PLoS ONE: Klorokin Forbedrer Gefitinib Cytotoksicitet i Gefitinib-Resistant ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er), herunder gefitinib, er effektive til ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter med

EGFR

mutationer. Men disse patienter med tiden udvikle resistens over for EGFR-TKI. Målet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge inddragelsen af ​​autofagi i gefitinib modstand. Vi udviklede gefitinib-resistente celler (PC-9 /GEF) fra PC-9 celler (indeholdende exon 19 sletning

EGFR

) efter lang tids udsættelse i gefitinib. PC-9 /GEF celler (B4 og E3) var 200 gange mere resistent over for gefitinib end PC-9 /wt celler. Sammenlignet med PC-9 /wt celler, både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler viste højere basale LC3-II niveauer, som blev hæmmet af 3-methyladenin (3-MA, en autophagy inhibitor) og forstærkes af chloroquin ( CQ, en hæmmer af autophagolysosomes dannelse), hvilket indikerer forhøjet autophagy i PC-9 /GEF celler. 3-MA og CQ-koncentration-afhængigt hæmmede celle overlevelse både PC-9 vægt og PC-9 /GEF celler, hvilket antyder, at autophagy kan være pro-overlevelse. Desuden gefitinib øget LC3-II niveauer og autolysosome dannelse i både PC-9 /wt celler og PC-9 /GEF celler. I PC-9 /wt celler, CQ forstærkede cytotoksicitet ved lav gefitinib (3 nM). Desuden CQ overvandt den erhvervede gefitinibs modstand i PC-9 /GEF celler ved at øge gefitinib-induceret cytotoksicitet, aktivering af caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase spaltning. Ved anvendelse af en

in vivo

model xenografting med PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 celler, oral indgivelse af gefitinib (50 mg /kg) fuldstændigt hæmmede tumorvækst af PC-9 /vægt, men ikke PC -9 /gefB4cells. Kombination af CQ (75 mg /kg, i.p.) og gefitinib var mere effektivt end gefitinib alene reducere tumorvækst af PC-9 /gefB4. Vores data tyder på, at hæmning af autophagy kan være en terapeutisk strategi for at overvinde erhvervet resistens af gefitinib i

EGFR

mutation NSCLC patienter

Henvisning:. Tang MC, Wu MY, Hwang MH, Chang YT, Huang HJ, Lin AM-Y, et al. (2015) Klorokin Forbedrer Gefitinib Cytotoksicitet i Gefitinib-Resistente ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10,1371 /journal.pone.0119135

Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: May 1, 2014 Accepteret: 26 januar 2015; Udgivet: 25 Mar 2015

Copyright: © 2015 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Autophagy, kendt som en selvstændig spiser mekanisme, er kendetegnet ved de novo syntese dobbelt-membran autophagosomes som sekvestrerer cellulære komponenter såsom overdreven eller unødvendig protein og organeller [1-3]. Fusion af autophagosomes med lysosomer sigende nedbryder cytosoliske indhold i essentielle komponenter til recirkulation. Fysiologisk, et basalt niveau af autofagi er afgørende for den cellulære homeostase. Desuden er autofagi sigende foranlediget til at håndtere stress, såsom hypoxi samt næringsstof afsavn og betragtes som en overlevelsesstrategi [1-3]. I modsætning hertil er en pro-død rolle autophagy foreslået som en type II programmeret celledød gennem over-aktivering af selv-spise [4]. Faktisk fandtes autofagi induktorer at reducere tumor volumen [5-7]. Men hæmning af autofagi angiveligt induceret celledød [8-10], hvilket antyder, at autofagi spiller en cytobeskyttende rolle for cancerceller. Til støtte for dette begreb, autophagy inhibering med 3-methyladenin (3-MA), chloroquin (CQ, en lysosomotropiske middel til inhibering autophagolysosome dannelse) og autofagi (ATG) -relateret gen 5 silencing viste sig at forøge de cytotoksiske virkninger af kemoterapier og målterapi [11-16]. Derfor autophagy bliver et potentielt mål for kræftbehandling.

