PLoS ONE: Meget langkædede Acyl-CoA Synthetase 3: Overekspression og Vækst Afhængighed i lungekræft

Abstrakte

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i hele verden. I USA, kun en ud af seks lungekræftpatienter overlever fem år efter diagnosen. Disse statistikker kan forbedres, hvis der identificeres nye terapeutiske mål. Vi har tidligere rapporteret, at et enzym fedtsyre stofskiftet, meget langkædede acyl-CoA syntetase 3 (ACSVL3), overudtrykkes i malignt gliom, og at nedbrydende glioblastomaceller af ACSVL3 mindsker deres maligne egenskaber. For at bestemme om ACSVL3 ekspression også blev øget i lungekræft, studerede vi tumor histologiske snit og lungekræft cellelinier. Immunohistokemisk analyse af normal human lunge viste moderat ACSVL3 ekspression kun i bronkiale epitelceller. I modsætning hertil alle 69 forskellige lungetumorer testet, herunder adeno-, pladecelle-, stor celle, og småcellede carcinomer, havde robust forhøjet ACSVL3 niveauer. Western blot analyse af lungekræft cellelinier afledt fra disse tumortyper havde også signifikant forøget ACSVL3 protein sammenlignet med normale bronchiale epitelceller. Faldende vækstraten for lungekræft cellelinier ændrede ikke ACSVL3 udtryk. Men banker ned ACSVL3 ekspression ved RNA-interferens reducerede cellevæksthastigheder i kultur ved 65-76%, og evnen hos tumorceller til at danne kolonier i blød agar suspension ved 65-80%. Vi har udført også undersøgelser for at få en bedre forståelse af de biokemiske egenskaber af menneskelig ACSVL3. ACSVL3 mRNA blev påvist i mange humane væv, men ekspressionsmønsteret afveg noget fra den af ​​musen. Enzymet aktiveres lang- og meget langkædede mættede fedtsyreradikaler substrater, såvel som langkædede mono- og polyumættede fedtsyrer til deres respektive coenzym A-derivater. Endogent humant ACSVL3 protein blev fundet i en punktformig subcellulært afsnit, der delvis colocalized med mitokondrier som bestemt ved immunfluorescens mikroskopi og subcellulær fraktionering. Ud fra disse undersøgelser, konkluderer vi, at ACSVL3 er en lovende ny terapeutisk mål i lungekræft

Henvisning:. Pei Z, Fraisl P, Shi X, Gabrielson E, Forss-Petter S, Berger J, et al. (2013) Meget langkædede Acyl-CoA Synthetase 3: Overekspression og Vækst Afhængighed i lungekræft. PLoS ONE 8 (7): e69392. doi: 10,1371 /journal.pone.0069392

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juli 2, 2012; Accepteret: 13 Juni 2013; Udgivet: 23 Jul 2013

Copyright: © 2013 Pei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health giver HD024061, NS037355, og NS062043 (PAW) og den østrigske Science Fund (FWF) P14163-MOB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Acyl-CoA-syntetaser (ACS) katalyserer den ATP-afhængige thioesterification af fedtsyrer (FA) til coenzym A (CoA) [1]. Denne “aktivering” trin er nødvendigt for FA for at deltage i næsten alle efterfølgende metaboliske reaktioner. Baseret på deres acylkæde-længde præference, samt deres aminosyresekvenshomologi, de 26 forskellige ACSS findes hos mennesker kan inddeles i flere adskilte familier af enzymer, herunder “meget langkædede” (ACSVL) -familien, som indeholder 6 medlemmer. Fem enzymer af ACSVL familien kan aktivere lang- om meget langkædede FA substrater; den sjette medlem af denne familie er en lever-specifik galdesyre-CoA syntetase [2]. Ud over deres metaboliske funktioner, har disse enzymer også blevet undersøgt som FA transportproteiner (FATP) [3], som tre af de seks familiemedlemmer fremmer den cellulære optagelse af langkædede FA [4]. Den officielle betegnelse for de gener, der koder for ACSVL /FATP familie er

