PLoS ONE: TRAPPC4-ERK2 Interaktion Aktiverer ERK1 /2 modulerer sit nukleare Lokalisering og Regulerer spredning og apoptose af tyk- og endetarmskræft Cells

Abstrakt

trafficking protein partikel kompleks 4 (TRAPPC4) er impliceret i vesikel-medieret transport, men dens association med sygdommen har sjældent rapporteret. Vi undersøgt dens potentiale interaktion med ERK2, en del af ERK1 /2-komplekset i det ekstracellulære Signal-reguleret kinase /mitogenaktiveret proteinkinase (ERK-MAPK) pathway, ved en gær to-hybrid skærm og bekræftes ved co-immunoudfældning (Co -IP) og glutathion S-transferase (GST) pull-down. Yderligere undersøgelser viste, at når TRAPPC4 blev udtømt, aktiveret ERK1 /2 specifikt faldt i kernen, som blev ledsaget med cellevækst undertrykkelse og apoptose i kolorektal cancer (CRC) celler. Overekspression af TRAPPC4 fremmet cellernes levedygtighed og forårsagede aktiveret ERK1 /2 for at øge den samlede, men især i kernen. TRAPPC4 blev udtrykt mere stærkt i kernen af ​​CRC-celler end i normale tyktarmsepitelet eller adenom som svarede med nuklear farvning af pErk1 /2. Vi demonstrerer her at TRAPPC4 kan regulere celleproliferation og apoptose i CRC ved interaktion med ERK2 og efterfølgende phosphorylering ERK1 /2 samt modulering af subcellulære lokalisering af pErk1 /2 for at aktivere den relevante signalvej

Henvisning:. Zhao SL, Hong J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) TRAPPC4-ERK2 Interaktion Aktiverer ERK1 /2 modulerer sit nukleare Lokalisering og Regulerer spredning og apoptose af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10,1371 /journal.pone.0023262

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 12. maj 2011; Accepteret: 10. juli 2011; Udgivet: 3 August, 2011

Copyright: © 2011 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of Key Program (nr 30.830.055) til J-YF (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) og af tilskud fra National Natural Science Foundation of Youth Program til S-LZ (nr 31.000.634) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Shanghai Kommissionen for videnskab og teknologi til S-LZ (nr 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), Shanghai Health Bureau for unge til S-LZ (nr 2.009.032) (https://wsj.sh.gov.cn/website/), Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine Foundation for videnskab og teknologi til S-LZ (09XJ21065) (https://www.shsmu.edu.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

TRAPPC4, den humane ortolog af gær Trs23p, også kendt som synbindin, er almindeligt kendt som en neuronal cytoplasmatisk protein oprindeligt identificeret ved gær-to-hybrid-screening under anvendelse af syndecan-2 (som tilhører en familie af celleoverflade heparansulfatproteoglycaner, der regulerer celle adfærd gennem signaltransduktionsveje [1], [2], [3]) cytoplasmatisk domæne som lokkemad [4]. Det anses for en fysiologisk ligand af syndecan-2 på dendritiske pigge, der er involveret i syndecan-2 induceret ryg dannelse ved at rekruttere intracellulære vesikler mod postsynaptiske steder i rottehippokampale neuroner. TRAPPC4 er påvist i CD34 + hæmatopoietiske stamceller /stamceller (HSPCs), og dermed er også kendt som HSPC172.

TRAPPC4 som medlem af menneskehandel protein partikel (TRAPP) familie af proteiner er impliceret i vesikel-medieret transport , en proces, der udføres ved praktisk talt hver celle og er nødvendig for en korrekt targeting og sekretion af proteiner. På nuværende tidspunkt er der 10 kendte gær trapp underenheder (Bet5p, 3P, Trs20p, 23p, 31p, 33p, 65p, 85p, 120 p, 130 P), og højere eukaryoter har ortologer for otte af disse (TRAPPC1~5,6a, 6b, 8,9) [5]. Sammen udgør to typer mutisubunit komplekser: TRAPP I og TRAPP II. I gær disse komplekser funktion i en række processer, herunder endoplasmatisk reticulum-til-Golgi transport (TRAPP I) og en dårligt defineret skridt ad trans Golgi netværket (TRAPP II) [6], [7], [8] . Studier i normale rottenyre (NRK) celler og HeLa-celler viste også, at TRAPP komplekset spiller en rolle under ER-Golgi transport [9], [10]. Den PDZL domæne i TRAPPC4 er en af ​​de mest unikke funktioner i hvirveldyr kompleks sammenlignet med gær TRAPP I. dysfunktion af Trapp-underenheder er blevet impliceret i humane sygdomme. Mutationer i TRAPPC1 (MUM-2) blev rapporteret at resultere i ekspression af antigene peptider i melanom [11], og mutationer i TRAPPC2 (sedlin) er blevet knyttet til Spondyloepiphyseal dysplasi tarda (SEDT) [12]. Imidlertid rolle TRAPPC4 i sygdommen er sjældent blevet undersøgt,.