Lægemiddelresistens har været fokus på interesse i studiet af kræftbehandling. Flere linjer af beviser har foreslået inddragelse af autophagy i resistens, både medfødt resistens og erhvervet resistens. For eksempel har CQ vist sig at overvinde den primære modstand epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) i A549 lungecancerceller [16] og trastuzumab i HER-2 positiv brystkræft [17]. Adskillige

in vitro

undersøgelser har vist, at CQ og bafilomycin A1 genoprette følsomhed over for crizotinib og trastuzumab i erhvervet resistente celler henholdsvis [18-19]. Endvidere blev 3-MA sig at forøge den cytotoksiske virkning af cisplatin i cisplatin-resistente celler [20], hvilket indikerer, at inhibering af autofagi synes at være et terapeutisk mål for erhvervet lægemiddelresistens.

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige cancer i verden. For øjeblikket, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), herunder gefitinib, erlotinib og afatinib, er yderst effektive til behandling af lungekræftpatienter specifikke

EGFR

mutationer i deres tumorprøver, såsom exon 19 deletion eller exon 21 L858R mutation [21-23]. Trods succesen med at bruge EGFR-TKI’er i behandling for Østasiatisk NSCLC patienter, alle responderende patienter til sidst udviklede erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er [24-27]. I den foreliggende undersøgelse, inddragelse af autophagy i den erhvervede gefitinibs resistens i

EGFR

mutation NSCLC celler blev undersøgt ved hjælp af PC-9 /wt celler, som bærer

EGFR

exon 19 sletning og den erhvervede gefitinib- resistente PC-9 /GEF celler (PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3).

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

De anvendte kemikalier var gefitinib (en venlig gave fra Astrazeneca, Alderley Park, UK), chloroquin-diphosphat (CQ; Sigma, St. Louis, MO, USA), 3-methyladenin (3-MA, Sigma), og Cremophor EL (Sigma). De primære antistoffer omfattede mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, # 2775), caspase 3 (Cell Signaling Technology, # 9668), og PARP (Cell Signaling Technology, # 9542) , α-tubulin (Cell Signaling Technology, # 2144) og β-actin-antistof (Millipore, Bedford, MA, USA). De sekundære antistoffer var peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært IgG (Chemicon, Temecula, Californien, USA).

Udvikling af gefitinib-resistent PC-9 celler

PC9 /gefB4 og PC9 /gefE3 celler udviklet i vores laboratorium og offentliggjort tidligere [26]. PC-9 /vægt celler, en human lunge-adenocarcinom-cellelinje, der huser en deletion i exon 19 i

EGFR

[28], blev dyrket i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -medier indeholdende 10% føtalt bovint serum, 4,5 g /l glucose og 1% (v /v) penicillin /streptomycin. PC-9 /vægt celler blev dyrket i dyrkningsmedier indeholdende stigende koncentrationer af gefitinib. Efter 6 måneders passager blev celler, der kan vokse i mikromolære koncentrationer af gefitinibs holdes i stoffri medier i 2 uger og blev klonet. To kloner (PC-9 /gefB4, og pc-9 /gefE3) blev opnået for fremtidige undersøgelser.

Vækst inhiberingsassay

De stamopløsninger af gefitinib og 3-MA blev fremstillet dimethyl sulfoxid mens CQ var i ddsH

2O. Femten hundrede celler blev anbragt i 96-brønds fladbundede plader og dyrket i 24 timer. At etablere IC

50 af gefitinib, forskellige koncentrationer af gefitinibs blev inkluderet i dyrkningsmediet i 96 timer. Brug af sulforhodamin B-assay [29], blev cellelevedygtighed bestemt ved at dividere absorbansværdierne af behandlede celler med den for ubehandlede celler. IC

50 beregnet ud fra koncentrations-respons-kurven blev defineret som den koncentration af gefitinib som 50% vækstinhibering blev opnået. For virkningerne af 3-MA og CQ blev vækstinhibering målt efter 96-timers inkubation af 3-MA (0,1, 0,3 eller 1 mM) eller CQ (5, 10 eller 15 uM). For effekten af ​​CQ på gefitinib-induceret celledød, blev bestemt den vækstinhibering efter 96-timers inkubation af gefitinib plus CQ (5 eller 10 uM).

