. Og knockdown af PFTK1 viste det samme resultat med CCK-8 assay (Fig 6B). Endelig undersøgte vi spredning mekanisme PFTK1 ved flow cytometrisk analyse, og data antydede, at flere gastriske cancerceller blev fundet i S-fasen i nærværelse af ektopisk PFTK1 blev mindre gastriske cancerceller findes i S-fasen i transfektion med PFTK1- siRNA # 4 (fig 6C). For at opsummere, viste disse data, at PFTK1 deltog i celle cyklus regulering ved at fremskynde G0 /G1 -S overgang.

(A)

In vitro

Cell Counting Kit (CCK) -8-assay blev anvendt at examin vækst celler ved absorbans ved 450 nm på det angivne tidspunkt. (Al data er middel ± SD fra tre uafhængige forsøg *

P

. 0,05) (B) Colony dannelse analyse af MGC803 celler transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1, PFTK1-siRNA 4 #. (C) Cell cyklus analyse blev vist efter transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 ved flowcytometri. Flag-PFTK1 celleantal blev reduceret i G0 /G1-fasen og den tilsvarende forøgelse blev observeret i S-fase sammenligne med Ctrl. Den PFTK1-siRNA # 4 celle nummer blev øget i G0 /G1 fasen og den tilsvarende reduktion blev observeret i S-fasen sammenligne med Ctrl. Den venstre del viste MGC803 celler transficeret med Ctrl, Flag-PFTK1. Den højre del viste MGC803 celler transficeret med Ctrl, PFTK1-siRNA # 4. Disse resultater viser overekspression af PFTK1 kan øge celler spredning, mens knockdown PFTK1 reducere celler spredning.

Signalet pathway af PFTK1 at fremme spredning og migration

For yderligere at studere den mekanisme, som PFTK1 regulerede gastriske cancerceller proliferation, migration, invasion, besluttede vi at detektere det beslægtede protein ændres ved Western blot når PFTK1 blev overudtrykt eller knockdown i MGC803. Som rapporteret, kunne PFTK1 aktivere noncanonical Wnt signalering i hepatocellulært carcinom [17]. Wnt signalering var relateret med tumorer proliferation og migration. Opregulering af PFTK1 delvis aktiveret Dvl2, Naked1, MMP2 og forhøjede ekspressionen af ​​cellecyklus regulator cyclin E, men ikke ændret Dvl1, β-catenin. Hvad mere er, fandt vi, at knockdown af endogen PFTK1 udtryk kunne falde Dvl2, Naked1, MMP2, cyclin E udtryk, men ikke ændret Dvl1, β-catenin (fig 7).

Virkningerne af PFTK1 på ekspressionen af cyclin E, PCNA, MMP2, Wnt relaterede pathways, såsom β-catenin, Dvl1, Dvl2, Naked1 ved Western blot. Forøgelse PFTK1 ekspression promted ekspressionen af ​​cyclin E, PCNA, Dvl2, Naked1, MMP2, men ikke havde ændret ekspression af β-catenin, Dvl1. Mens banker ned endogen PFTK1 udtryk viste det modsatte resultat.

Diskussion

Som en af ​​de højeste forekommende kræftformer i verden, den fem-års overlevelse på mavekræft er mindre end 20% -25% i USA, Europa og Kina på grund af let at tilbagefald og høj metastaser sats i postoperative [2]. Helicobacter pylori infektion, ændring af onkogen og tumorsuppressorgener, er reguleringen af ​​cellecyklus og telomerase aktivering forbundet med mavekræft [21]. Unormal cellecyklus regulering i udviklingen af ​​mavekræft har været emnet for forskning i de senere år. Nøjagtig og streng regulering af cellecyklus afhænger nogle kontrol faktorer, herunder cellecyklus kinase (CDK’er), cellecyklus protein (Cycliner), og cellecyklus kinase hæmmere (CKIs). Alle er bekendt med 11 klassiske CDK’er (CDK1-11), PFTK1 som en ny cellecyklusafhængig kinase er fundet ikke sammen og forbindelsen mellem PFTK1 og kræft er ikke meget, også i gastrisk kræft [22].

PFTK1 blev oprindeligt fundet i nervesystemet hos rotter [23]. PFTK1 modulerer oligodendrocyt differentiering via PI3K /AKT-vejen [13]. Den nyeste forskning rapporterede, at PFTK1 er opreguleret i human kræft i spiserøret, hepatocellulært carcinom og associerede virksomheder med tumorvækst, migration og invasion [14,24]. I vores undersøgelse har vi undersøgt, om ekspressionen af ​​PFTK1 var involveret i gastrisk kræftceller spredning, migration og invasion. Først demonstrerede vi, at PFTK1 udtrykte højere i gastrisk cancer væv end i tilstødende nontumor væv ved Western blot, at der i overensstemmelse med resultaterne i andre cancere (Fig 1). Efterfølgende viste immunhistokemi høj ekspression af PFTK1 var relateret med tumorklassificering, infiltration dybde, lymfeknude invasion samt Ki-67 i 161 gastriske cancervæv. Disse fund bedt PFTK1 kan påvirke mavekræft spredning og migration. Kaplan-Meier-analyse afslørede, at PFTK1 forudsagt dårlig total overlevelse (Fig 3B). Multivariat analyse ved hjælp af Cox ‘proportionale farer model foreslog PFTK1 var en uafhængig prognostiske indikatorer for patienternes samlede overlevelse. For yderligere at forstå den regulerende virkning af PFTK1 på mavens celler blev MGC803 celler transficeret med PFTK1-siRNA # 4, Flag-PFTK1

in vitro

(Fig 4). Figur 6 viste PFTK1 kunne fremme proliferation af CCK-8, kolonidannende assay. Samtidig, PFTK1 øget transformation G1-S fasen ifølge flowcytometrisk, hvilket faldt sammen med konstateringen af ​​PFTK1 i hepatocellulært carcinom [10]. Cyclin E var en af ​​de vigtige regulatoriske faktorer under G1-S transformation fase og cyclin E-proteinet kunne definere som en prognostisk faktor for patienter med mavekræft [25]. Interessant nok blev PFTK1 niveau forøget efter transfektion med Flag-PFTK1 consistented med PCNA, MMP2 og cyclin E (Fig 7).

Derudover har vi også undersøgt, om PFTK1 kan påvirke celler migration og invasion evne ved sårheling assay og transwell assays. Resultaterne viste, at overekspression af PFTK1 kunne forbedre celler migration og invasion, som kan skyldes en ændring af nedstrøms for PFTK1 signalveje (Fig 5). Som rapporteret i leverkræft, PFTK1 og /eller CCNY alene kunne aktivere ikke-kanoniske Wnt signalering forårsager celler migration og invasion [17]. Wnt veje omfattede den kanoniske Wnt /β-catenin signalering og ikke-kanoniske Wnt signalering måde (Wnt /Ca

2+ og Wnt /PCP). Wnt signalering måde spillede en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft og regulerede celler spredning, migration og invasion [26]. Efterfølgende fandt vi ekspressionen af ​​proteiner β-catenin, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 og Naked1 var positivt korreleret med PFTK1 og kanoniske Wnt /β-catenin beslægtede proteiner p-catenin havde Dvl1 ikke ændret (fig 7).