PLoS ONE: TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2) Aktivering Fremmer Androgen Udtømmelse-Independent (ADI) Prostata Cancer Vækst

​​

Abstrakt

Baggrund

På trods af sin oprindelige positive reaktion på hormon ablation terapi, prostatakræft uvægerligt gentage sig i mere aggressive, behandling resistente former. Manglen på vores forståelse af de underliggende genetiske ændringer i forbindelse med overgangen fra androgen-afhængige (AD) til ADI prostatakræft vækst hæmmer vores evne til at udvikle målrettede drevet terapeutiske strategier til effektiv behandling af ADI prostatakræft.

Metode /vigtigste resultater

Ved at screene et bibliotek af aktiverede humane kinaser, har vi identificeret

TPL2

, der koder for en serin /threonin-kinase, som kørsel ADI prostatakræft vækst. TPL2 aktivering ved over-udtrykker enten vildtype eller en konstitutivt aktiveret form af TPL2 induceret ADI vækst, hvorimod undertrykkelsen af ​​

TPL2

Udtrykket og kinaseaktivitet i ADI prostatacancerceller inhiberede celleproliferation under androgen-depleterede betingelser . Vigtigst,

TPL2

opreguleres i ADI prostata kræft i både

PTEN

sletning musemodel og de kliniske prostatakræft prøver.

Konklusioner /Betydning

Sammen antyder disse data, at

TPL2

kinase spiller en kritisk rolle i fremme af ADI prostatakræft progression. Desuden undertrykkelsen af ​​TPL2 formindsker ADI prostatakræft vækst og en høj frekvens af TPL2 overekspression i humane ADI prostatakræft prøver validerer TPL2 som mål for behandling af denne dødelige sygdom

Henvisning:. Jeong JH, Bhatia A , Toth Z, Oh S, Inn KS, Liao CP, et al. (2011)

TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2)

Aktivering Fremmer Androgen Udtømmelse-Independent (ADI) Prostata Cancer Growth. PLoS ONE 6 (1): e16205. doi: 10,1371 /journal.pone.0016205

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: September 7, 2010; Accepteret: 8. december 2010; Udgivet: 18 Jan 2011

Copyright: © 2011 Jeong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret og støttet af DoD 060.868 og ACS tilskud IRG-58-007-48 til JHJ, NIH giver CA 109.147 og R01 CA 136.924 til GAC, NIH giver CA 59.705 og CA 113.392 til PRB, og CA082057, CA31363, CA115284, AI083025, DE019085, CA148616, Hastings Foundation, og Fletcher Jones Foundation til JUJ. (https://cdmrp.army.mil/, https://www.cancer.org/, https://www.nih.gov/, https://www.fletcherjonesfdn.org/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft rammer en i 6 amerikanske mænd, med mere end 2 millioner i øjeblikket lever med sygdommen. Kirurgi er effektiv, med næsten 100% af de patienter, resterende kræft-fri i flere år, hvis sygdommen opdages tidligt, og kræftcellerne er begrænset til [1] prostata. Men når kræften spreder ud over prostata, resultatet er næsten altid dødelig. Da prostatacancerceller kræver testosteron til brændstof deres vækst og overlevelse, er androgen-deprivationsbehandling blevet designet til at standse cancervækst ved enten at stoppe produktionen af ​​testosteron eller forebyggelse hormonet i at virke på prostatacancerceller [2]. På trods af den indledende positive respons på hormonbehandling, prostatacancerceller uvægerligt gentage sig i en aggressiv, androgen udtømning-uafhængig (ADI) formular. Mens genetiske ændringer i forbindelse med initiering og progression af prostatakræft er blevet intensivt studeret [3], [4], [5], [6], [7], der ligger til grund for overgangen fra androgen-afhængige (AD) til ADI prostata kræft vækst relativt mindre godt forstået. Denne mangel på forståelse hæmmer vores evne til at udvikle target-drevet terapeutiske strategier til effektiv behandling af ADI prostatacancer.