SLC27A1-6

Vi har tidligere beskrevet egenskaber af mus ACSVL3 (Slc27a3, FATP3). [5]. Da ACSVL3 blev overudtrykt i COS-7-celler, proteinet lokaliseret til det endoplasmatiske reticulum. Men det endogene enzym i MA-10 muse testis Leydig-celler delvist colocalized med mitokondrier ved både differential centrifugering og immunofluorescens. Forbigående knockdown af ACSVL3 hjælp siRNA faldt evne MA-10 celler til at aktivere enten langkædede (palmitat, C16:0) eller meget langkædede (lignocerat; C24:0) FA. Desværre fik ACSVL3 knockdown ikke påvirke evnen af ​​MA-10 celler til at optage C16:0. Sidstnævnte observation blev efterfølgende bekræftet, da udtryk for pattedyr ACSVL3 i gær undladt at fremme langkædede FA optagelse [4]. Northern blot og Western blot-analyser af voksne musevæv afslørede, at enzymet udtrykkes primært i binyrerne, ovarie, og testis, med svagere ekspression i andre væv, såsom hjerne, lunge og nyre [5]. Høje niveauer af ACSVL3 mRNA var til stede i embryonale (E12) musehjerne; imidlertid ekspression hurtigt faldt og ved en måned gamle, mRNA’et var knap påviselig.

Voksen musehjerne sektioner viste svag ACSVL3 immunfarvning i corticale neuroner, hippocampusneuroner og cerebellare Purkinje celler, men proteinet blev ikke påvist i gliaceller [5]. Det var derfor uventet, da vi fandt ACSVL3 at den er markant overudtrykkes i maligne gliomer og i humane glioblastom cellelinier [6]. Vælte ACSVL3 udtryk i humane U87 glioblastomaceller faldt deres ondartet adfærd både i kultur og når injiceres enten subkutant eller intrakranielt i mus. Derfor har vi spurgt, om ACSVL3 udtrykkes i andre menneskelige maligniteter såsom lungekræft, som er den hyppigste årsag til kræftdødsfald verdensplan [7]. I dette papir viser vi, at ACSVL3 er stærkt overudtrykt i alle lungetumorer og cellelinier undersøgt. I lungekræft cellelinjer, ACSVL3 udtømning forbedret deres maligne vækst egenskaber betydeligt. Vi beskriver også yderligere biokemiske egenskaber af menneskelig ACSVL3.

Materialer og metoder

Materialer

[1-

14C] palmitinsyre (C16:0), [1 –

14C] oliesyre (C18:1), [1-

14C] arachidonsyre (C20:4), [1-

14C] docosahexaensyre (C22:6) og [1-

14C] lignocerinsyre (C24:0) blev opnået fra Moravek Biochemicals Inc. (Brea, CA, USA). [1-

14C] linolsyre (C18:2) var fra American Radioaktivt mærket Chemicals (St. Louis, MO, USA). Polyklonalt får antiserum til 70 kDa peroxisomal membranprotein (pMP70) var en gave fra Dr. S. Gould (Johns Hopkins Univ. Sch. Med.). Muse monoklonalt antistof til disulfidisomeraseproteinet og polyklonalt kanin-antistof mod mangan-superoxiddismutase (MnSOD), var fra StressGen (San Diego, CA, USA). Polyklonalt kanin-antistof mod ATP syntase var fra Chemicon (CHEMICON International, Temecula, CA, USA). Polyklonalt kanin antistof til phosphatidylethanolamin N-methyltransferase 2 (PEMT), var en gave fra Dr. D. Vance (University of Alberta, Edmonton, Canada). Affinitetsoprenset polyklonalt kanin-anti-ACSVL3 antistof blev beskrevet tidligere [5]. HRP-konjugerede sekundære antistoffer til Western blots var fra enten Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) eller Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), og sekundære antistoffer til immunfluorescens var fra Jackson ImmunoResearch (West Grove , PA, USA). De-identificeret, formaldehyd-fikseret paraffinsnit af humane lungecancer væv fra to patienter blev opnået og anvendt i overensstemmelse med en protokol godkendt af Johns Hopkins Office of personmotiver Forskning Institutional Review Boards (Protokol NA_00003308); denne protokol giver mulighed for brug af de-identificerede væv uden yderligere skriftlige samtykke (undtagen inkluderet i procedure samtykke formularer). Væv array (katalog # CBL-TMA-078), der indeholder normal human lunge og 67 forskellige lungetumorer blev købt fra Creative BioLabs (Port Jefferson Station, NY).