Western blot assay af proteiner

at evaluere inddragelse af autophagy af PC-9 /vægt og gefitinib-resistente celler blev celler behandlet med gefitinib plus 3-MA eller CQ i 24 timer. Behandlede celler blev høstet, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), og lyseret i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) lysepuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1% (v /v) NP-40, 1% (vægt /v) natriumdeoxycholat, 1 mM Ethylenediaminetetraacetates (EDTA), 0,1% (vægt /volumen) natriumdodecylsulfat polyacrylamid (SDS) og 0,01% (vægt /volumen) natriumazid (pH 7,5) i 20 minutter på is. Lysater blev derefter centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 min, og proteinkoncentrationer supernatant blev bestemt ved BCA Protein Assay Kit. Proteinprøver (30 ug) blev kørt på 12-13,5% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og derefter overført til en polyvinylidendifluorid (Bio-Rad, USA) ved 90 V i 120 minutter. Blots blev probet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter primære antistof inkubation blev membranen vasket og inkuberet med et sekundært antistof (1: 3000) i 1 time ved stuetemperatur. Immunreaktionen blev visualiseret under anvendelse af Amersham forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Efter denne opdagelse blev de bundne primære og sekundære antistoffer strippet ved inkubering af membranen i stripning puffer (100 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS) ved 50 ° C i 45 minutter. Membranen blev testet igen med et primært antistof mod β-actin (1: 5000) /α-tubulin (1: 5000).

Fluorescerende og immunfluorescensfarvning assay

Autolysosomes afsmitning: Celler blev behandlet med gefitinib i 24 timer og derefter blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 50 nM lYSOTRACKER Rød (LysoTR, lYSOTRACKER Red DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Bagefter blev cellerne skyllet i PBS og fikseret med 3,5% paraformaldehyd (i PBS) i 10 minutter, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i TBS i 30 minutter og behandledes med 2% BSA i TBS i 1 time ved stuetemperatur . Prøver blev derefter inkuberet med LC3 antistof (1: 200) natten over ved 4 ° C, skyllet tre gange med 0,01% Triton X-100 i TBS og inkuberet i 30 minutter med et sekundært antistof (FITC-konjugeret kanin IgG ved 1: 250 ) ved 37 ° C. Bagefter blev cellerne yderligere farvet med DAPI og observeret under en konfokal mikroskopi (Olympus FV1000, Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA).

xenotransplantat musemodel

Sixty- tre 6 -Uge gammel mand Balb /c nøgne mus, der vejer 25-30 g, blev anvendt. Dyret Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. (Tilladelse nummer: 2011-037) .Tumors blev induceret ved injektion PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 celler (10

7 celler i 100 pi PBS) subkutant ind i bagsiden af ​​mus. Til opnåelse kurven tumorvækst blev daglig måling af tumor udført. Vinkelret diameter med en digital skydelære og volumener blev beregnet ved (længde x bredde

2) /2. Når tumorerne voksede til 200 mm

3, mus blev randomiseret til 4 grupper oralt behandlet med vehikel (10% Cremophor EL /10% ethanol /4% dextrose i ddH

2O), gefitinib alene (50 mg /kg, af en sonde), CQ alene (75 mg /kg, ip) og gefitinib plus CQ. Gefitinib blev fremstillet i 10% Cremophor EL /10% ethanol /4% dextrose og CQ blev opløst i PBS.

