PLoS ONE: Epstein-Barr virus og human papillomavirus Infektioner og genotype Distribution i hoved og hals kræft

Abstrakt

Målsætning

For at undersøge prævalens, genotyper og prognostiske værdier af Epstein-Barr virus (EBV) og human papillomavirus (HPV) infektioner i japanske patienter med forskellige typer af hoved og halscancer (HNC).

Metoder og Materialer

HPV og EBV-DNA, EBV genotyper og

LMP-1

varianter, og HPV mRNA-ekspression blev påvist ved PCR fra frisk-frosne HNC prøver. HPV-genotyper blev bestemt ved direkte sekventering, og EBV kodet RNA (

EBER

) blev undersøgt ved in situ hybridisering.

Resultater

Af de 209 HNC patienter, 63 (30,1 %) havde HPV-infektion og HPV-16 var den mest almindelige undertype (86,9%). HPV

E6 /E7

mRNA-ekspression blev fundet i 23 ud af 60 (38,3%) HPV DNA-positive tilfælde opdages. Webstedet for højeste forekomst af HPV var oropharynx (45,9%). Blandt 146 (69,9%) HNCs hvor EBV DNA blev identificeret, 107 (73,3%) og 27 (18,5%) indeholdt type A og B, henholdsvis og 124 (84,9%), fremgik det, at

del-LMP- 1

. Men kun 13 (6,2%) HNCs var positive for

EBER

, 12 (92,3%), hvoraf stammer fra næsesvælget. Co-infektion med HPV og

EBER

blev fundet i kun 1,0% af HNCs og 10,0% af NPC’ere. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste signifikant bedre sygdomsspecifikke og samlet overlevelse i HPV-DNA + /mRNA + svælg pladecellekræft (OPC) patienter end i de øvrige OPC patienter (

P

= 0,027 og 0,017 henholdsvis). Multivariat analyse viste, at fase T1-3 (

P

= 0,002) og HPV mRNA-positive status (

P

= 0,061) uafhængigt forudsagt bedre sygdomsspecifikke overlevelse. Ingen signifikant forskel i sygdomsspecifikke overlevelse blev fundet mellem

EBER

-positiv og -negative NPC patienter (

P

= 0,155).

Konklusioner

Vores resultater viser, at co-infektion med HPV og EBV er sjældne i HNC. Oropharyngeal SCC med aktiv HPV-infektion var relateret til en yderst gunstigt resultat, mens EBV status ikke var prognostisk i NPC kohorten

Henvisning:. Deng Z, Uehara T, Maeda H, Hasegawa M, Matayoshi S, Kiyuna A et al. (2014) Epstein-Barr virus og human papillomavirus Infektioner og genotype Distribution i hoved og hals kræft. PLoS ONE 9 (11): e113702. doi: 10,1371 /journal.pone.0113702

Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA

Modtaget: Juli 18, 2014 Accepteret den 28. oktober 2014 Udgivet: November 18, 2014

Copyright: © 2014 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud KAKENHI 26462610 (Japan Society for fremme af Science) til Dr. Suzuki, give KAKENHI 26.462.611 (Japan Society for fremme af Science) Dr. Deng, en bevilling fra Okinawa Medical Science Research Foundation til Dr. Deng, og en bevilling fra Videnskab og Teknologi Development center, Undervisningsministeriet af Folkerepublikken Kina, til Dr. Deng. Denne undersøgelse blev også støttet og gennemført i samarbejde med Ryukyu Society for fremme af Øre-Næse-Hals-Sygdomme. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved- og halskræft (HNC) er den sjette førende kræft i verden, med mere end 600.000 nye tilfælde rapporteres hvert år [1]. Overdreven alkohol og tobaksforbrug er to traditionelle og store risikofaktorer for HNC. I de sidste to årtier, at forekomsten af ​​HNC, såsom kræft i strubehovedet eller hypopharynx, er faldet markant på grund af forebyggende strategier rettet mod disse risikofaktorer. Imidlertid er forekomsten af ​​svælg pladecellekræft (OPC) steget kraftigt, især i unge debuterende HNC i fravær af disse traditionelle risikofaktorer, hvilket tyder på at inddrage andre faktorer. Humant papillomvirus (HPV) er nu også en etableret ætiologisk faktor for forekomsten og udviklingen af ​​HNC, især OPC. En stigning i andelen af ​​HPV-relaterede svælg kræft blev observeret i USA fra 1973 til 2004 [2]. Tilsvarende to retrospektive kohortestudier fra Stockholm, Sverige, viste stigninger i andelen af ​​HPV-positive tonsillær kræft fra 23,3% i 1970’erne til 93% i perioden 2006-2007 og i den af ​​HPV-positive base af tungen kræft fra 58 % for 1998-2001 til 84% i 2006-2007 [3], [4]. Desuden er den omstændighed, at HPV detekteres i ikke-svælg HNC antyder, at dets rolle i udviklingen og progressionen af ​​HNC ikke er begrænset til oropharynx [5], men omfatter næsesvælget, hvor Epstein-Barr virus (EBV) er konsekvent påvist i cancerceller fra regioner med høj og lav forekomst [6].