Kloning af humant ACSVL3 cDNA og konstruktion af ekspressionsplasmider

Fuld-længde ACSVL3 sekvensen blev opnået ved anvendelse af et kombinatorisk tilgang af udtrykt sekvens tag (EST) screening og isolering af associerede sekvenser under anvendelse af forskellige kloningsstrategier. Kort sagt en enkelt klon (C24355, Stratagene;. GenBank accessionsnr BC003041), som indeholdt en lang, men 5′-ubegrænset åbne læseramme blev anvendt som grundlag for at opnå yderligere 5′-sekvens, der anvender genomisk primer walking. Den efterfølgende identificeret 5’forlænget genomisk DNA-sekvens tjente til at identificere en yderligere EST-klon, der stammer fra et bibliotek beriget med kloner i fuld længde, der var blevet opnået via Cap-trapper fremgangsmåde [8], som er placeret opstrøms for den første ATG i klon BC003041 . Denne nye EST-klon (GenBank Accession nr. BG720126), kunne afstemmes med det genomiske DNA og forudsat den hidtil ukendte cDNA-sekvensen fra position -115 til 179, der tjente som en skabelon for yderligere primer design for at opnå fuld-længde cDNA . En konstruktion med en komplet åben læseramme af det humane ACSVL3 gen blev samlet i en totrins-protokol. Først blev en 2480-bp

Hind

III

EcoR

fragment blev udskåret fra cDNA-klonen C24355 og indsat i ekspressionsvektoren pCDNA3.1 (+) (Invitrogen), hvilket gav P434. I det andet trin blev en 915-bp PCR-fragment amplificeret fra exon 1 af den genomiske ACSVL3 klonen, under anvendelse af fremadrettet primer, 549 (5′-CGCCAAGCTTAGCCAGATGCCTAAA-3 ‘), med ATG (+1) understreget, og revers primer 530 (5’-AGCGCCACAGTTGCTCCAGGT-3 ‘), renset, fordøjet med

Hind

III (indført med primer 549) og

Eco47

III, et unikt restriktionssted i ACSVL3 cDNA og klonet ind

Hind

III,

Eco47

III spaltet P434, hvilket resulterer i plasmid P435, der indeholder fuldlængde-konstruktionen ifølge ACSVL3. DNA-sekventering blev udført af MWG Biotech (Ebersberg, Tyskland).

cellelinjer og vækstbetingelser

Menneskelig HepG2 hepatoma, COS-1, og A549, H82, H460, EKVX, og U1752 lunge cancercellelinier var fra ATCC (Rockville, MD). HepG2 celler blev holdt i minimalt essentielt medium (Mediatech, Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gemini Bioproducts). COS-1-celler blev dyrket i DMEM (Mediatech) suppleret med 10% FBS. Alle lungekræft cellelinier blev opretholdt i RPMI (Mediatech) suppleret med 10% FBS. Immortaliserede humane bronkiale epitelceller (HBEC) [9] blev generøst leveret af Dr. Jerry Shay (University of Texas Southwest Medical Center) og blev opretholdt i serumfrit BEGM (bronchieepithelceller vækstmedium, Lonza, Walkersville, MD). Alle celler blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C under 5% CO

2/95,% luft.

Produktion af Klonale Lines med stabile ACSVL3 Knockdown og måling af vedhængende og forankringsuafhængig cellevæksthastigheder

Kloner med stabil knockdown af ACSVL3 blev fremstillet under anvendelse af pSilencer ™ 4.1-CMV hygro-vektoren (Ambion) som tidligere beskrevet [6]. Vektorer indeholder Knockdown sekvenser ACSVL3-3 (målretning nukleotider 397-415) og (nukleotider rettet 1863-1881) ACSVL3-4, som begge blev tidligere vist at falde ACSVL3 udtryk i humane celler, blev transficeret sammen til A549, EKVX, H82, og H460 lunge kræft cellelinier ved elektroporation. Kontrolceller blev transficeret med en pSilencer vektor (leveret af Ambion), der ikke er målrettet nogen menneskelig mRNA-sekvens. Kloner stabilt huser kontrol og knockdown plasmider blev udvalgt af hygromycin (250 ug /ml) resistens og analyseret for ASCVL3 ekspression ved immunofluorescens og Western blot. Celleproliferation og forankringsuafhængig vækst blev målt som tidligere beskrevet [6].