kolorektal cancer (CRC) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden [13]. Colorektal carcinogenese er en kompleks flertrinsproces, der involverer gradvis afbrydelse af intestinale epitel-celleproliferation, apoptose, differentiering og overlevelse mekanismer [14]. Det ekstracellulære signal-regulerede kinase /mitogenaktiveret proteinkinase (ERK-MAPK) pathway er et af de vigtigste signaltransduktionsveje for cellulær fysiologi, og flere centrale vækstfaktorer og proto-onkogener fremme vækst og differentiering gennem denne kaskade [15] . Efter aktivering af ERK1 /2-komplekset migrerer til kernen, hvor det phosphorylerer forskellige transkriptionsfaktorer, som regulerer gener til at øge celleproliferation og modulerer celle apoptose [16]. Men de detaljerede mekanismer for aktivering og nuklear translokation af ERK1 /2 er ikke fuldt klarlagt.

I den aktuelle undersøgelse blev en gær to-hybrid skærm udført for at identificere ERK1 og ERK2 bindende proteiner. TRAPPC4 viste sig at binde med ERK2. Vi bekræftede interaktion og yderligere undersøgt rolle TRAPPC4-ERK2 interaktion i CRC.

Resultater

TRAPPC4 blev identificeret som en ERK2-interagerende faktor med to-hybrid screening

Phosphorylering og nuklear indtastning af ERK1 /2 er kritisk for aktivering af ERK-MAPK-vejen. At identificere faktorer relateret til processen, blev en gær to-hybrid skærm udført med ERK1 og ERK2 som lokkemad (fuld længde) i forbindelse med et menneskeligt HeLa MATCHMAKER cDNA bibliotek. Af kolonierne vokser på Leu-Trp-His plader, der blev screenet, 57/61 var positive for ERK2 og 12/32 for ERK1 i et ß-galactosidase assay. Plasmider fra disse positive kolonier blev ekstraheret, amplificeret i bakterier og co-transformeret tilbage i gær sammen med agn plasmider til yderligere testning af ß-galactosidase assay. Elleve kloner blev bekræftet at have en positiv interaktion med ERK2 og tolv med ERK1. Blandt disse plasmider, der var positive hits for ERK2 og ERK1 blev TRAPPC4 identificeret i fem og seks af sekvenserne, henholdsvis efter sekventering. Det var første gang, at TRAPPC4 blev identificeret som et potentielt interagerende protein af ERK2.

Validering af TRAPPC4-ERK2 interaktion

For yderligere at bekræfte interaktionen mellem TRAPPC4 og ERK2, co-immunopræcipitation og blev udført GST pull-down-forsøg. For co-immunopræcipitation blev fuld-længde TRAPPC4 cDNA opnået og klonet ind pCDEF-Myc, mens ERK2 sekvens blev klonet i pCDEF-Flag. De resulterende pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 vektorer blev valideret ved sekventering og cotransficeret ind i 293T cellelinie. Western blot analyse (fig. 1A) viste, at plasmiderne kunne signifikante niveauer af proteinerne. Efter anvendelse af et anti-Myc-antistof til co-immunoudfældning, både TRAPPC4-myc band og ERK2-flag bånd blev påvist fra pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 co-transficerede celler, hvilket indikerer at der er en interaktion mellem TRAPPC4 og ERK2. I den positive kontrolprøve med cotransficeret pCDEF-Myc-p16 og pCDEF-Flag-TSSK1 vektorer, både p16-myc-båndet og TSSK-flag bånd blev påvist, hvilket indikerer, at proteinerne kan være co-immunpræcipiteret af vores protokol baseret på den kendte interaktioner mellem p16 og TSSK1. Kun TRAPPC4-myc bånd blev detekteret, når pCDEF-Myc-TRAPPC4 blev cotransficeret med en tom flag vektor, medens intet bånd blev detekteret, når pCDEF-Flag-ERK2 blev co-transficeret med tom Myc-vektor, hvilket antyder, at interaktioner observeret ovenfor er specifikke og ikke medieret af protein tags