I nærværelse af androgen, androgen receptor (AR) undergår phosphorylering, dimerisering, og translokation ind i kerne, hvor det binder til androgen responselementer (ARE) sites, hvilket resulterer i den transkriptionelle aktivering af målgener [8]. Men overbevisende data, herunder RNAi knockdown og indførelsen af ​​antagonister af androgen receptor (AR), indikerer, at AR er stadig nødvendig for vækst ADI prostatakræft [9], [10], [11]. Derfor under androgen-udtømte betingelser, ADI prostatacancerceller synes at udvikle intracellulære strategier, der aktiverer AR signalvejen. Der er blevet foreslået mange underliggende mekanismer: øget

AR

udtryk gennem

AR

genamplifikation, øget

AR

følsomhed gennem øget AR stabilitet og nuklear lokalisering, udvidet AR ligand specificitet gennem mutationer i dens ligand-bindende domæne, og øget AR aktivitet gennem post-translationelle modifikationer [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. På den anden side, på anvendelse af andre signaltransduktionsveje, såsom BCL-2-aktivering, kan også omgå fornødne af AR aktivering for spredning og overlevelse af prostatacancerceller [19]. Endelig en allerede eksisterende underpopulation af ADI prostatacancerceller med stamfader /stamceller træk kan blive dominerende under androgen-udtømte betingelser [20].

Mange undersøgelser viser, at aktiveringen af ​​RAS /RAF /MEK /ERK-vejen kan være korreleret med ADI prostatakræft vækst [5], [13], [21], [22]. For nylig er en gensplejset mus (GEM) model, hvor ekspressionen af ​​en potent aktivator af RAS-MAPK signalering, B-RAF

E600, målrettes mod prostata epitel under anvendelse af et tet-inducerbare system, udviklet invasiv adenokarcinom , og dette yderligere skred til indolent ADI læsioner efter kastration [23]. Men counter-intuitivt, aktiverende mutationer i RAS /RAF /MEK /ERK-vejen er sjældne i humane prostatakræft, selvom autokrine og parakrine vækstfaktor sløjfer synes at aktivere vej [24], [25]. Vigtigere er det, foreslog en nylig undersøgelse, at kromosomale rearrangementer af RAF-kinase pathway er en yderligere kilder til MEK /ERK signalering aktivering, der bidrager til prostatakræft udvikling og progression [26].

For at identificere nye kinase gener relateret til ADI prostatakræft vækst, screenede vi et bibliotek af aktiverede humane kinaser. Her rapporterer vi identificering af en serin /threoninkinase,

TPL2

, som kørsel ADI prostatakræft vækst gennem aktivering af MEK /ERK-signalvejen og NF-KB. Dette giver et fingerpeg til at finde yderligere kilder til MEK /ERK-aktivering i ADI prostatakræft. Desuden undertrykkelsen af ​​TPL2 formindsker ADI prostatakræft vækst og en høj frekvens af TPL2 overekspression i humane ADI prostatakræft prøver validerer TPL2 som mål for behandling af denne dødelige sygdom.

Resultater

Identifikationen af ​​TPL2, ved screening af et bibliotek af aktiverede humane kinaser

for at identificere nye kinase gener relateret til ADI prostatakræft vækst, vi screenede et bibliotek af 354 aktiverede humane kinaser bestående af 98 kinase-relaterede åbne læserammer ( ORF’er) og 256 humane kinaser klonet i en gateway-kompatibel retroviral destination vektor, pWN-MF-DEST, hvori en myristoylering sekvens og en FLAG-epitop-mærke (MF) blev tilsat til N-terminalerne af hver indført ORF [27] . Som udlæsning til skærmen, brugte vi en reporter konstruktion, der indeholder

cis

reguleringsmyndigheder promotor-regionen (5,8 kb, der indeholder en

AR

forstærker) af prostata-specifikt antigen (

PSA

) genet, som er overudtrykt i den normale prostata epitel og i prostatatumorer [28], [29]. Promotor /enhancer-aktivitet kan måles ved en kondenseret