RNA dot blot og Northern blot-analyser

Et multipelt væv ekspression (MTE) array med poly (A) -Valgte RNA fra 61 forskellige voksne humane væv blev opnået fra Clontech. En cDNA-probe blev fremstillet ved PCR-amplifikation af et 657 bp fragment (position 1631-2287 af ACSVL3 /SLC27A3 mRNA, NCBI accession # NM_024330) under anvendelse 5′-GCACTGTATGGCCACATCTCC-3 ‘og 5′-TCTCTCAGGTGCCTCAGGTGT-3′ som fremad og omvendt primere og plasmid P435 indeholdende fuld-længde ACSVL3 cDNA som template. For at verificere specificiteten af ​​sonden for ACSVL3, en BLAST-søgning og flere sekvensopstillinger ved hjælp af de øvrige medlemmer af ACSVL /SLC27A familie blev udført og viste ingen lighed med SLC27A1, 4 og 5, og kun lave lighed med SLC27A2 og 6 ( ikke vist). For kontrol blev en 528-bp glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) probe fremstillet ved PCR under anvendelse 5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3 ‘og 5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’ som forward og reverse primere, henholdsvis. Betingelser for probe mærkning, hybridisering og påvisning var som beskrevet tidligere [10], [11]. Hybridisering til GAPDH probe var robust for alle mRNA pletter (ikke vist).

Til Northern blot-analyse blev den samme probe som for MTE matrix hybridiseret til en human multipel væv Northern blot (Ambion, Austin, TX, USA); en kylling β-actin probe blev anvendt som kontrol. Hybridisering blev udført under anvendelse Express hybridiseringsopløsning (Clontech) natten over ved 65 ° C og vask ved lav stringens ved anvendelse af 2 x SSC, 0,05% SDS i 40 minutter ved 65 ° C, efterfulgt af 0,1 x SSC, 0,1% SDS i 40 minutter ved 50 ° C i højere stringens. Hybridisering af prober blev detekteret ved udsættelse for Molecular Imager FX System (Bio-Rad).

Subcellulær fraktionering og Western blot-analyse

HepG2-celler blev fraktioneret som tidligere [12] beskrevne. Western blotting blev udført som tidligere [13] beskrevne. For immunodetektion muse-anti-MnSOD blev kanin-anti-PEMT eller kanin-anti-ACSVL3 primære antistoffer anvendes sammen med HRP-konjugeret anti-kanin og anti-muse sekundære antistoffer.

indirekte immunofluorescens og Immunhistokemi

HepG2-celler dyrket til -60% konfluens på dækglas blev fikseret i 4% formaldehyd i PBS og permeabiliseret med 1,0% Triton X-100 før inkubering med primært (kanin-anti-ACSVL3, fåre-anti-pMP70, muse-anti-protein-disulfid isomerase eller kanin-anti-ATP syntetase) og sekundære (FITC-konjugeret anti-kanin eller rhodamin-konjugerede anti-muse eller anti-får IgG) antistoffer som beskrevet tidligere [14]. Fluorescens blev visualiseret under anvendelse af et Zeiss Axiovert epifluorescensmikroskop. Immunhistokemisk påvisning af ACSVL3 i histologiske snit af humane lungetumorer blev som tidligere beskrevet [5], [6].

Acyl-CoA Synthetase Assay

COS-1-celler blev transficeret med ACSVL3 ekspression plasmid P435 eller tom vektor via elektroporation som tidligere [15] beskrevet. Celler blev høstet 3 dage efter transfektion, vasket, suspenderet i homogeniseringsbuffer, og blev opbevaret ved -80 ° C før analyse. Aktivering af [1-

14C] -mærket FA (C16:0, C24:0, C18:1, C18:2, C20:4 eller C22:6) til deres CoA thioestere blev udført som tidligere beskrevet [15] . Analyser med C16:0 indeholdt 15 ug COS celle protein, analyser med C24:0 indeholdt 60 ug protein og analyser med alle andre FA indeholdt 50 ug protein.

Fedtsyresammensætning

H460 og EKVX celler blev dyrket til nær konfluens, høstet ved forsigtig trypsinering, og vasket med phosphatbufret saltvand. Cellepellets indeholdende 1,0 mg protein blev ekstraheret, derivatiseret med pentafluorbenzyl bromid, og kvantificeret ved kapillær gaskromatografi-indfangning af elektroner negativ-ion massespektrometri (GC /MS) som beskrevet af Lagerstedt et al. [16]. Resultaterne præsenteres som procent af totale fedtsyrer.