A:. Co-immunfældning af TRAPPC4 og ERK2. 293T-celler blev transficeret med tom vektor eller pcDNA pcDNA vektor til ekspression Flag tagged ERK2 (42 kD) eller Myc-mærkede TRAPPC4 (26 kD). Cellelysater blev underkastet immunpræcipitation med anti-Flag-HRP-antistof eller anti-Myc-HRP-antistof. Tilstedeværelsen af ​​ERK2-Flag og TRAPPC4-Myc i celleekstrakter før immunfældning blev reguleret ved anvendelse af anti-Flag og anti-myc antistoffer (indgang). Co-transfektion af ekspressionsvektorer for p16-myc og TSSK1-Flag blev anvendt til den positive kontrol (bane 1). B: Repræsentative resultater af GST pulldown validering eksperimenter. (A) Immunoblotanalyse af GST, og GST-ERK2 protein anvendt som negativ kontrol (bane 2) og agn (lane3) for pulldown assay. Proteiner blev påvist ved anvendelse af anti-6 × HIS antistof efter SDS-PAGE og membran overførsel. Bane 1 viste blindprøvekontrollen uden GST eller GST-ERK2. (B) ERK2 udtrykt som et GST-fusionsprotein fra bakterier var bundet til perler og inkuberet med TRAPPC4 udtrykt som 6 × His-TRAPPC4 fusionsprotein til et pulldown forsøg. GST-ERK2-protein (bane 1), GST-protein (bane 2) og TRAPPC4 protein (Lane4) blev påvist ved Coomassie-farvning. Lane3 viste markøren.

Da det er muligt, at TRAPPC4 og ERK2 interaktion kan være indirekte, fordi andre proteinfaktorer i hele celleekstrakt kan være involveret i mediering af interaktionen, fx optræder som ‘bridging’ faktorer, vi næste undersøgt en mulig direkte interaktion mellem de to proteiner ved hjælp af GST pull-down-analyser. TRAPPC4 blev trukket ned med GST-ERK2 fusionsproteiner (fig. 1B, bane c), men ikke med GST alene (fig. 1B, bane b), hvilket viser, at TRAPPC4 og ERK2 specifikt og direkte interageret

in vitro

.

TRAPPC4 regulerer ERK1 /2 fosforylering i SW1116 cellelinje

phosphorylering af ERK1 /2 er et afgørende skridt i ERK signalvejen. Nu, hvor vi havde vist, at TRAPPC4 interageret med ERK2, vi næste undersøgt relative bidrag TRAPPC4 i ERK1 /2 phosphorylering. Efter reduktion af ekspressionsniveauet af TRAPPC4 i SW1116-celler ved RNAi eller overekspression det ved transfektion af et plasmid, der koder for fuld-længde-genet, bestemte vi ændringen i Perk niveauer ved Western blotting. Påvisning af GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Mens der var ingen observerede forskelle i proteinniveauer af total ERK1 /2 i alle grupperne (fig. 2), phosphoryleringen niveau af ERK1 /2 blev nedreguleret efter siRNA-medieret nedbrydning af TRAPPC4 (fig. 2A) og op -regulated efter dets overekspression (fig. 2B). Endvidere har vi behandlede begge grupper af celler med blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), et af de aktivatorer af ERK-MAPK-vejen, og fandt, at niveauet af ERK1 /2 phosphorylering efter behandlingen ikke var signifikant forskellig mellem grupperne, trods forskellen i TRAPPC4 niveauer (fig. 2).

Celler blev lyseret, og lige store mængder af protein blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod phospho-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4. Densiteten af ​​western blot båndene blev normaliseret til mængden af ​​GAPDH protein. De viste data er repræsentative for tre gentagne forsøg. *,

s

0,05. A. Celler blev transficeret med TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) til knockdown TRAPPC4 udtryk eller med negtive Kontrol siRNA (siControl) som kontrol; Også celler blev behandlet med PDGF at aktivere ERK-MAPK-vejen, eller med dens opløsningsmiddel (PBS + 0,1 BSA) som kontrol. B. Celler blev transficeret med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektor at overudtrykke TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontrol; Også celler blev behandlet med PDGF at aktivere ERK-MAPK-vejen, eller med dens opløsningsmiddel (PBS + 0,1 BSA) som kontrol.