Luciferase

reportergen (figur 1A). For at kunne identificere mulige kinase gener i stand til at inducere transkriptionelle aktivitet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region under androgen-udtømte betingelser, hver kinase konstruktion, sammen med reporter plasmidet blev co-transficeret ind i individuelle brønde i en 12-brønds plade indeholdende androgen-afhængige LNCaP (AD-LNCaP) celler dyrket i medium suppleret med R1881, et syntetisk androgen (Figur 1A). Fireogtyve timer efter transfektion blev AD-LNCaP-celler inkuberet med medium indeholdende 10% trækul-strippet føtalt bovint serum (CS-FBS) uden R1881. Efter 24 timers inkubation transkriptionel aktivitet af

PSA

enhancer /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region under androgen-depleterede betingelser blev målt ved luciferase assays. Ud af 354 aktiverede humane kinase gener, ekspressionen af ​​

TPL2

gen i AD-LNCaP-celler inducerede det højeste niveau af PSA transkriptionsaktivitet i fravær af R1881 (figur 1B øvre). Som kontroller, andre onkogener, såsom

RAF

og

RAS

der tidligere har været kendt for at være forbundet med vækst ADI prostatacancer, blev medtaget [5], [22], [23] , [26], [30]. Deres udtryk faktisk induceret transkriptionel aktivitet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region under androgen-udtømte betingelser til nogle men mindre grad end

TPL2

. Men når det afprøves i androgen receptor (AR) -negative DU-145 prostatacancerceller,

TPL2

inducerede ikke ADI transkriptionel aktivitet, hvilket antyder, at AR-ekspression er nødvendig for ADI transkriptionel aktivering af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region induceret af

TPL2

(figur 1B midten, bemærk ændringen i omfanget af Y-aksen). På den anden side viste androgen udtømning-uafhængig C4-2B (ADI-C4-2B) celler af høj endogene niveauer af transkriptionel aktivitet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region i fravær af R1881 (figur 1B nederst). Disse data hæve den mulighed, at allerede eksisterende genetiske og epigenetiske ændringer i ADI-C4-2B celler bidrager til det høje endogene niveau af ADI transkriptionel aktivitet drevet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder område. Det skal bemærkes, induktion af transkriptionel aktivitet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region af

TPL2

overekspression i AD-LNCaP celler var mere slående (større end 20 gange) ved lave niveauer (0.1~0.001 nM) af R1881, som er sammenlignelige med de fysiologiske niveauer af androgen i patienter, der har gennemgået kastration kirurgi (figur 1C). Endvidere blev ADI transkriptionsaktivering ophæves med en TPL2 hæmmer behandling, når enten med TPL2 overekspression i AD-LNCaP celler eller blot med endogen TPL2 udtryk i ADI-C4-2B celler (Figur 1D). For at teste den mulighed, at den høje endogene niveau af ADI transkriptionsaktivitet af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region i ADI-C4-2B celler kan skyldes øget TPL2 udtryk, vi sammenlignet ekspressionsniveauet af

TPL2

i AD-LNCaP og ADI-C4-2B celler. Faktisk viste ADI-C4-2B celler højere niveau af

TPL2

udtryk end i AD-LNCaP celler (Figur S1A). Endvidere i C4-2B celler, PSA enhancer /promotor-aktivitet reagerer på lave niveauer af exogent TPL2 ekspression, men ikke for høje niveauer af TPL2 ekspression (fig S1B). Det er muligt, at høje niveauer af TPL2 eksogene udtryk i C4-2B celler, som allerede udtrykker et højere niveau af endogen TPL2 udtryk end LNCaP celler, resulterer i skadelige virkninger på PSA forstærker /promotor-aktivitet. Derfor har vi identificeret

TPL2

som kandidat onkogen, der kan være forbundet med vækst ADI prostatakræft.