EBV er et allestedsnærværende herpes virus, der påvirker mere end 90% af verdens voksne befolkning og er forbundet med forskellige maligne lidelser, herunder Hodgkins sygdom, Burkitts lymfom, B-celle lymfom [7], [8], [9], og gastrisk carcinom [10]. I hoved og hals, kan etableringen af ​​en latent transformerende EBV infektion og de potentielle virale genetiske ændringer, der forekommer i epitelceller bidrage til udvikling, vækst og invasive kapacitet nasofaryngealt karcinom (NPC) [6]. Plasma EBV DNA-analyse har vist sig nyttig i forbindelse med afsløring begyndelsen NPC i individer, når der ikke er nogen klinisk mistanke om tumor [11]. Adskillige virale proteiner af EBV omfatter Latenstiden-associerede proteiner, latente membranproteiner-1 og -2 (

LMP-1 Salg og

LMP-2 Salg) og EBV nukleare antigener (

EBNA1-6

) [9], [12]. EBV er klassificeret som type A eller B baseret på forbundne polymorfi i

EBNA

–

2

,

-3a

,

-3B

, og

3C

[13].

LMP-1

har vist sig at være en EBV onkogen [14]. Den omfatter en kort aminosyresekvens cytoplasmatisk N-terminus (aminosyrer 1-23), seks transmembrane-spændende domæner (aminosyrer 24-186), og en C-terminus (aminosyrer 187-386). C-terminalen og transmembranspændende domæner af

LMP-1

er nødvendige for maksimale aktivering af nuklear faktor-kappa B (NF-kB), hvis aktivering er knyttet til inhibering af apoptose [15 ], [16], [17]. En sletning af 30 basepar (bp) på 3’C-terminale region af

LMP-1

gen (

del-LMP-1

) er blevet rapporteret i NPC i kinesiske patienter . Denne udeladelse kan resultere i tab af aminosyrer 346-355 i

LMP-1

protein. Sletningen protein har en længere halveringstid og giver forbedret NF-kappa B og JNK /AP1 signalering aktivitet i epitelceller. Disse egenskaber

del-LMP-1

variant er lokaliseret til det transmembrane-spændende domæner og kan bidrage til en mere malign fænotype af NPC [18]. Tidligere undersøgelser har fundet

del-LMP-1

at være til stede i mere end 75% af NPC patienter i Sydøstasien og Nordafrika [19], [20], [21]. Overvægten af ​​specifikke

LMP-1

varianter i NPC kan afspejle forskelle i de biologiske eller molekylære egenskaber af

LMP-1

varianter. Desuden

del-LMP-1

har lavere immunogenicitet end den ikke-del-variant, der kan give anledning til tumor udvikling i immunkompetente værter via undslippe immunosurveillance [22]. Men forekomsten og rolle EBV i HNC på andre steder end de næsesvælget er kontroversielle. Mens EBV DNA er blevet identificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) i 72-92% af oral SCC, larynx SCC, og svælg SCC sager [23], [24], [25], [26], forekomsten af ​​EBV-infektion baseret på in situ hybridisering (ISH) rettet mod EBV kodet RNA (

EBER

), guld-standard analyse til bestemmelse af, om en biopsi tumor er EBV-relateret, er betydeligt inkonsekvent i disse kræftformer [23], [27 ], [28], [29]. Desuden NPC forekomst adskiller blandt geografiske regioner og trods EBV infektion forekommer udførligt på verdensplan, betyder det, at en undertype af EBV er involveret i NPC.