Resultater Salg

Tissue distribution af humane ACSVL3 mRNA

ACSVL3 mRNA-ekspression blev undersøgt ved RNA dot blot analyse under anvendelse af en multipel vævsekspression (MTE ™) array med 61 voksne humane vævsprøver (fig. 1A). Signalintensiteten af ​​hver individuel plet blev kvantificeret og ACSVL3 ekspression forhold til den for GAPDH blev beregnet. De stærkeste normaliserede ACSVL3 signaler var til stede i pancreas, mave, aorta, og milt. I det kardiovaskulære system, ACSVL3 mRNA var særlig beriget i aorta, i forhold til alle områder af hjertet. Den ACSVL3 transkriptet var relativt rigelige hele fordøjelsessystemet, hvilket indikerer en mulig rolle i intestinal FA metabolisme. MRNA kunne også let påvises i de fleste lymfevæv og i det reproduktive system og urinvejene. Moderat signalintensiteten blev opnået fra de fleste kirtler, undtagen brystkirtel og hypofyse hvor niveauet optrådte højere. Næsten alle regioner i det centrale nervesystem, undtagen cerebellum og hypofyse, havde meget lave ACSVL3 mRNA-niveauer. ACSVL3 ekspression i skeletmuskel var også meget svag. Intet signal indikativt for ikke-specifik binding af ACSVL3 probe til forskellige kontrol-RNA og DNA-prøver blev observeret.

(

A

) Humant multipel vævsekspression (MTE ™) matrix RNA dot-blot-analyse. RNA dot blot blev hybridiseret med en

32P-mærket, 657-bp PCR-fragment afledt fra det humane ACSVL3 cDNA som beskrevet i Methods. Membranen blev strippet og hybridiseret med en GAPDH probe for at kontrollere for mRNA overflod. Signalintensitet af individuelle prikker blev kvantificeret under anvendelse ImageJ software (tilgængelig fra: https://rsbweb.nih.gov/ij/download.html), og ACSVL3 ekspression forhold til den for GAPDH blev beregnet. (

B

) Humant multipelt væv Northern blot indeholdende 2 ug poly (A)

+ – selekteret RNA blev hybridiseret med den samme ACSVL3 cDNA probe som i

(A)

. Banerne er: M, Millenium Markers ™; 1, hjerne; 2, lever; 3, placenta; 4, tyndtarm; 5, colon; 6, thymus; 7 milt; 8, prostata; 9, testikel; og 10, æggestok. Omtrentlige størrelser af de detekterede bånd er vist til højre. Kontrol hybridisering med β-actin-probe er vist i det nederste panel.

For at bestemme niveauet for ACSVL3 mRNA blev et humant multipelt væv Northern blot hybridiseret med anvendes til MTE blot-probe. Denne probe detekterede et 2,7 kb ACSVL3 transskript i alle væv undtagen hjerne (Fig. 1B, øverst). Fraværet af et signal fra hjernen prøven sandsynligvis skyldes den lave mængde af mRNA til stede i denne bane, som dokumenteret af β-actin kontrol (fig. 1B, nederst). MRNA størrelse svarer til den forudsagte fra ACSVL3 cDNA. En anden mRNA-species på ca. 1,5 kb dukkede op i leveren, testikel og prostata (fig. 1B, øverst). Denne mindre mRNA var mest forekommende i leveren og derfor mest sandsynligt bidraget til den høje signal i lever på dot-blot. Den lille størrelse af denne cross-hybridiserende sekvens ikke ville være i stand til at rumme den åbne læseramme af et typisk ACS og blev derfor ikke analyseret yderligere. Samlet er der en god korrelation af ekspressionsniveauerne mellem Northern blot og multi væv array.

Acyl-CoA syntetaseaktivitet for Human ACSVL3

Vi analyserede den funktionelle kapacitet af menneskelig ACSVL3 protein for at aktivere FA til deres CoA thioestere følgende overekspression i COS-1-celler. Sammenlignet med COS-1 celler transficeret med tom vektor, celler, der udtrykker ACSVL3 viste øget ACS aktivitet når de analyseres med flere FA substrater. Statistisk signifikante stigninger i aktivering af palmitinsyre (C16:0), oliesyre (C18:1ω9), α-linolensyre (C18:2ω6), og arachidonsyre (C20:4ω6) blev observeret (fig. 2). Selvom vi rutinemæssigt målt øget kapacitet til at aktivere meget langkædede FA, lignocerinsyre (C24:0), dette nåede ikke statistisk signifikans. En lille stigning i aktivering af docosahexaensyre (C22:6w3) blev også observeret, men var ikke statistisk signifikant. Svarende til hvad der er blevet påvist for andre ACSVL enzymer [15], [17], [18], overudtrykt ACSVL3 protein aktiverede langkædede FA i højere grad end meget langkædede FA.