(A) Skematisk af identifikation af kandidatgener, der kan fremkalde den transkriptionelle aktivering af en

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region reporter konstruere under androgen-udtømte forhold i androgenafhængige LNCaP celler. Myr, myristoylering sekvens; ER, androgen respons elementer; CS-FBS, kul-strippet føtalt bovint serum. (B) Relativ LUC aktivitet (

PSA

enhancer /promotor Luciferaseaktivitet er normaliseret til pGL3 beta-galactosidase aktivitet) blev målt efter 24 timers inkubation med 10% CS-FBS uden R1881 (bortset fra den anden kolonne med 10% CS-FBS + 1 nM R1881 som en kontrol) efter co-transfektion af plasmider, der udtrykker konstitutivt aktiverede former af de angivne kinase gener. De fold induktion værdier (relativ LUC aktivitet divideret med den relative basale LUC aktivitet af vektoren kontrol) er angivet i grafen for LNCaP celler. Relativ LUC aktiviteter upon

TPL2

udtryk er angivet med rødt. Statistisk signifikante stigninger i LUC aktiviteter i forhold til vektor kontrol uden R1881 behandling er markeret med * (p 0,05). (C) Relativ LUC aktivitet med stigende koncentration af R1881 i LNCaP-celler transient co-transficeret med enten plasmider, der udtrykker myristoylerede

TPL2

eller med tom vektor. Statistisk signifikante stigninger i LUC aktivitet i forhold til hver tilsvarende R1881 koncentration med vektor kontrol er markeret med * (p 0,05). (D) Relativ LUC aktivitet med stigende koncentration af TPL2 inhibitor enten i AD-LNCaP-celler transient co-transficeret med plasmider, der udtrykker myristoylerede

TPL2

eller i utransficerede AI-C4-2B celler. Relative LUC aktiviteter med /uden R1881 er angivet i sort som kontroller. Statistisk signifikante stigninger i LUC aktiviteter i forhold til vektor kontrol uden R1881 behandling er markeret med * (p 0,05). Alle forsøgene blev udført tre gange med hver i tre eksemplarer, og hver kolonne repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.

TPL2 Aktivering inducerer ADI Vækst af AD prostatacancerceller

For at verificere om

TPL2

er funktionelt forbundet med ADI prostatakræft cellevækst, vi undersøgte de funktionelle konsekvenser af overekspression eller undertrykkelse af

TPL2

i AD eller ADI prostatacancerceller hhv. For det første, at afgøre, om

TPL2

overekspression er tilstrækkelige til at fremme ADI prostatakræft vækst, vi etableret AD-LNCaP stabil cellelinjer overekspression enten N-terminalt myc-mærket vildtype [

myc-TPL2

(WT)], en konstitutivt aktiveret form med en sletning af 70 aminosyrer i sin C-terminalen [

myc-TPL2 Hotel (ΔC)], eller en kinase-inaktiv form af

TPL2

[

myc-TPL2 Hotel (D270A)] ved hjælp af pBabe-puro vektor (figur 2A). Ekspressionen af ​​hvert transducerede gen blev bekræftet ved Western blot (figur 2B). Interessant, udtryk for

myc-TPL2 Hotel (ΔC) konstitutivt aktiveret mutant var lavere end for

myc-TPL2 Hotel (WT) og

myc-TPL2

D270A mutant trods har den højeste grad af fosfor-ERK, en nedstrøms signalering molekyle (Figur 2B). For at eliminere muligheden for udtrykket niveau effekter, vi etableret et andet sæt af AD-LNCaP stabil cellelinjer, der over-udtrykker enten C-terminalt flag-mærket vildtype (

TPL2

-wt-flag), et konstitutivt aktiveret form med en sletning af 70 aminosyrer i C-terminalen (

TPL2

-delC-flag), eller en kinase-inaktiv form af

TPL2

(

TPL2

– inaktiv-flag) under anvendelse af pEF-IRES-puro-vektoren (figur S2). Denne betingelse viste også den nederste udtryk for

TPL2

-delC-flag end

TPL2

-wt-flag og

TPL2

Inaktiv-flag (figur S2), hvilket tyder på, at udtryk for en konstitutivt aktiveret form af

TPL2

over fysiologiske niveauer kan have negative virkninger på cellen. Men uanset

TPL2

ekspressionsniveauerne overordnede LNCaP celler, der udtrykker enten

myc-TPL2 Hotel (WT) eller myc-

TPL2

(ΔC) viste accelereret celledeling på androgen- berøvet, Lavt, og rig betingelser i forhold til LNCaP celler udtrykker enten vektor alene eller myc-