TRAPPC4 regulerer den rumlige fordeling af phosphoryleret ERK1 /2

Da vi havde vist, at TRAPPC4 kunne påvirke aktivering status ERK1 /2, vi ønskede at bestemme dets effekt på den subcellulære lokalisering af pErk1 /2. Næste sammenlignede vi pErk1 /2 og ERK1 /2-ekspression i den fraskilte cytoplasmatiske og nukleare fraktioner når TRAPPC4 blev udtømte eller overudtrykt som beskrevet ovenfor. Igen blev GAPDH anvendt som en loading kontrol for cytoplasmatisk protein input, og TBP blev anvendt som kontrol for input kerneprotein.

ved Western blotting, fandt vi, at efter TRAPPC4 siRNA behandling, niveauet af pErk1 /2 faldt betydeligt i kernen (fig. 3A). I mellemtiden var ingen signifikant forskel i pErk1 /2 findes i cytoplasmaet, når kvantificeret, selv om en lille stigning blev foreslået visuelt (fig. 3B). På den anden side, når TRAPPC4 blev overudtrykt, blev pErk1 /2-ekspression opreguleres væsentligt i kernen (fig. 4A). Mens i cytoplasmaet, viste vores resultater en svag visuel stigning uden signifikante forskelle, når kvantificeret (fig. 4B).

SW1116 celler blev transficeret med TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) til Knockdown TRAPPC4 ekspression eller med negtive Kontrol siRNA (siControl ) som kontrol; Også celler blev behandlet med PDGF at aktivere ERK-MAPK-vejen, eller med dens opløsningsmiddel (PBS + 0,1% BSA) som kontrol. Cytoplasmaet og kerneekstrakter blev fremstillet som beskrevet i eksperimentelle procedurer, og lige store mængder af protein blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod phospho-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4. Densiteten af ​​western blot båndene blev normaliseret til mængden af ​​GAPDH protein til cytoplasma protein eller TBP for nuklear protein. De viste data er repræsentative for tre gentagne forsøg. *,

s

. 0,05

SW1116 celler blev transficeret med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektor at overudtrykke TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontrol; Også celler blev behandlet med PDGF at aktivere ERK-MAPK-vejen, eller med dens opløsningsmiddel (PBS + 0,1% BSA) som kontrol. Nuclear (A) og cytoplasma (B) ekstrakter blev fremstillet som beskrevet i eksperimentelle procedurer, og lige store mængder af protein blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod phospho-ERK1 /2 (pErk1 /2), eller ERK1 /2, eller TRAPPC4 . Densiteten af ​​western blot båndene blev normaliseret til mængden af ​​TBP til nuklear protein eller GAPDH protein til cytoplasma protein. De viste data er repræsentative for tre gentagne forsøg. *,

s

. 0,05

PDGF kan aktivere ERK-MAPK-vejen gennem receptortyrosinkinaser [17]. Når SW1116 cellelinien blev stimuleret med PDGF, et mindre fald på pErk1 /2 blev observeret visuelt i den nukleare fraktion efter TRAPPC4 knock-down, men det var ikke signifikant ved kvantificering. I mellemtiden var ingen signifikant ændring i pErk1 /2 kvantificeret i den cytoplasmatiske fraktion, selv om en lille stigning blev foreslået visuelt (fig. 3). Imidlertid PDGF-stimulering af celler, der overudtrykker TRAPPC4 resulterede i signifikant pErk1 /2 opregulering i kernen, men ikke i cytoplasmaet (fig. 4).

TRAPPC4 modulerer proliferation og udtømning af TRAPPC4 inducerer apoptose i SW1116-cellelinien

aktiveringen af ​​ERK-MAP-kinaser er blevet forbundet med celleproliferation [16]. For yderligere at undersøge funktionen af ​​TRAPPC4 i CRC-celler, sammenlignede vi celleproliferation af SW1116 celler, når TRAPPC4 ekspression blev reduceret med siRNA eller over-udtrykkes med fuld længde TRAPPC4 gen transfektion med den for mock kontrol. Resultater af Cell Counting Kit (CCK) -8 assay viste en signifikant inhibering af vækst efter TRAPPC4 udtømning og en stigning på cellelevedygtighed når TRAPPC4 blev overudtrykt både startende fra 24 timer efter transfektion (fig. 5A).