COS-1 celler, der overudtrykker ACSVL3 (grå søjler) fra plasmid P435 (se fremgangsmåder) og kontrolceller transficeret med tom vektor (hvide søjler) blev analyseret for ACS aktivitet under anvendelse af angivne

14C fedtsyre som substrat som beskrevet i Methods. En enhed (U) enzymaktivitet = 1 pmol /min. Resultater er præsenteret som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige transfektionsforsøg. ns, ikke signifikant. p-værdier: * 0,05; ** 0,01; ***. 0,001

ACSVL3 subcellulære lokalisering i HepG2 Celler

Indirekte immunofluorescens blev brugt til at lokalisere endogene ACSVL3 i den menneskelige hepatoma HepG2. ACSVL3 udviste en punktformig fluorescens mønster, når observeret ved konfokal mikroskopi (fig. 3a, d, og g). ACSVL3 immunfarvning af disse punktformig strukturer ikke colocalize med enten peroxisomal markering, pMP70 (Fig. 3b og c), eller det endoplasmatiske reticulum markering, disulfidisomeraseproteinet (fig. 3e og f). ACSVL3 immunofluorescens delvist colocalized med mitokondrier visualiseret under anvendelse ATP syntase som markør (fig. 3h og i).

Konfokal mikroskopi blev anvendt til at detektere endogen ACSVL3 i HepG2-celler ved immunofarvning med anti-ACSVL3 antistof (a, d, og g). Dobbelt-mærkning med anti-ACSVL3 (a) og anti-pMP70 (b) viste, at de punktformig ACSVL3-holdige vesikler var ikke peroxisomer når billederne blev fusioneret (c). Dobbelt-mærkning med anti-ACSVL3 (d) og anti-disulfidisomeraseproteinet (e) som markør for endoplasmatisk reticulum viste ingen colokalisering i det flettede billede (f). Dobbelt-mærkning ved hjælp af anti-ACSVL3 (g) og anti-ATP syntase (h) viste delvis colokalisering af ACSVL3 med mitokondrier i det flettede billede (i).

For at karakterisere yderligere subcellulære lokalisering af ACSVL3 blev HepG2-celler fraktioneret ved differentialcentrifugering. Homogenater blev separeret i fraktioner beriget med kerner (N), mitochondrier (M), peroxisomer (L), endoplasmatisk reticulum (P), og membranen-fri cytosol (S), og analyseret ved Western blotting. ACSVL3 blev fundet primært i M-fraktionen (fig. 4), som indikeret ved tilstedeværelsen af ​​det mitokondrielle markørprotein MnSOD. I mindre grad kan også detekteres proteinet i N-fraktionen. Nr ACSVL3 signal kunne detekteres i L-, P- eller S-fraktioner. Tilstedeværelsen af ​​ACSVL3 i N-fraktionen er sandsynligvis på grund af forurening med ufuldstændigt homogeniserede celler, som MnSOD og phosphatidylethanolamin N-methyltransferase 2 (PEMT) blev også påvist i denne fraktion (fig. 4).

HepG2-celler blev fraktioneret i nuklear (N), mitokondrie (M), let mitokondrie (L), mikrosomal (P), og cytosoliske (S) fraktioner ved differentialcentrifugering, og en total mitokondrie (ML) fraktion blev yderligere separeret i oprenset mitokondrie (Mito ) og mitokondrier-associerede membran (MAM) fraktioner, som beskrevet i Methods. Hver bane blev fyldt med -30 ug protein. Western blot-analyser af den samme membran blev udført under anvendelse af antistoffer mod ACSVL3, mitokondrie markør Mn-superoxiddismutase (MnSOD), og MAM markør phosphatidylethanolamin N-methyltransferase (PEMT).