Statistik Salg

Alle data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. Statistiske sammenligninger af cellelevedygtighed blev lavet ved hjælp Uafhængige-Samples T Test af SPSS. P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Forhøjet basal autophagy i PC-9 /GEF celler

At studere autofagi og resistens, niveauet af LC3-II, et kendetegn protein på autofagi, blev målt i PC-9 /wt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler. Western blot-assay viste højere basale niveauer af LC3-II i PC-9 /GEF celler (B4 og E3), mens sammenlignet med pc-9 /wt celler (Fig. 1A). I overensstemmelse med Western blot assay immunfarvning undersøgelse påviste mere LC3 immunfluorescerende puncta i PC-9 /gefB4 celler sammenlignet med PC-9 /wt celler (fig. 1B). Desuden blev 3-MA og CQ ansat til at karakterisere autofagi. Vi fandt, at 3-MA faldt (fig. 1C), mens CQ øgede basale LC3-II niveauerne i PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 celler og PC-9 /gefE3 efter 24-h lægemiddelbehandlinger (fig. 1D ). Disse data indikerer, at PC-9 /gef (B4 og E3) celler har en højere basalt autophagy end PC-9 /wt celler. Endvidere blev celleoverlevelse assay anvendes til at afgrænse rollen som autofagi anvendelse af 3-MA og CQ. SRB-assay viste, at 3-MA og CQ koncentrationsafhængigt reduceret celleoverlevelse i PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler (Fig. 2), hvilket antyder, at autofagi spiller en pro-overlevelse rolle i celleproliferation.

(A) Repræsentative Western blot data viste de basale LC3-II niveauer i PC-9 /vægt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). (B) immunfluorescensfarvning blev udført ved hjælp af LC3 antistof at vise LC3 puncta i PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 celler. (C og D): PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler blev behandlet med 3-methyladenin (3-MA, 10 mM) og chloroquin (CQ, 1 og 10 uM) i 24 h. Totalt protein af behandlede celler blev høstet; LC3-I og II-niveauer blev analyseret med Western blot-assay. Hver bane indeholdt 30 ug protein for alle forsøg. Resultater blev gentaget i uafhængige forsøg.

PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler blev behandlet med (A) 3-MA (0,1-1 mM) og (B) CQ (5-15 uM) i 96 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse SRB-assay. Værdier er gennemsnittet ± S.E.M. (N = 3). *

P

0,05 statistisk signifikante i 3-MA eller CQ-behandlede grupper sammenlignet med kontrollerne.

Gefitinib-induceret autophagy

in vitro

Inddragelse af autofagi i gefitinib-induceret cytotoksicitet blev undersøgt. Western blot analyse viste, at gefitinibs koncentration-afhængigt øgede LC3-II niveauer i PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler (Fig. 3A). Immunfluorescensfarvning studier viste, at 24-timers inkubation af gefitinib (1 uM) forhøjet LC3 puncta i både PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 celler (fig. 3B). Endvidere blev co-lokalisering af LC3 immunofluorescens og LysoTR fluorescens observeret i gefitinib-behandlede PC-9 /WT og PC-9 /gefB4 celler (fig. 3B), hvilket indikerer, at gefitinib er stand til at inducere autofagi og autolysosome formationen.

(A) PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler blev behandlet med gefitinib (nM) ved forskellige koncentrationer i 24 timer. Totalt protein af behandlede celler blev høstet; LC3-I og II-niveauer blev analyseret med Western blot-assay. Hver bane indeholdt 30 ug protein for alle forsøg. Resultater blev gentaget i uafhængige forsøg. (B) PC-9 /vægt PC-9 /gefB4 celler blev behandlet med gefitinib (1 uM) i 24 timer. Immunfluorescensfarvning og Fluorescensfarvninq undersøgelser blev udført under anvendelse LC3 antistof og LYSOTRACKER rød (LysoTR) henholdsvis at vise puncta i cellerne. Green, FITC-mærket LC3; rød, LysoTR; blå, DAPI-mærket kerne.