A: CCK-8 assay. SW1116-celler blev podet i en 96-brønds plade indtil subkonfluerende. Levedygtige celler blev bestemt ved CCK-8 assay. Tre uafhængige tid blev udført tre gange. Celler blev behandlet med TRAPPC4 siRNA til Knockdown TRAPPC4 ekspression eller med negtive Kontrol siRNA anvendt som kontrol (a), samt tranfered med pCDEF-myc-TRAPPC4 vektor at overudtrykke TRAPPC4 protein eller med pCDEF-myc vektor som kontrol (b). *,

s

0,05. B: Apoptose analyse. Efter SW1116-celler blev behandlet med TRAPPC4 siRNA eller negtive Kontrol siRNA anvendt som kontrol i 48 timer. Apoptose blev udført under anvendelse af Annexin V assay med propidiumiodid kontrastfarvning tillader kvantificering ved flowcytometri. Tre uafhængige tid blev udført tre gange. Dataene blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Der var signifikant forskel mellem de to grupper (

s

0,01)

TRAPPC4 ophobning i kernen er forbundet med pErk1 /2 farvning i humane kolorektal kræft

så lidt blev kendt om udtryk og lokalisering af TRAPPC4 i kolorektal cancer

in vivo

, derefter sammenlignet vi sit udtryk i normale colon epitel, adenom og adenocarcinom væv ved immunhistokemi, som beskrevet i Materialer og metoder. I normal tyktarmsepitelet blev TRAPPC4 farvning begrænset til cytoplasmaet (fig. 6A). 4,55% af cellerne i adenom prøver viste nuklear farvning, mens det var 55.89% i de adencarcinoma prøver (

s Restaurant 0,01). Ingen signifikante forskelle blev vist i alt TRAPPC4 udtryk mellem de tre grupper (normal colon epitel gruppe = 85,7%; adenom gruppe = 72,7%; adenocarcinom gruppe = 79,4%;

s

0,05).. (Tab 1 )

(a), pErk1 /2 (b) og ERK1 /2 (C) i normal tyktarmsepitelet (a), adenom (b), og adenocarcinom (c). Polygrams (D) viser ekspression af proteinerne i cytoplasmaet (lyserød), nucleus (gul), og total (blå). A: Ekspression af TRAPPC4 har ingen signifikant forskel i de tre grupper alt, men øger i kernen fra a til c. B: pErk1 /2 hovedsageligt placeret i kernen, og dens niveau stiger væsentligt fra a til c. C: Ekspression af ERK1 /2 har ingen signifikant forskel i de tre grupper i alt, men stigninger i kernen fra a til c. Original forstørrelse × 200.

Desuden har vi analyseret sammenhængen mellem TRAPPC4 og pErk1 /2 eller ERK1 /2 farvning i normal colon epitel, adenom og adenocarcinom. Mens ERK1 /2-farvning blev detekteret både i cytoplasmaet og kernen (fig. 6C), dens farvning i kernen steg betydeligt i adenocarcinom-gruppen sammenlignet med de to andre grupper. Desuden pErk1 /2 aktiverede proteiner blev alle placeret i kernen, og der var betydelige forskelle mellem de tre grupper (fig. 6B). Således er vores resultater viser en signifikant sammenhæng mellem nuklear TRAPPC4 udtryk og pErk1 /2 niveauer (

r

= 0,996), og også mellem nuklear TRAPPC4 udtryk og ERK1 /2 niveauer (

r

= 0,994 ).

diskussion

de to komponenter i ERK1 /2-komplekset er altid fundet at være co-lokaliseret i kolorektale karcinomer [17], [18], [19], [20] og ERK1 og ERK2 MAPK’er har tiltrukket intens forskning interesse på grund af deres kritiske engagement i reguleringen af ​​celledeling og surviva [17]. Aktiverede ERK’er phosphorylerer og regulere aktiviteterne i en stadigt voksende liste over substrater, der skønnes at omfatte over 160 proteiner [21]. Derfor blev ERK1 og ERK2 anvendes som madding til to-hybrid-gær screening i et menneske Hela cDNA-bibliotek i det første trin af denne undersøgelse. Som et resultat blandt de 23 bindende proteiner (11 med ERK2 og 12 med ERK1), eventuelle vekselvirkning TRAPPC4 og ERK2, men ikke med ERK1 blev afsløret for første gang. Vores co-immunpræcipitering og GST-pulldown eksperimenter yderligere bekræftet TRAPPC4 som ERK2 interaktion partner.