Co-infektion med virus og virus /virus direkte eller indirekte interaktioner har været findes i nogle maligniteter, og et typisk eksempel for en malign tumor grund af virus /virus-interaktioner er Kaposis sarkom-associeret herpesvirus (KSHV) -induceret Kaposi sarkom i aIDS patienter [30], [31]. De seneste oplysninger tyder på, at personer med HPV er markant højere risiko for at erhverve human immundefekt virus (HIV) infektion [32], [33]. Co-infektion med HPV og herpes simplex virus 1 (HSV-1) ses også i en delmængde af HNC sager [5]. Som HPV og EBV er de to mest almindelige virus i HNC, bør det præciseres, om co-infektion fører til deres interaktion i HNC og hvorfor udbredelsen HPV er steget i de seneste par årtier.

Denne prospektive undersøgelse undersøgte hyppigheden af ​​EBV genotyper,

del-LMP-1

varianter, og HPV genotyper i frisk-frosne prøver fra patienter med HNC for at analysere virkningerne af EBV og HPV-infektion på forskellige typer af HNC. Resultaterne blev derefter undersøgt for foreninger med kliniske funktioner og prognose.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellelinier

Vi rekrutteret 209 patienter med HNC patologisk bekræftet af Institut af Otorhinolaryngologi, hoved og hals kirurgi ved universitetet i Ryukyus, Japan, mellem december 2006 og marts 2014. skriftlig blev informeret samtykke opnået fra hver patient og forsøgsprotokol blev godkendt af den etiske komité af University of the Ryukyus. Vævsprøver opnået ved biopsi eller kirurgisk udskæring blev snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret indtil yderligere analyse.

cellelinier CaSki (ECACC, Salisbury, UK) og Raji (ATCC, Tokyo, Japan) blev anvendt som kontroller til forstærkning af HPV

L1

E6 /E7

gener og EBV

LMP-1

og

EBNA-3C

gener, henholdsvis og dyrket ifølge leverandørens instruktioner.

DNA-ekstraktion og PCR til påvisning af HPV DNA og EBV DNA

DNA blev ekstraheret fra prøverne og celler ved anvendelse af Gentra Purification Tissue Kit (Qiagen, Germantown, MD) ifølge fabrikantens protokol. Tilstedeværelsen og integritet af DNA i alle prøver blev verificeret ved PCR â-globingen amplifikation under anvendelse af primere PC04 og GH20 [34].

tilstedeværelsen af ​​HPV-DNA blev analyseret ved PCR under anvendelse af generel konsensus primersæt

GP5 + /GP6 +

MY09 /11

[35], [36]. DNA-prøver er negative for HPV ved hjælp af

GP5 + /GP6 +

eller

MY09 /11

blev re-forstærket af (auto-) indlejret PCR ved hjælp af

GP5 + /GP6 +

primerpar som tidligere beskrevet [37]. Vand (negativ kontrol) og DNA fra HPV-16-positive CaSki-celler (positiv kontrol) blev inkluderet i hver amplifikation serie. PCR-produkter blev oprenset og direkte sekventeret med et ABI PRISM 3130 × l Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Sekvenser blev justeret og sammenlignet med dem af kendte HPV-typer i GenBank-databasen ved hjælp af BLAST-programmet.

EBV DNA tilstedeværelse og typning blev udført ved PCR ved anvendelse af primere der spænder over

EBNA-3C

gen som tidligere beskrevet [13]. På grund af primer-sites flankerende regioner af typespecifikke variation, de resulterende PCR-produkter var to forskellige størrelser afledt af

EBV-A

(153 bp) og

EBV-B

(246 bp) ( Figur 1). Som positive kontroller, to EBV positive prøver af type A og type B, bekræftet ved PCR og direkte sekventering blev inkluderet i hver PCR-reaktion

Mellemøsten panel:. En specifik 316 bp band viste vildtype

LMP -1

(prøve 3, 4, 6, 7 og positiv kontrol PC-1) og en specifik 286 bp band indikerede 30 bp deletion

LMP-1

(prøve 1, 2, 5, og PC-2). Produkterne fra positive kontroller blev bekræftet ved direkte sekventering. Nederste panel: 30 bp sletning sekvens af

del-LMP-1

fra vildtype LMP-1 ved sekvensanalyse

Vi undersøgte også den

LMP-1.