TPL2

(D270A) mutant (Figur 2C). Især LNCaP-celler, der udtrykker myc-

TPL2

(ΔC) viste statistisk signifikante stigninger i celleproliferation i sammenligning med kontrolceller (LNCaP-GFP) under androgen-depleterede tilstand og ved lave niveauer af R1881 (0,01 nM og 0,1 nM) ved 3, 6, 9 dage (* p-værdi 0,05). Lignende data blev opnået med stabile cellelinier konstrueret med pEF-IRES-puro-vektoren (figur S2). Derfor er disse data viser, at

TPL2

aktivering ved over-udtrykker enten vildtype eller en konstitutivt aktiveret form af TPL2 fører til fremme af ADI væksten af ​​AD-LNCaP-celler.

(A ) Skematisk af etablerede stabile LNCaP cellelinjer overekspression enten

GFP

, et myc-mærket vildtype

TPL2

[

myc-TPL2 Hotel (WT)], en myc- tagged konstitutivt aktiverede form af

TPL2

med en trunkering af 70 aminosyrer i dets C-terminus [

myc-TPL2

(ΔC)], eller et myc-mærket kinase-inaktiv form af

TPL2

[

myc-TPL2 Hotel (D270A)] ved hjælp af pBabe-puro ekspressionsvektoren. (B) Western blot-analyse til påvisning af ekspression af

TPL2

konstruerer ovenfor (som angivet med pile i rødt). β-actin blev anvendt som en kontrol for at indlæse den samme mængde proteiner. (C) MTT-assays til måling af celleproliferation af de stabile cellelinier ovenfor i fravær eller med lave niveauer af R1881 (0,01 nM, 0,1 nM og 1 nM). Statistisk signifikante stigninger i celle proliferation i forhold til at styre celler (LNCaP-GFP) er markeret med * (p 0,05).

Den Undertrykkelse af TPL2 Expression eller Hæmning af dens kinase aktivitet i ADI Prostata Cancer celler resulterer i reduceret spredning fænotyper

Næste, at afgøre, om ADI prostatacancerceller er afhængige af

TPL2

for deres ADI cellevækst, vi undertrykt

TPL2

ekspression eller aktivitet enten ved shRNA-medieret knockdown eller ved TPL2 inhibitor behandling hhv. Som vist i figur S1,

TPL2

ekspression var højere i ADI-C4-2B celler end i AD-LNCaP-celler. Den reducerede ekspression af

TPL2

i ADI-C4-2B celler ved shRNA-medieret knockdown vha pLKO.1-TRC-vektoren blev bekræftet ved Western blot (figur 3A). ADI-C4-2B celler med en reduceret ekspression af

TPL2

viste signifikant reduceret proliferationshastighed under androgen-depleterede betingelser (figur 3B). Vi bekræftede disse data med yderligere shRNA-medieret knockdown systemet ved hjælp af pGIPZ lentiviral vector (Fig S3). Endvidere ADI cellevækst af ADI-C4-2B celler var også signifikant reduceret ved behandling af en TPL2 inhibitor [Figur 3C; De 50% hæmmende koncentration (IC

50) af 4,0 uM blev bestemt som i figur S4]. Undertrykkelsen af ​​MEK /ERK pathway i ADI-C4-2B celler med behandlingen af ​​TPL2 blev bekræftet ved Western blot (figur 3D). Tilsammen udgør disse data viser, at

TPL2

aktivering er nødvendig for en effektiv ADI væksten af ​​ADI-C4-2B celler.

(A) Western blot-analyse for at vise mængden af ​​

TPL2

ekspression i de stabile C4-2B cellelinjer, der udtrykker de angivne shRNAs hjælp af pLKO.1-TRC lentiviral vector på tidspunktet for den følgende MTT-assayet. β-actin blev anvendt som en kontrol for at indlæse den samme mængde proteiner. (B) MTT-assays til at måle celleproliferation af de stabile cellelinier i fravær af R1881. * P 0,05. (C) MTT-assays til måling af celleproliferation af androgen depletion-uafhængig C4-2B celler med behandlingen af ​​TPL2 inhibitor (4 uM). (D) Undertrykkelsen af ​​MEK /ERK vej hos ADI-C4-2B celler med stigende koncentration af et TPL2 inhibitor blev bekræftet ved Western blot.