På grund af gefitinib-forhøjet autofagi, virkningen af ​​CQ på gefitinib-induceret cytotoksicitet blev undersøgt. Fireogtyve timer efter medicinsk behandling, CQ yderligere øget gefitinib-induceret LC3-II niveauerne i PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 celler (Fig. 4A). Celleoverlevelse undersøgelser viste, at gefitinib (100 nM) alene inducerede dybtgående celledød af PC-9 /wt celler; dog CQ (5 og 10 uM) var ude af stand til yderligere at forstærke gefitinib-induceret cytotoksicitet (fig. 4B). Som til PC-9 /gefB4 celler, gefitinib (100 nM) alene inducerede en svag celledød; CQ signifikant forstærkede den gefitinib-induceret cytotoksicitet (fig. 4C), dvs. CQ overvandt gefitinib resistens i PC-9 /gefB4 celler. For yderligere at teste potensering af CQ i PC-9 /vægt celler, lav dosis af gefitinib (3 nM) blev anvendt. Mens 96-timers inkubation af gefitinib (3 nM) inducerede en ubetydelig cytotoksicitet i PC-9 /wt celler, co-inkubering med CK (10 nM) og gefitinib dybt reduceret celleoverlevelse (fig. 4D). CQ-induceret potensering af gefitinib-induceret cytotoksicitet blev yderligere undersøgt ved at måle apoptose-relaterede proteiner, herunder caspase-3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) niveauer. Vi fandt, at gefitinib (0,1 uM) inducerede apoptose ved at vise caspase 3-aktivering og PARP-spaltning i PC-9 /wt celler; CQ (10 uM) konsekvent ikke forøge gefitinib-induceret apoptose i PC-9 /wt celler (fig. 5). I modsætning hertil, når gefitinib eller CQ alene ikke var i stand til at inducere apoptose i PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler, CQ plus gefitinib signifikant induceret caspase 3-aktivering og PARP-spaltning i begge PC-9 /GEF celler (Fig. 5 ).

(A) PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 blev behandlet med gefitinib (100 nM) og chloroquin (CQ, 5, 10 uM) i 24 timer. Totalt protein af behandlede celler blev høstet. LC3-II niveauerne blev analyseret med Western blot-assay. Hver bane indeholdt 30 ug protein for alle forsøg. Resultater blev gentaget i uafhængige forsøg. (B) PC-9 /vægt og (C) PC-9 /gefB4 celler blev dyrket med gefitinib (100 nM) og CQ (5, 10 uM) i 96 timer. (D) PC-9 /wt celler blev dyrket med gefitinib (3 nM) og CQ (5, 10 uM) i 96 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse SRB-assay. Værdier er gennemsnittet ± S.E.M. (N = 3). *

P

0.05 statistisk signifikant i gefitinib eller CQ-behandlede grupper sammenlignet med kontrollerne; # P 0,05 statistisk signifikant i gefitinib plus CQ-behandlede grupper sammenlignet med gefitinib eneste grupper.

PC-9 /vægt, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler blev behandlet med gefitinib (100 nM ) og chloroquin (CQ, 10 uM) i 24 timer. Totalt protein af behandlede celler blev høstet. Procaspase 3, aktive caspase 3, PARP spaltningsprodukter niveauer blev analyseret med Western blot-assay. Hver bane indeholdt 30 ug protein for alle forsøg. Resultaterne blev gentaget i uafhængige forsøg.

Gefitinib plus CQ potenseret gefitinib-induceret anti-tumor aktivitet i PC-9 /gefB4 xenografter

CQ-induceret potensering af anti-tumor aktivitet af gefitinib blev yderligere undersøgt ved anvendelse nøgne Balb /c-mus med PC-9 /vægt PC-9 /gefB4 humane tumor-xenotransplantater (fig. 6). CQ alene ændrede ikke tumorvækst af PC-9 /wt og PC-9 /gefB4 humane tumorxenotransplantater (fig. 6). Sammenlignet med den vehikel-behandlede tumorvækst, gefitinib monoterapi inhiberede signifikant tumorvækst af PC-9 /wt xenotransplantater; Samtidig administration af CQ var ikke i stand til at forøge anti-tumor effekt af gefitinib i PC-9 /wt xenotransplantater (Fig. 6A). Den komplette hæmning af tumorvækst af PC-9 /wt xenografter varede indtil slutningen af ​​eksperimentet (fig. 6A). I modsætning hertil gefitinib ubetydeligt reduceret tumorvækst af PC-9 /gefB4 xenotransplantater sammenlignet med virkningen af ​​PC-9 xenotransplantater (figur 6B;. P = 0,07). PC-9 /gefB4 tumorer igen voksede efter 15 dage gefitinib administration (fig. 6B). Overraskende CQ plus gefitinib undertrykt signifikant tumorvækst på PC-9 /gefB4 xenotransplantater sammenlignet med gefitinib (Fig 6B; p. 0,05)