genet som tidligere rapporteret [19]. Prototypen Raji cellelinje (ATCC), som bevarer den carboxyterminale 30 bp, frembringer et 316 bp fragment og blev anvendt som en positiv kontrol for vildtype

LMP-1

. Prøver med en kortere PCR-produkt længde end observeret med Raji mentes at indeholde

LMP-1

sletning (

del-LMP-1

, 286 bp fragment). Desuden blev en prøve med en 30 bp deletionsvariant verificeret ved PCR og direkte sekventering også inkluderet i hver PCR-reaktion.

Påvisning af HPV

E6 /E7

mRNA ved omvendt transkription-PCR

totalt RNA ekstraheret fra tumorprøver under anvendelse af totalt RNA ™ kit (Ambion, Austin, TX) i overensstemmelse med producentens protokoller blev suspenderet i 50 pi ultrahøj kvalitet diethylpyrocarbonat-behandlet vand.

Før cDNA-syntese blev enhver tilbageværende DNA fjernedes ved inkubation med 1 U DNase i (Ambion) ved stuetemperatur i 25 min. cDNA blev derefter syntetiseret fra DNA-free total RNA ved hjælp af RETROscript® Kit (Ambion) ifølge producentens instruktioner. For at undersøge for tilstedeværelsen af ​​kontaminerende DNA i RNA-prøver blev alle assays udført både med og uden revers transkriptase.

For at detektere høj risiko

E6 /E7

mRNA-transkripter, PCR blev udført med cDNA opnået fra HPV-DNA-positive prøver under anvendelse TAKARA PCR human papillomavirus Typing Set (Takara Bio Inc. Otsu, Japan), som kan identificere højrisiko HPV-typer 16, 18, 31, 33, 35, 52, og 58. for at verificere de HPV-16

E6 /E7

mRNA-transkripter, blev HPV-16 DNA-positive prøver også undersøgt ved hjælp af en halv-nested PCR tilgang med cDNA som beskrevet tidligere [38].

ISH for

EBER

tilstedeværelsen af ​​EBV i cancerceller blev bekræftet ved ISH for

EBER

. Kort fortalt blev 4 um tykke snit fra formalin-fiksering paraffinindlejrede blokke deparaffineret, re-hydreret, og fordøjet med proteinase K. Hybridiseringsopløsningen indeholdende fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret EBV oligonucleotidprobe (

EBER

PNA probe, cocktails af

EBER 1

og

2

, Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt i 90 min ved 55 ° C. En Dako ISH detektion kit (kode nr S5201) med kanin F (ab ‘) 2 anti-FITC-antistof og enzym-substrat (5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat og nitroblue tetrazolium) blev anvendt til at visualisere hybridiseringsprodukter. Farvede objektglas blev modfarvet med Nuclear Fast Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Mørke-blå signaler optræder i kernen blev anerkendt som

EBER

positiv.

Statistisk analyse

Beskrivende statistik blev anvendt til at karakterisere patientens baseline karakteristika. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test blev anvendt til kontinuerte variable, og Pearsons Chi-square test eller Fishers eksakte test blev anvendt til kategoriske variable.

Gentagelse overlevelse blev defineret som tiden fra afslutningen af ​​behandlingen til cancer tilbagefald eller sidste opfølgning. Sygdomsspecifikke overlevelse blev defineret som tiden fra behandlingens afslutning til nedsynkning af sygdom eller sidste opfølgning. Overlevelseskurver blev evalueret ved Kaplan-Meier-metoden, og overlevelse distributioner blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (SPSS til Windows-version 12.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

klinisk-patologisk karakteristika af patienter

Placering af den primære tumor var nasopharynx hos 20 patienter (9,6%), oropharynx i 74 (35,4%), hypopharynx i 50 (23,9%), strubehovedet i 28 (13,4%), og mundhulen i 37 (17,7%). Af de 209 patienter, 168 fik helbredende behandling (samtidige kemostråleterapi i 73, kirurgi og postoperativ strålebehandling eller chemoradiation terapi (strålingsdosis, 50-54 Gy) i 51, kirurgi alene i 27, og strålebehandling alene i 17), fik 30 patienter lindrende behandling, og 11 havde ingen behandling. Demografiske og kliniske karakteristika er sammenfattet i tabel 1.