TPL2 Aktivering Fremmer ADI prostatakræft Væksten i PTEN sletning mus Model

Tidligere det var blevet påvist, at biallele betinget PTEN sletning i prostata epitel kunne fremkalde adenocarcinom, der sammenfatter de fleste af de histopatologiske træk af human prostatacancer [31], [32], [33]. Vigtigere, androgen ablation af disse mus ved kirurgisk kastration førte til fremkomsten af ​​ADI prostatakræft vækst (figur 4A) [33]. For nylig blev prostatakræft-cellelinier etableret fra primære prostata kræft i

PTEN

sletning model [34]. Efter langtidsdyrkning af disse celler under androgen-depleterede betingelser, ADI prostatacancerceller-lignende celler betegnet som “E” celler udviklet efter et første massiv celledød af AD-celler. Derudover blev prostatakræft-cellelinier også etableret fra tilbagevendende ADI prostatacancer, der er udviklet efter kirurgisk kastration og navngivne “CE” celler [34]. I modsætning til de E-celler er disse CE cellelinjer androgen depletering-uafhængig fra begyndelsen, således at der ikke var nogen indledende massiv celledød under androgen-depleterede betingelser. For at undersøge om

TPL2

aktivering er fysiologisk relevant for ADI tumorvækst

in vivo

, vi først sammenlignede ekspressionsniveauerne af

TPL2

mellem E-cellelinjer (E2 og E4) og CE-cellelinier (CE1, CE2 og CE3). CE cellelinier (CE1, CE2, og CE3) viste højere niveauer af

TPL2

udtryk i forhold til E-cellelinjer (E2 og E4) ved Western blot og immunhistokemi (figur 4B og 4C). Interessant nok viste E-cellelinier lidt højere niveauer af

AR

ekspression end CE cellelinier, hvilket antyder, at E-cellelinier kan have opnået ADI vækst selvom AR overekspression (figur 4B). ADI cellevækst af CE-celler (CE1, CE2, og CE3) blev mere især påvirket end E-celler (E2 og E4), når behandlet med stigende niveauer af en TPL2 inhibitor (figur 4D). Kollektivt, disse observationer tyder på, at

TPL2

er også påkrævet for effektiv ADI prostatakræft cellevækst i musemodel.

(A) Skematisk af “Pb-Cre4 :: PTEN

f /f :: β-Actinp-GFP

f /f-Luc “mus model, hvor

PTEN

alleler er homozygot slettet, og

Luciferase

udtrykkes i prostata epitel af prostata-specifikke

Probasin

promotor (Pb) -driven Cre rekombinase udtryk. Disse sammensatte mus udviklede prostata intraepitelialneoplasi (PIN), prostatisk invasiv adenocarcinom, og metastatisk prostatacancer på de angivne tidspunkter. Vigtigst, androgen ablation af disse mus ved kirurgisk kastration førte til fremkomsten af ​​ADI prostata kræft vækst på tidspunkter varierende fra 7 til 28 uger efter kastration i alle levende mus. E2 og E4 prostatacancercellelinjer blev fastsat indledningsvis fra primær prostatacancerceller før kastration, der senere udviklede ADI vækst ved langtidsdyrkning under androgen-depleterede betingelser. Imidlertid blev CE1, CE2 og Ce3 prostatacancercellelinjer etableret fra ADI prostatakræft efter kastration. Billeder (200X) er repræsentative for celle morfologier af E2 og CE1 celler. (B) Western blot-analyse for at sammenligne ekspressionsniveauerne af AR og TPL2 mellem E cellelinjer (E2 og E4) og CE cellelinier (CE1, CE2 og Ce3) celler.