Siden få tegn på Trapp proteiner i CRC er blevet rapporteret, og den rolle, den TRAPPC4-ERK2 interaktion er stadig ukendt, vi først analyseret virkningen af ​​TRAPPC4 på phosphoryleret ERK1 /2, den aktiverede form af ERK1 /2. Vi fandt, at, som helhed, overekspression af TRAPPC4 aktiveret ERK1 /2, mens dens udtømning faldt pErk1 /2 niveauer i colon cancer-afledte cellelinie SW1116. Således TRAPPC4 fungerer som en positiv regulator for pErk1 /2.

Selvom nogle findes i cytoplasmaet, at størstedelen af ​​ERK-substrater er kerneproteiner [22]. Aktiverede ERK’er kan translokere til kernen, hvor de phosphorylerer og regulerer en række transkriptionsfaktorer, såsom Ets familie transkriptionsfaktorer, i sidste ende fører til ændringer i genekspression [23]. Yderligere vurdering af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner viste, at placeringen af ​​pErk1 /2 også ændret sammen med TRAPPC4 ekspressionsniveauerne. Da TRAPPC4 blev slået ned, det nukleare pErk1 /2-niveau var især nedreguleres, men ingen signifikant forskel blev vist i cytoplasmaet. Ved overekspression, pErk1 /2-ekspression steg både i kernen og cytoplasmaet, men mere bemærkelsesværdigt i kernen. Således er TRAPPC4 involveret i ikke bare phosphoryleringen af ​​ERK1 /2, men også dets rumlige udbredelse i colorektale epithelceller. Trapp proteiner er kendt for at være en del af en stor multi-protein-kompleks er involveret i ER-til-Golgi og intra-Golgi handel [5], [7], [8]. De præsenterer som flere isoformer, som afviger på underenheder, funktion og placering. For eksempel, TRAPPCI er involveret i rekrutteringen af ​​ER-afledte vesikler til cis-Golgi [8], og TRAPPCII [7] er nødvendig for retrograd transport fra endosomerne. Eva Loh

et al.

Afslørede, at Bet3, den mest konserverede komponent i TRAPP kompleks, udtrykkes i otte forskellige musevæv, eksisterer i to forskellige puljer i cytosolen og funktioner under ER-Golgi transport [10] . Derfor kan TRAPPC4 spille en rolle i nucleocytoplasmic transport i kolorektal cancer, men denne mekanisme vil kræve yderligere undersøgelse.

PDGF kan signalere gennem ERK-MAPK-vejen og aktiverer ERK kaskade gennem receptortyrosinkinaser. Vi fandt, at efter behandling med PDGF, virkningen af ​​TRAPPC4 på pErk1 /2 var helt eller delvis skjult. Resultaterne gav os en indikation af, at TRAPPC4 kan være involveret i visse trin i PDFG-medieret aktivering af ERK1 /2 kaskade. Som for ERK1 /2 phosphorylering, kan virkningen af ​​TRAPPC4 ikke være så potent som den for PDGF. Dog forbliver den detaljerede mekanisme, som skal undersøges grundigt.

Desuden fandt vi, at TRAPPC4 påvirkede celledeling samt celledød. Udtømning af TRAPPC4 inhiberede cellevækst og apoptose, mens dets overekspression bidraget til cellevækst. Det blev rapporteret, aktiveret ERK1 /2 samvirker med nogle substrater, såsom phosphoprotein beriget i astrocytter 15 (PEA-15), og Døden associeret protein kinase (DAPK), og er afsondret i cytoplasmaet [24]. Sletning af PEA-15 markant stimulerer ERK-afhængig proliferation og gen transskription; mens PEA-15 overekspression blokerer proliferation via sin evne til at binde og sekvestrere ERK1 /2 i cytoplasmaet [25]. DAPK sekvestrerer ERK1 /2 i cytoplasmaet ved interaktion med ERK gennem en D-domæne inden for dens død domæne. og interaktionen fremmer proapoptotiske funktion af DAPK [26]. Derfor inhibering af ERK1 /2 kernelokalisering svækker ERK1 /2-medieret overlevelse signaler og derudover øger de proapoptotiske signaler. I vores undersøgelse, efter knockdown af TRAPPC4, faldet i aktiveringen af ​​ERK1 /2 korresponderede med mindre kernelokalisering, hvilket i sidste ende kan føre til vækst surpression og apoptose. Betragtninger, mere nukleare lokalisering når TRAPPC4 overudtrykt kan fremme cellevækst.