HPV-infektion og genotyper i HNC

HPV-DNA blev påvist i 30,1% (63/209) af de 209 patienter, og den oropharynx var stedet for højeste forekomst (45,9%, 34/74). Genotypebestemmelse af neoplasmer viste, at de fleste af de HPV-DNA-positive prøver indeholdt højrisiko HPV-16 (86,9%, 53/63 tumorer). De andre HPV-typer omfattede HPV-33 (4 tilfælde), HPV-35 (2 sager), HPV-56 (1 tilfælde), HPV-58 (2 tilfælde), og HPV-67 (1 tilfælde). Der blev ikke fundet flere infektion eller lav risiko HPV-typer (Tabel 1).

Af de 63 HPV-DNA-positive prøver, 60 var til rådighed til RNA ekstraktion og HPV

E6 /E7

mRNA-ekspression blev fundet i 23 (38,3%) af dem. Interessant, det meste af HPV

E6 /E7

mRNA-positive tumorer (87,0%; 20/23) afledt af oropharynx. Mens 60,6% (20/33) af HPV-DNA-positive OPCs var positive for viral HPV mRNA-ekspression, HPV

E6 /E7

mRNA-transkripter blev fundet i kun 3 ud af 27 (11,1%) ikke-svælg HNCs, stammer fra næsesvælget, strubehoved, eller mundhulen (tabel 2).

Analyse af den statistiske sammenhæng mellem HPV-infektion status og histoclinical funktioner afslørede ingen signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​HPV-DNA og køn, alder , TNM stadie, eller nodal fase. HPV-DNA var mere sandsynligt at finde i ikke-rygere eller lette rygere (dvs. Brinkman indeks 400;

P

= 0,030). Desuden blev der observeret signifikante korrelationer mellem HPV status og tumor placering (

P

= 0,002) og mellem HPV-status og tumor differentiering (

P

0,001).

EBV infektion, genotyper, og 30 bp sletning

LMP-1

variant i HNC

Som angivet i tabel 2, PCR-amplifikation af

EBNA-3C

gen viste EBV DNA i 146 (69,9%) af de 209 HNC prøver: 107 (73,3%) indeholdt type A, 27 (18,5%) indeholdt type B og type A og type B blev fundet sammen i 12 (8,2%) tilfælde. Vi undersøgte også forekomsten af ​​

LMP-1

variant og fundet

del-LMP-1

i 124 (84,9%) af 146

EBNA

-positive tilfælde. Næsten alle type A EBV sager (98,1%; 105/107) indeholdt

del-LMP-1

, mens lidt over halvdelen af ​​typen sager B (63,0%; 17/27) indeholdt vildtype

LMP-1 Hotel (

P

0,001).

forekomsten af ​​EBV DNA ved subsite var 95,0% (19/20), 79,7% (59/74), 64,0 % (32/50), 50,0% (14/28), og 59,5% (22/37) i tumorer fra nasopharynx, oropharynx, hypopharynx, strubehoved, og mundhulen hhv. Af de 17 NPC prøver indeholdende type A EBV, 16 (94,1%) viste

del-LMP-1

, herunder 6 WHO type I tilfælde, 6 WHO type II sager, og 4 WHO type III sager.

for at bestemme tilstedeværelsen af ​​EBV-infektion i tumorceller,

EBER

blev også undersøgt af ISH i alle HNC prøver (figur 2). I modsætning til den høje forekomst af EBV-DNA identificeres ved PCR, kun 6,2% (13/209) af HNCs var positive for

EBER

. EBV infektion i HNC var primært lokaliseret i næsesvælget (92,3% [12/13] i

EBER

-positive tumorer, nasopharynx vs ikke-nasopharynx HNC,

P

0,001).