β-actin

blev anvendt som en kontrol for at indlæse den samme mængde proteiner. AD, androgen-afhængige; ADI, androgen udtømning-uafhængig; og AR, androgen receptor. (C) immunhistokemisk analyse for at undersøge

TPL2

udtryk i AD og ADI prostata kræft i

PTEN

sletning musemodel. Human duodenum væv, der udtrykker høje niveauer af endogen TPL2 blev anvendt som en positiv kontrol (øverst til højre). Som en negativ kontrol blev vævet kun farves med det sekundære antistof (øverst til venstre). PCA prostataadenocarcinom. (D) MTT-analyser til at måle celleproliferation af E-celler (E2 og E4) og CE-celler (CE1 og Ce3) med behandling af forskellige niveauer af TPL2 inhibitor (0, 1, 5 eller 10 uM). Statistisk signifikante fald i celledeling i forhold til køretøjets behandling er markeret med * (p 0,05).

TPL2 udtryk opreguleres i humane ADI prostatakræft prøver

Endelig, for at validere den kliniske relevans af

TPL2

kinase handling i human ADI prostatakræft vækst, vi undersøgte hyppigheden af ​​

TPL2

udtryk i ADI menneskelige prostata cancer prøver vha væv microarrays (TMA). Vi evaluerede TPL2 immunfarvning af 12 normal (N), 52 hormon-naive (HN), 52 hormon-refraktær (HR), 26 hormon-naive metastatisk (HN Met), og 12 hormon-metastatisk (HR Met) formalinfikseret paraffin indlejrede prøver. Figur 5A viser repræsentative billeder af TPL2 ekspression af normal prostata, hormon-naive prostatacancer, og hormon-refraktær prostatacancer human prostata TMA prøver. Som vist i figur 5B, er den samlede farvning hyppigheden af ​​TPL2 steg i hormon-naive (34,8%) og hormon-refraktær (36,5%) prøver i sammenligning med normale prostata prøver (18,2%). Stigningerne er større i metastatisk prostatacancer prøver med 46,2% (p 0,05) af hormon-naive metastatisk og 41,7% af hormon-refraktær metastatiske prøver, hvilket antyder, at TPL2 ekspression også kan være forbundet med prostatacancer metastaser. Især score både det samlede gennemsnit farvning score og hyppigheden af ​​prøver med et stærkt belastende forøget med progressionen af ​​prostatacancer (figur 5B). Samlet set viser disse TMA data antyder, at TPL2 ekspression opreguleres med progressionen af ​​prostatacancer.

(A) Repræsentative billeder af hver normal prostata (N), hormon-naive prostatacancer (HN), hormon-refraktær prostatacancer (HR), hormon-naive metastatisk prostatacancer (HN Met), og hormon-refraktær metastatisk prostatacancer (HR Met) af de farvede humant prostatavæv microarrays. TPL2 ekspression blev påvist ved immunohistokemisk analyse under anvendelse af et antistof mod TPL2. (B) Statistisk analyse af TPL2 udtryk i hver gruppe N, HN, HR, HN Met, HR Met prøver af de farvede humane prostata væv microarrays i form af gennemsnitlige farvning scoringer og farvning procent. Statistisk signifikante forskelle i middel farvning score er markeret med * (p 0,05). Samlede stikprøve numre for hver gruppe noteres. Farvning intensitet blev scoret uafhængigt af to urologiske patologer med 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (mellemliggende farvning), og 3 (kraftig farvning) for hver prøve.

Diskussion

prostatakræft kan let behandles og helbredes, hvis det opdages i sin vorden, når tumorvækst stadig er begrænset til prostata. Men når kræften spreder ud over prostata, bliver, behandling vanskelig, selv om behandlingsmuligheder, såsom strålebehandling, hormonbehandling og kemoterapi anvendes med varierende grader af effektivitet. Fremkomsten af ​​en mere aggressiv, androgen udtømning-uafhængig (ADI) form for prostatakræft er komplikation hyppige forekomst og årsag til svigt af hormonbehandling. Derfor undersøgelser i forbindelse med identifikation og karakterisering af genetik underliggende ADI prostatakræft vækst er afgørende for den fremtidige udvikling af target-drevne terapeutiske strategier for effektiv behandling af ADI prostatakræft. I denne undersøgelse ved at screene et bibliotek af aktiverede humane kinaser, vi identificeret og karakteriseret en kinase gen,

TPL2

, der synes at køre ADI prostatakræft vækst. Endnu vigtigere er,

TPL2

opreguleres i ADI prostata kræft i både

PTEN

sletning musemodel og de kliniske prostatakræft prøver. Disse data tyder på, at

TPL2

kinase spiller en kritisk rolle i fremme af ADI prostatakræft progression.