De fleste af den tidligere forskning på Trapp Family var fokuseret på gær og normale pattedyrceller eller væv [4], [5], [8] , [10]. Så vidt vi ved, har kun ekspression af TRAPPC2 blevet undersøgt i sygdommen af ​​SEDL [27]. Til dato har placeringen af ​​Trapp-underenheder primært blevet rapporteret i cytoplasmaet i pattedyrceller [9], [10]. TRAPPC4 sigende placeret i ryggen på dyrkede hippocampusneuroner [4], men der er indhentet lidt information om dets rolle i sygdom. Her analyserede vi TRAPPC4 ekspression i humant normalt tyktarmsepitelet, adenom, og adenocarcinom væv ved immunohistokemi. Resultaterne viste, at nukleare TRAPPC4 vises efter normal epitel væv udvikler sig til adenom og adenocarcinom. Således kan ændringen i lokalisering af TRAPPC4 være relateret til colorektal carcinogenese. Spørgsmålet er, om det kan skyldes eventuelle genmutationer eller strukturelle ændringer, der opstår i TRAPPC4 under kolorektal carcinogenese. I mellemtiden pErk1 /2, som blev lokaliseret i kernen i vores undersøgelse øgede i adenocarcinom sammenlignet med adenom væv og normale epitelvæv. Som nævnt ovenfor er den vigtigste funktion af TRAPP familie er i regulering af vesikulær transport, og TRAPPC4 er involveret i membran handel med postsynaptiske steder i neuroner. Man kunne spørge, om den mekanisme af nuklear lokalisering af TRAPPC4 i CRC er relevant for transport af pErk1 /2 fra cytoplasmaet til kernen. Faktisk blev TRAPP komplekset vist sig at fungere som guanin nukleotid udveksling faktor (GEF) for Ypt1 og Ypt31 /32 GTPaser både

in vitro

in vivo

[28], [29 ]. Mens Ypt1 GTPase er nødvendig på cis-Golgi for målretning og sammensmeltning af ER-afledte vesikler [30], [31], funktionen af ​​de Ypt31 /32 GTPaser er også afgørende for dannelsen af ​​trans-Golgi vesikler [32] . Det er stadig uvist, om der foreligger en tilsvarende molekylær mekanisme for TRAPPC4 i CRC i endnu yderligere undersøgelser.

Som konklusion, vores undersøgelse viste samspillet mellem TRAPPC4 med ERK2. I kolorektal cancer, det ikke kun regulerer aktiveringen af ​​ERK1 /2, men også påvirker fordelingen af ​​aktiveret ERK1 /2. Det modulerer celleproliferation og apoptose i CRC-celler. I betragtning med tidligere undersøgelser, vi spekulere, at, i CRC, TRAPPC4 binder og aktiverer ERK1 /2 samt deltager i den nukleare transport af pErk1 /2. Når TRAPPC4 er opbrugt, mindre ERK1 /2 er phosphoryleret, og relativt flere pErk1 /2 forbliver i cytoplasmaet, hvilket fører til undertrykkelse af celleproliferation og apoptose. Når TRAPPC4 overudtrykkes, er mere ERK1 /2 aktiveres, og endnu mere transporteres ind i kernen, endelig fører til øget cellevækst (fig. 7). Fremtidige undersøgelser vil være forpligtet til at afklare denne foreslåede molekylære mekanisme.

ekstracellulære signaler, såsom PDGF, aktivere ERK kaskader (RAS /RAF /MER /ERK) gennem receptortyrosinkinaser (RTK) og utimately regulerer celledeling og apoptose. TRAPPC4 binder og aktiverer ERK1 /2 samt deltager i den nukleare transport af pErk1 /2. Når TRAPPC4 er opbrugt, mindre ERK1 /2 er phosphoryleret, og relativt flere pErk1 /2 forbliver i cytoplasmaet, hvilket fører til undertrykkelse af celleproliferation og apoptose. Når TRAPPC4 overudtrykkes, er mere ERK1 /2 aktiveres, og endnu mere transporteres ind i kernen, endelig fører til øget cellevækst.