EBER

blev påvist i 60,0% (12/20) af patienterne med NPC, herunder 2 (22,2%, 2/9) med WHO type I, 6 (100%, 6/6) med WHO type II og 4 (80%, 4/5) med WHO type III, men i kun 1,4% (1/74) af patienterne med OPC. Ingen af ​​de

EBER

-positive sager afledt af hypopharynx, strubehoved, eller mundhulen

Mikrograf A:. Fleste af neoplasme cellerne var positive (nasopharynx karcinom, × 100, bar = 100 um), som angivet ved pilen ved stor forstørrelse (x 200). Mikrograf B: selv om nogle positive lymfocytter er tydelige (pil), ingen neoplasme celler var positive. Mikrografer C og D:. Sektioner farvet med hæmatoxylin og eosin (HE)

HPV og EBV co-infektion i HNC

Både HPV-DNA og EBV DNA blev påvist ved PCR i 45 (21,5%) af de samlede 209 patienter. Men af ​​de 13

Eber

-positive HNCs, kun 2 var, HPV-16 positive og begge afledt fra næsesvælget. Da EBV infektion i HNC er defineret som

Eber

-positive tumorceller ved ISH, co-infektion satser af HPV og EBV i HNC og NPC var kun 1,0% og 10,0%, henholdsvis (tabel 3). Selvom HPV-infektion var mest almindelig i OPC, ingen af ​​de 34 HPV DNA-positive OPC sager blev co-inficeret med EBV, som bekræftet af

EBER

ISH.

Survival analyse

Da der ikke var tilstrækkelig væv til mRNA detektion i et tilfælde, vi vurderet de behandlingsresultater af 73 OPC patienter baseret på HPV-status. Fifty-fire patienter med tidligere ubehandlet primær OPC havde komplet remission efter primær kurativ behandling, 5 viste vedvarende sygdom efter helbredende behandling, 10 undergik palliativ behandling, og 4 havde ingen behandling. Median opfølgning for patienter, hvis data blev censureret var 41 måneder (interval, 3-86 måneder). Ved seneste opfølgning, 18 (24,7%) af de 73 OPC patienter var døde af sygdommen, og 2 var døde af ubeslægtede sygdomme. Kaplan-Meier analyse viste, at ingen signifikante forskelle i sygdomsspecifikke overlevelse eller total overlevelse mellem OPC patienter med HPV-DNA + og OPC patienter med HPV DNA- (

P

= 0,332 og

P

= 0,378 henholdsvis;. figur 3). Men sammenlignet med OPC patienter med HPV mRNA- (dvs. begge OPC patienter med HPV-DNA + /mRNA- og OPC patienter med HPV DNA- /mRNA-), OPC patienter med HPV-DNA + /mRNA + havde bedre sygdomsspecifikke og generelle overlevelsesrater (

P

= 0,027 og

P

= 0,017, henholdsvis). Det 3-års sygdomsspecifikke overlevelse var 95,0% (95% CI = 85,5% -100%) i kohorten med HPV-DNA + /mRNA + og 73,8% (95% CI = 61,4% -86,1%) i kohorten med HPV DNA + /mRNA- eller HPV DNA- /mRNA-.

sygdom-specifik overlevelse og samlet overlevelse var signifikant bedre i HPV-DNA-positive /mRNA-positive OPC patienter end i HPV-DNA-positive /mRNA-negative og HPV-DNA-negative /mRNA-negative OPC patienter. Dog blev der ikke fundet signifikante forskelle i sygdomsspecifikke overlevelse eller total overlevelse mellem HPV-DNA-positive og HPV-DNA-negative OPC patienter.

For at vurdere den uafhængige prædiktiv værdi af alle disse faktorer for sygdoms- specifik overlevelse i OPC, univariate og multivariate analyser ved hjælp af Cox proportional-farer modeller blev udført. I univariat analyse, OPC patienter med HPV-DNA + /mRNA + status viste signifikant højere sygdomsspecifikke overlevelse (

P

= 0,029; hazard ratio (HR) = 0,12; 95% konfidensinterval (CI) = 0,01-0,99) end de andre OPC patienter (tabel 4). OPC patienter kategoriseret som stadie T4, nodal etape 2-3, og tunge alkohol drikker (alkohol per dag 50 g) havde signifikant lavere sygdomsspecifikke overlevelse (T4,

P

= 0,002, HR = 0,15, 95 % CI = 0,04-0,50; nodal etape 2-3,

P

= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 1,01-12,03, tung alkohol drikker,

P

= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 1,01-12,03) sammenlignet med patienter kategoriseret som stadie T1-3, nodal etape 0-1, og lette rygere og ikke-rygere. Den endelige model af multivariat analyse ved hjælp af en Cox proportional hazard model til identifikation af rimelig sygdomsspecifikke overlevelse OPCs viste, at fase T1-3 (