Da co-lokalisering af ACSVL3 og mitokondrier ved immunfluorescens ikke var fuldstændig, vi spekulerede at ACSVL3 kan findes i mitochondrierne-associerede membran (MAM) fraktion, en endoplasmatisk reticulum-afledt kabine, som sedimenter med mitokondrier under differentialcentrifugering [19]. Derfor besluttede vi MAM fraktion fra oprensede mitokondrier ved centrifugering gennem Percoll. MAM-specifikke markør-protein, PEMT, blev detekteret i MAM fraktion kun, demonstrerer den succesfulde separering af mitokondrier og MAM. Der var en signifikant berigelse af ACSVL3 signal i oprenset mitokondrier, men proteinet kunne ikke påvises i MAM fraktion (fig. 4). Som vi kun observeret delvis colokalisering af ACSVL3 med mitokondrier ved immunfluorescens analyse (fig. 3), på trods af sin sedimentering i denne fraktion og dens fravær fra MAM fraktion, foreslår vi, at ACSVL3 protein er bosat i en roman subcellulære rum, der adskiller sig fra, men tæt forbundet med mitokondrier. Et lignende resultat blev opnået for murin ACSVL3 [5].

ACSVL3 Ekspression i normal human Lung og i lungetumorer

Vi har tidligere rapporteret, at trods svag ekspression i hjernen og i det væsentlige ingen påviselig protein i glia, ACSVL3 niveauer blev håndfast forhøjet i malignt gliom og i humane glioblastom cellelinjer [6]. For at bestemme om andre maligniteter overudtrykt ACSVL3 undersøgte vi ekspressionen af ​​dette protein i normal human lunge og i lungetumorer ved immunhistokemi. Modest ACSVL3 ekspression blev observeret i normale bronchiale og bronchiolær epitelceller (fig. 5). Nr ACSVL3 histokemisk farvning blev set i type I- eller type II alveolære celler, slimceller, stromale celler, eller celler, der omfatter den pulmonale vaskulatur. I modsætning hertil vævssnit fra tumorer resekteret fra to patienter på Johns Hopkins Hospital, en diagnosticeret som adenocarcinom og den anden som pladecellecarcinom, udviste stærkt forhøjede ACSVL3 niveauer (ikke vist). For at bekræfte disse første observationer udførte vi immunhistokemisk analyse på et væv array med 67 forskellige humane lungetumorer. Repræsenteret på array’et var 25 planocellulært karcinom, 21 adenocarcinomer, 6 papillære adenocarcinomer, 7 små celle carcinomer, 3 store celle carcinomer, én bronchioloalveolar karcinom, en basaloid planocellulært karcinom, og 3 carcinoidtumorer. Af disse tumorer, 100% viste overekspression af ACSVL3; flere repræsentative tumorer er vist i fig. 5. Der var ingen indlysende korrelation mellem graden af ​​ACSVL3 ekspression og differentiering tilstand af tumoren.

Paraffinsnit af lungetumorer stede på et vævsarray blev immunfarvet med anti-ACSVL3 antistof (brun) og modfarvet med hematoxylin (blå). Tumorer repræsentative for de 67 forskellige tumorer til stede på arrayet, samt normal lungevæv, er vist. Alle tumorer farvet positive for ACSVL3. Total forstørrelse, 400 ×. Bar = 50 um.

ACSVL3 Expression i Lunge tumorcellelinier

For at bekræfte og udvide disse observationer, vi undersøgte ACSVL3 udtryk i normale humane bronchieepithelceller (HBEC), og i flere lunge cancer cellelinjer. ACSVL3 ekspression var knap påviselig i HBEC (fig. 6A og 6B). Cellelinier afledt fra humane lungetumorer, der repræsenterer småcellet carcinom (H82), ikke-småcellet carcinom (A549), adenocarcinom (EKVX), pladecellecarcinom (U1752), og storcellet carcinom (H460), alle robust udtrykt ACSVL3 ( fig. 6A).

(

A

) vækst under standard dyrkningsbetingelser. HBEC og fem lungekræft cellelinier blev dyrket som beskrevet i Methods og analyseret for ACSVL3 ekspression ved Western blot. Tumorcellelinjer blev afledt fra ikke-småcellet carcinom (A549), småcellet carcinom (H82), storcellet carcinom (H460), adenocarcinom (EKVX), og pladecellecarcinom (U1752). p-actin-ekspression blev bestemt som en loading kontrol. (

B

) Effekt af vækstraten reduktion på ACSVL3 udtryk i lungekræft-cellelinjer. HBEC, dyrket i serumfrit BEGM, vokse betydeligt langsommere end cancercellelinjer. For at bremse deres vækst, A549, H82, H460, og U1752 celler blev overført til BEGM. Alle celler blev holdt i dette medium i 3 uger, på hvilket tidspunkt de blev høstet og underkastet Western blot analyse. Tumorceller dyrkes i standardmedium, RPMI plus 10% føtalt bovint serum (FBS), blev høstet til sammenligning. Vækstraterne i BEGM for alle kræft cellelinjer blev reduceret med mere end 50%.