TPL2

, også kendt som tumor progression locus 2, der koder for en produkt med en deletion af dets C-terminale region blev oprindeligt klonet som et transformerende gen fra en human skjoldbruskkirtel carcinom cellelinie, og det blev kaldt

cot

(kræft Osaka skjoldbruskkirtlen) [35]. Næsten samtidig blev det også identificeret som et protein kinase forbundet med udvikling af T-celle lymfom, da det blev opdaget, at Moloney leukæmi provirale genom havde integreret i sidste intron af

TPL2

gen resulterer i en deletion af dets C-terminale [36]. Transgen mus undersøgelse viste, at kun transgene mus, der udtrykker et C-terminalt deleteret form af

TPL2

under kontrol af en proximal

Lck

promotor udviklede T-celle lymfom, hvilket antyder, at den C-terminale domæne af vildtype

TPL2

spiller en hæmmende rolle i dens kinase-aktivitet [37]. Faktisk den C-terminale udgår TPL2 har øget stabilitet og en højere specifik kinaseaktivitet end vildtype. Desuden TPL2 interagerer med en negativ regulator, NF-KB-inhiberende protein NF-κB1 p105 via sin C-terminale ende, og dermed den C-terminale udgår TPL2 er ufølsom over for p105 negative regulering [38], [39]. Interessant,

TPL2

udtryk også opreguleret i ca. 40% af humane brystkræft prøver, der kan forårsages af en stigning i

TPL2

gen kopiantal [40]. Derfor er det vigtigt at fastslå, om TPL2 signaleringsaktivering i human prostatacancer prøver kan skyldes enten genetiske mutation ved en C-terminal region eller et genkopital stigning. Vores data viser, at TPL2 udtrykkes på højere niveau i ADI-C4-2B celler end i AD-LNCaP- celler, hvilket bidrager til den høje endogene niveau af ADI transkriptionel aktivering af

PSA

forstærker /promotor

cis

reguleringsmyndigheder region i ADI-C4-2B celler (figur S1). Vi har også sammenlignet den

TPL2

sekvenser af to cellelinjer, men ikke afsløre eventuelle sekvens forskel, hvilket tyder på, at ADI fænotype af C4-2B celler ikke er forbundet med specifikke mutationer i

TPL2

gen. Desuden viste en tidligere undersøgelse, at mRNA niveau af

TPL2

i musen prostata steg efter kirurgisk kastration, men det faldt derefter efter re-administration af testosteron [41]. Disse microarray data antyder, at

TPL2

ekspression i prostata er omvendt reguleret af testosteron på det transskriptionelle niveau. Derfor er det muligt, at lavere niveau af androgen med hormonbehandling kan øge TPL2 ekspression, hvilket resulterer i prostatakræft celleoverlevelse og proliferation under androgen-depleterede betingelser. Denne hypotese er under en aktiv undersøgelse.

I nærvær af androgen, AR undergår phosphorylering, dimerisering, og translokation ind i kernen, hvor det binder til ER sites, hvilket resulterer i den transkriptionelle aktivering af målgener [8] . Men flere rapporter viser, at AR er stadig nødvendig for vækst ADI prostatakræft [9], [10]. Som for de underliggende mekanismer TPL2-medieret vækst ADI prostatakræft, et spørgsmål er, om denne handling kræver AR udtryk og aktivitet. Ophævelsen af ​​TPL2-medieret PSA promoter aktivering i AR-negative DU-145 prostatacancerceller tyder på, at

TPL2

medierede ADI prostatakræft vækst kan være stadig afhængig af AR aktivitet.