nøgne Balb /c mus med PC-9 /vægt (A. ) og PC-9 /gefB4 (B) xenotransplantater blev behandlet med køretøjer som kontrol (○, n = 4 til PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 henholdsvis), gefitinib (50 mg /kg /dag af en sonde , ◆ n = 5 for PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 henholdsvis), chloroquin (CQ, 75 mg /kg, ip ▲, n = 4 til PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4, henholdsvis), eller en kombination af begge (■, n = 5 for PC-9 /vægt og PC-9 /gefB4 henholdsvis) .Tumors lodes vokse til 200 mm

3 før lægemiddelbehandlinger. Værdier er gennemsnittet ± S.E.M. (N = 4-5). ** P 0,001, statistisk signifikant i gefitinib og gefitinib plus CQ grupper sammenlignet med køretøjet gruppe i PC-9 /vægt tumorxenoplantater. * P 0,05, statistisk signifikant i gefitinib plus CQ gruppen sammenlignet med køretøjet gruppe; # P 0,05 statistisk signifikant i gefitinib plus CQ gruppen sammenlignet med gefitinib alene i PC-9 /gefB4 tumorxenoplantater af uafhængige-Samples T Test. (C) Repræsentative data viser 4 mus med PC-9 /wt implanteret og 4 mus med PC-9 /gefB4 xenotransplantater, som blev behandlet med køretøj, CQ kun, gefitinib kun og gefitinib plus CQ.

diskussion

Autophagy og lægemiddelresistens

at udvikle terapeutiske strategier for erhvervet resistens induceret af gefitinib, vi brugte PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler, som besidder IC

50 af gefitinib ca. 200 gange mere end den for PC-9 /wt celler [26]. Western blot assay og immunfluorescent undersøgelse viste højere basale niveauer af autophagy i både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler. Brug 3-MA og CQ at forringe dannelse og funktion af autophagy, foreslås mekanismen for den forhøjede basal autophagy i gefitinib-resistente celler. For at klare ugunstige påvirkninger, det vil sige konstant udsættelse for gefitinib, kræftceller øget autofagi at opretholde metabolisk homeostase og passende cellevækst [4]. Cellernes levedygtighed assay viste, at autophagy var pro-overlevelse, fordi 3-MA og CQ faldt celleoverlevelse af PC-9 /vægt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). Foruden gefitinib modstand har tidligere undersøgelser rapporteret, at trastuzumab-refraktære brystcancerceller og cisplatin-resistente lungecancerceller har højere autofagi forhold til de følsomme cancerceller [19-20]. Tilsvarende blev 3-MA og bafilomycin A1 (en hæmmer af autolysosome modning) sig at reducere cellelevedygtighed af disse resistente celler [19-20]. I modsætning til 200-fold forskel i IC

50 af gefitinib [26], 3-MA og CQ induceret celledød i et tilsvarende omfang i PC-9 og PC-9 /GEF celler, hvilket indikerer PC-9 /gefB4 celler ikke var resistente over for 3-MA og CQ-induceret cytotoksicitet.

rolle autofagi i gefitinib-induceret cytotoksicitet

Forskellige behandlinger, herunder strålebehandling [20], kemoterapi [30] og målrette behandlinger [16, 31] er blevet rapporteret at inducere autofagi. Vores undersøgelse bekræftede denne opfattelse, at gefitinib øget autofagi i en koncentrationsafhængig måde i PC-9 /vægt og PC-9 /GEF celler (B4 og E3). Rolle autofagi i gefitinib-induceret cytotoksicitet blev yderligere afgrænset af en kombination af CQ og gefitinib. Konsekvent til vores tidligere undersøgelse [26], gefitinib (100 nM) alene inducerede markant cytotoksicitet i PC-9 /wt celler. Den cytotoksiske mekanisme gefitinib vides at konkurrere ATP-bindingsstedet i PC-9 /vægt celler, der bærer