P

= 0,002; justeret HR = 0,22; 95% CI = 0.08- 0,56) og HPV mRNA-positive status (

P

= 0,061; justeret HR = 0,15; 95% CI = 0,02-1,10) forudsagde bedre sygdomsspecifikke overlevelse (tabel 4)

Derudover har vi vurderet prognoser i de 54 OPC patienter, som havde komplet remission efter primær kurativ behandling. Det 3-års gentagelse overlevelse var 100% for OPC patienter med HPV-DNA + og 75,1% (95% CI = 59,1% -91,2%) for OPC patienter med HPV DNA- (

P

= 0,002) ( Figur 4A). Således 3-års sygdomsspecifikke overlevelse i HPV DNA + OPC patienter var signifikant bedre end i de HPV DNA- patienter (100% vs 88,9%,

P

= 0,015) (figur 4B). Interessant, HPV mRNA + OPC patienterne også udstillet væsentligt bedre gentagelse overlevelse end HPV mRNA- OPC patienter (

P

= 0,032) (figur 4C), og de 3-årige gentagelse-fri overlevelse var 100% og 80,4%, hhv. Men OPC patienter med HPV mRNA + demonstrerede kun en lidt stærkere tendens til rimelig sygdomsspecifikke overlevelse sammenlignet med OPC patienter med HPV mRNA- (100% vs. 91,2%,

P

= 0,080) (figur 4D).

Efter helbredende behandling, viste HPV-DNA-positive OPC patienter markant bedre gentagelse overlevelse og sygdomsspecifikke overlevelse i forhold til HPV-DNA-negative OPC patienter. Lignende resultater blev fundet i HPV mRNA-positive OPC patienter.

For at vurdere indflydelsen af ​​EBV om overlevelse for patienter med NPC, blev patienterne stratificeret efter påvisning af

EBER

. Blandt 20 patienter med NPC, 18 blev behandlet lokalt og behandling detaljer og resultatet var tilgængelige fra diagnosetidspunktet for disse patienter. Den mediane follow-up tid var 21 måneder (interval, 3-63 måneder). Selv patienter med

EBER

-positiv NPC viste en tendens til forbedret sygdomsspecifikke overlevelse sammenlignet med patienter med

EBER

ekskluderet NPC, blev ingen signifikant forskel mellem de to kohorter (

P

= 0,155) (figur 5A). Ligeledes 16 sager modtaget helbredende samtidig kemostråleterapi til primær karcinom, og ingen signifikant forskel i sygdomsspecifikke overlevelse blev fundet mellem

EBER

-positiv NPC og

EBER

-negative NPC kohorter (

P

= 0,381) (figur 5B).

nogen signifikante forskelle i satserne for sygdomsspecifikke overlevelse blev fundet mellem

EBER

-positiv (tumor EBV infektion) og

Eber

-negative NPC patienter.

diskussion

den overordnede HPV prævalens i HNC var lidt højere i nærværende undersøgelse (30,1%) end i internationale undersøgelser, som har rapporteret 25,9% HPV-DNA-positive sager for disse tumor enheder [39]. Desuden er vores analyseresultater var i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at oropharynx var det underordnede websted i højeste forekomst af HPV i HNC, og de mest almindelige virale genotype i HPV-associerede HNC var HPV-16 [39], [40]. I modsætning til livmoderhalskræft, hvor HPV

E6 /E7

udskrifter er identificeret i de fleste HPV-DNA-positive prøver [41], kun 38,4% af HPV-DNA-positive HNC sager viste HPV

E6 /E7

mRNA positivitet i den foreliggende undersøgelse.