Materialer og metoder

plasmider og transfektioner

fuld længde ERK1, ERK2 og TRAPPC4 cDNA blev opnået ved PCR fra et humant cDNA-bibliotek. For gær to-hybrid-assays blev fuld længde fragmenter af ERK1 og ERK2 cDNA’er klonet både i ramme med

Sfi

I site i pGB plasmidet. Til bindingsassays blev fuldlængde TRAPPC4 cDNA klonet i pCDEF-Myc, og fuld-længde ERK2 cDNA blev klonet i pCDEF-Flag. ERK2 blev subklonet i pGEX-5x at producere glutathion

S

transferase (GST) fusionsproteiner, og TRAPPC4 subklonet i pET-28a til at producere hans fusionsproteiner.

For co-immunofældning eksperimenter nedenfor, 1,6 × 10

6 celler /brønd på 6 cm-skåle cotransficeret med vektorer pCDEF-Myc-TRAPPC4 og pCDEF-Flag-ERK2 udtrykkende TRAPPC og ERK2, henholdsvis anvendelse af et plasmid: transfektionsreagens forhold på 1:4 (4 ug hvert plasmid). Tomme vektor kontrol var pCDEF-Myc eller pCDEF-Flag (begge fra Shanghai Genomics).

Gær to-hybrid assays

Gær to-hybrid screening blev udført for at identificere Erk1 og ERK2 interagerende proteiner ved under anvendelse af Clontech Matchmaker Two-Hybrid System (Cat. # K1612-1) ifølge producentens instruktioner. Bait plasmider PGB-ERK1-G og PGB-ERK2-G blev transformeret ind i gær Y190. Toksiske virkninger og selvstændige aktivering tests blev udført under anvendelse af en β-galactosidase assay. Gær transformeret med lokkemad plasmider blev dyrket og screenet med det humane HeLa Matchmaker cDNA-bibliotek (Clontech, CAT # HL4048AH) og derefter dyrket på Leu-Trp-His-plader til udvælgelse og validering ved hjælp af ß-galactosidase assay. Plasmider fra positive kolonier blev udvundet, forstærket i bakterier og co-transformeret tilbage i gær sammen med agn plasmider til yderligere test i ß-galactosidase assays. Plasmider fra positive hits blev sekventeret og analyseret.

Co-immunpræcipitering (co-IP) og GST-pulldown analyse

Co-immunfældning blev udført som tidligere [33] beskrevne. Både input og IP-prøver blev analyseret ved Western blot under anvendelse af forskellige antistoffer på følgende fortyndinger: Flag-antistof (1:1000), Myc-antistof (1:1000) Flag-HRP-antistof (1:4000), Myc-HRP-antistof (1 :2000) (alle fra Shanghai Genomics, Shanghai, Kina), og gede-anti-muse-IgG-HRP-antistof (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Co-transfektion af ekspressionsvektorer for p16 og TSSK1 (Shanghai Genomics, Shanghai, Kina) blev anvendt til den positive kontrol co-immunofældning.

GST-protein og GST-ERK2 fusionsproteiner blev udtrykt og oprenset ifølge producentens instruktioner (GE Healthcare, London, UK). For pull-down assay blev 1-5 mg af GST eller GST-fusionsproteiner blandet med 40 ml af en 50% suspension af glutathion-Sepharose 4B-perler i 2 timer i bindingspuffer [25 mM HEPES-NaOH (pH 7,5) , 12,5 mM MgCl

2 10% glycerol, 5 mM DTT, 0,1% NP-40, 150 mM KCI og 20 mM ZnCI2]. Derefter 1-5 mg 6 × Hans-TRAPPC4 fusionsproteiner blev tilsat efterfulgt af inkubation i yderligere 2 timer. Pelleterne blev vasket grundigt, og blev identificeret ved western blotting med 6 × His Antistof (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).

Cellekultur

coloncancer-afledte celle line SW1116 (købt fra Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences) blev opretholdt ved serielle passager i RPMI 1640 indeholdende 10% varme-inaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.