EGFR

exon 19 deletion [32], og dermed fremkalde cytotoksicitet gennem apoptose [26, 33-35]. Potentiering af CQ plus gefitinib i PC-9 /vægt celler blev kun observeret, når gefitinib blev reduceret til 3 nM, hvilket indikerer, at CQ kan anvendes til at forøge gefitinib-induceret apoptose i PC-9 /wt celler. Et klinisk forsøg med gefitinib og hydroxychloroquin undergår på avanceret NSCL patienter patienter [36], vores data tyder på, at ved samtidig administration med CK og dets analoger, lavere doser af gefitinib kan være nok for patienter med gefitinib-følsomme lungekræft med mindre side virkninger [37].

Autophagy og erhvervet resistens

i forhold til PC-9 /wt celler, en 200-fold forskel i IC

50 af gefitinib blev identificeret i PC-9 /gefB4 celler [26]. Vores tidligere undersøgelse viste, at MEK-inhibitorer (AZD6244 og CI1040) dybt vendt de erhvervede modstande til gefitinib i PC-9 /gefB4 celler [26]. Konsekvent, gefitinib (100 nM) alene ikke var i stand til at inducere signifikant cytotoksicitet i PC-9 /gefB4 (fig. 4C), PC-9 /gefE3 og PC-9 /gefE7 [26]. viste imidlertid, nærværende undersøgelse, at gefitinib plus CQ betydeligt induceret caspase 3 aktivering og PARP spaltning i både PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler, hvilket indikerer, at CQ sensibiliseret PC-9 /GEF celler (B4 og E3) til gefitinib . I forhold til 200-fold forskel i IC

50 af gefitinib, gefitinib viste ikke signifikante forskelle i LC3-II elevation og celledød i PC-9 /wt celler, PC-9 /gefB4 og PC-9 /gefE3 celler , hvilket indikerer autophagy kan ikke være ansvarlig i den erhvervede gefitinibs modstand. Ikke desto mindre viste vores

in vitro

data at CQ svækket overlevelse PC-9 /gefB4 celler, hvilket indikerer, at gefitinib og CQ kan være effektiv til at overvinde gefitinibs modstand. Desuden har flere

in vitro

studier rapporterede, at autophagy hæmning synes at øge cytotoksicitet i crizotinib-resistente celler [18], trastuzumab-resistente celler [19] og cisplatin-resistente celler [20]. Hidtil begrænset

in vivo

undersøgelser har fokuseret på den terapeutiske virkning af CQ på udviklet lægemiddelresistens [18]. Vores resultater fra

in vivo

xenograft model understøtter

in vitro

data i at gefitinib konsekvent hæmmede PC-9 /vægt tumorvækst og CQ ikke øge den anti-cancer effekt af gefitinib. Med hensyn til tumorvækst af PC-9 /gefB4 xenografter, CQ plus gefitinib betydeligt forsinket tumor vækst i pc-9 /gefB4 xenografter sammenlignet med gefitinib monoterapi, hvilket indikerer, at CQ er i stand til sensibilisering PC-9 /gefB4 celler til gefitinib og reducerer derefter tumorvækst af PC-9 /gefB4 humane xenotransplantater.

som konklusion EGFR-TKI’er, såsom gefitinib, er kendt for at behandle lungekræft med betydelige effektiviteter. Vores tidligere undersøgelse ansat kombination af gefitinib og ERK-hæmmere og med succes demonstreret betydelige terapeutiske potentialer for erhvervet resistens over for gefitinib [26]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at autofagi kan spille en cytobeskyttende rolle i tumorigenese og erhvervet resistens. Endvidere synes CQ at være terapeutisk anvendelig til både gefitinib-følsomme og resistent NSCLC, tyder på, at CQ og dets analoger kan være en lovende kræftbehandling [38-39] for patienter med lungecancer med

EGFR

mutation, der udvikler en erhvervet resistens efter gefitinib behandling.