E6 /E7

mRNA betragtes som en markør for HPV malign transformation, og demonstrere onkogene

E6 /E7

transskription kan antyde, at HPV-drevet carcinogensis er mekanistisk muligt, mens HPV-DNA-positive /RNA-negative resultater kan simpelthen afspejle enten lavt niveau transkription eller ikke-transkriptionel aktiv, og muligvis en “passager” infektion. Det faktum, at cirka 90% af tilfældene med transkriptionelt aktiv HPV opstod i oropharynx støttede begrebet et tæt forhold mellem HPV og OPC. Tidligere undersøgelser har vist, at den virale belastning af HPV-DNA udviser stor variation blandt hoved og hals regioner, og kopiere numre af DNA i OPCs var langt højere end i ikke-oropharynx HNCs. Den relative lave mangfoldighed af HPV-infektion i ikke-oropharynx hoved og hals sites, herunder hypopharynx, strubehovedet, og mundhulen, kan korrelere til lav

E6 /E7

mRNA-ekspression i tumorer på disse steder [42], [43]. Desuden Wiest rapporterede, at de fleste tumorer, som ikke udtrykker

E6 /E7

indeholde en muteret

p53

gen, hvor E6-genet er hyppigt afbrudt. Manglen på

E6 /E7

udtryk kan skyldes E6 genet forstyrrelser eller ændringer i transkriptionel kontrol [38].

I tidligere undersøgelser, patienter med NPC i Taiwan almindeligt viste en højere forekomst af HPV (35-51%) [44], [45], [46] end i Europa og USA (9-27%) [47], [48], [49]. Derudover er omkring 22% af mundhulen SCC tilfælde i Taiwan harbor højrisiko HPV-DNA [50], [51]. Interessant i den foreliggende undersøgelse, en relativ høj forekomst af HPV blev også fundet i nogle ikke-svælg HNCs, såsom NPC (30,0%) og mundhulen SCC (29,7%). De fleste af vores patienter blev rekrutteret fra Okinawa, en sydlig ø i Japan meget nær til Taiwan, der geografisk og racemæssigt kan foreslå forskellige HPV kendetegn, og at onkogen HPV kan være forbundet med en delmængde af carcinomer involverer nasopharynx og mundhulen. I betragtning af de lave afsløring satser af

E6 /E7

mRNA-transkripter, dog kræver yderligere afklaring rolle HPV i disse ikke-oropharynx HNCs.

Denne undersøgelse ved hjælp af PCR på frisk-frosne prøver fra NPC’ere viste, at EBV type A er fremherskende og

del-LMP-1

er almindeligt i den japanske befolkning, konstateringer, som er enige med data indhentet fra den samme slags prøver indsamlet i det sydøstlige Asien og Nordafrika [19], [20], [52], [53]. Det modsatte er blevet observeret i prøver fra de europæiske EBV-associerede NPC-patienter og raske donorer, hvor vildtype

LMP-1

isolater er mere fremtrædende end

del-LMP-1

varianter [54 ]. Den 30 bp sletning

LMP-1

varianter udviser transformation aktivitet og fremkalde tumorigene forandringer, og sletningen protein har en længere halveringstid og en større evne til at aktivere NF-kB og JNK /AP1 i epitelceller, således bidrage til en mere ondartet NPC fænotype [18], [55]. Distributionsselskaberne karakteristika EBV varianter kan foreslå større tumorigent potentiale

del-LMP-1

i endemiske områder i Sydøstasien og Nordafrika sammenlignet med vildtype-EBV. Men modstridende resultater af ingen signifikante forskelle i hyppigheden af ​​

del-LMP-1

i halsen-vask prøver mellem endemiske og ikke-endemiske regioner i Kina [56] understreger, at det er nødvendigt i fremtidig forskning at afklare, om

del-LMP-1

er faktisk en NPC fænotype-korreleret polymorfi og ikke en geographical- eller etnicitet-relateret polymorfi.

Selvom godt halvdelen af ​​tilfældene med EBV type B indeholdt vildtype

LMP-1

fleste tilfælde med EBV type A indeholdt

del-LMP-1

. Vores resultater er i konkordans med en tidligere undersøgelse fra Korea [19], hvor de fleste (87%) af den type A EBV udstillet

del-LMP-1

variant og type B EBV udstillet Wild- skriv

LMP-1

oftere. Interessant vildtype

del-LMP-1

blev ikke kun findes i 64,3% af type B EBV men var fremherskende (64,1%) i type A EBV i perifere mononukleære blodceller fra raske bærere [57]. Desuden Correa et al undersøgte 7 AIDS-patienter med primær centralnervesystemet lymfom og fandt, at

del-LMP-1

blev altid opdaget med type B EBV [58], som var forskellig fra resultaterne i NPC. Tilsammen den stærke sammenslutning af EBV type og

LMP-1

varianter kan være på grund af de iboende egenskaber ved EBV.