HBEC vokse med en langsom hastighed, som de dyrkes i serum-frit syntetisk medium (BEGM) for at forhindre skællede differentiering [ ,,,0],20]. Fordi tumorcellelinjer, dyrket i rigt medium indeholdende føtalt bovint serum, vokser betydeligt hurtigere end HBEC, spurgte vi, om høj ACSVL3 niveauer var simpelthen en konsekvens af den hurtige vækst. Fire tumorcellelinier, A549, H82, H460, og U1752, blev overført til serumfrit BGEM og blev holdt i dette medium i tre uger. Trods a 50% fald i væksthastighed, disse cellelinier alle opretholdt høj ACSVL3 ekspression (Fig 6B.). Denne observation tyder på, at andre end vækstraten faktorer er ansvarlig for vedligeholdelse af højt ACSVL3 niveauer i kræftceller.

Effekt af ACSVL3 Knockdown på vedhængende og ikke-klæbende Vækst af Lung tumorcellelinier i Kultur

Stabil knockdown af ACSVL3 udtryk i glioblastom celler faldt deres maligne fænotype i kultur [6]. Både vækst på dyrkningsskåle og evnen til at danne kolonier i blød agar suspension var mere karakteristisk for normale celler, når ACSVL3 blev depleteret. For at afgøre om ACSVL3 udtryk også påvirket væksten af ​​lungekræft celler, vi producerede fire linier med stabil ACSVL3 knockdown hjælp RNA-interferens, som beskrevet i Methods. Kontrol- cellelinjer stabilt huser et plasmid, der koder en kodet kort hårnål RNA blev også produceret. Alle fire Knockdown cellelinier var faldet ACSVL3 proteinniveauer ved Western blot (fig. 7).

Den korte hårnål-producerende vektor pSilencer (Ambion) blev anvendt til at generere adskillige lungecancer-cellelinjer med reduceret ACSVL3 ekspression som beskrevet i fremgangsmåder. Klonale linjer af H460, H82, A549, og EKVX lunge cancerceller med stabil knockdown (KD) af ACSVL3 blev udvalgt. Styreledninger stabilt harbor et plasmid indeholdende en kodet sekvens, som ikke er målrettet nogen humane eller gnaver-mRNA. (

A

) ACSVL3 udtryk i kontrol og KD celler blev vurderet ved Western blotting. (

B

) Gel-Pro Analyzer 4.0 software blev anvendt til at kvantificere de Western blot signaler i (A). Ekspression af ACSVL3 forhold til p-actin blev beregnet for hvert par af kontrol og KD cellelinier. Kontrolsystemer cellelinie forhold blev arbitrært sat til 100 og den relative, normaliseret ekspression af ACSVL3 i KD-celler blev beregnet. Hvide søjler, kontrolceller; grå søjler, KD celler.

Vi målte derefter effekten af ​​ACSVL3 knockdown på spredning af dyrkede H460 og H82 lungekræft-cellelinjer. Som vist i fig. 8A, manglende ACSVL3 faldt cellevæksthastigheder med 65-76% (målt på dag 6). Vi målte også ikke-klæbende vækst på fire cellelinjer, A549, EKVX, H82, og H460, i blød agar suspension. Som vist i fig. 8B, kolonidannelse blev faldet i alle ACVL3-manglende cellelinier med 65-80%. Disse resultater viser, at ACSVL3 udtynding i lungekræft celler, som i glioblastomceller, falder deres ondartede

in vitro

vækst fænotype.

(

A

) Vækst i kultur. Kontrol (▪) og Knockdown (▴) H460 og H82-celler (5 x 10

3) blev podet i 6-brønds plader. På dag 2, 4, 6 og 8, blev celler fra tredobbelte brønde høstet ved trypsinisering og talt ved hjælp af et hæmacytometer. Middelværdi ± S.D. er plottet. (

B

) Anchorage-uafhængig vækst.