Abstrakt
Lille celle lungekræft (SCLC) er aggressiv, med hurtig vækst og hyppig knogle metastase; imidlertid forbliver sin detaljerede molekylære mekanisme dårligt forstået. Her rapporterer vi den kritiske rolle af tidlig vækstfaktor 4 (EGR4), et DNA-bindende, zink-finger transkriptionsfaktor, i celleproliferation af SCLC. EGR4 overekspression i HEK293T celler tilvejebragte signifikant opregulering af specifikke splejsningsvarianter af parathyroidea hormon-relateret protein (
PTHrP
) genet, hvilket resulterer i forøgelse af sekretionen af PTHrP-protein, en kendt mediator af osteolytiske knoglemetastaser. Vigtigere, udtømning af
EGR4
udtryk af siRNA betydeligt undertrykt vækst af SCLC cellelinjer, SBC-5, SBC-3 og NCI-H1048. På den anden side, indførelse af
EGR4
ind NIH3T3-celler væsentligt højere cellevækst. Vi identificerede fire
EGR4
målgener,
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
og
DLX5
, som var den mest markant nedreguleret gener upon udtømning af
EGR4
ekspression i alle de SCLC celler undersøgt, og demonstrerede den direkte rekruttering af EGR4 til deres promotorer af chip og luciferase reporter analyse. Navnlig knockdown af ekspressionen af disse gener ved siRNA bemærkelsesværdigt undertrykt væksten af alle de SCLC celler. Tilsammen vores resultater tyder på, at EGR4 sandsynligt regulerer knoglemetastaser og proliferation af SCLC celler via transkriptionel regulering af adskillige målgener, og kan derfor være et lovende mål for udviklingen af lægemidler mod cancer for SCLC patienter.
Henvisning : Matsuo T, Dat LT, Komatsu M, Yoshimaru T, Daizumoto K, Sone S, et al. (2014) Tidlig vækst Reaktion 4 er involveret i celle spredning af småcellet lungekræft gennem transkriptionsaktivering af dens downstream gener. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10,1371 /journal.pone.0113606
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA
Modtaget: 4. august, 2014 Accepteret: 27 Oktober 2014; Udgivet: 20. november 2014
Copyright: © 2014 Matsuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af fremtidig avanceret forskning fra University of Tokushima. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Lungekræft er en af de mest almindelige kræftformer, og forekomsten er stigende på verdensplan [1]. Den høje dødelighed og dårlig prognose af lungecancer skyldes vanskeligheder med tidlig diagnose og dens høje metastatisk potentiale. Lungekræft er klassificeret i to hovedtyper, småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som tegner sig for ca. 25% og 75% af tilfældene, hhv. SCLC præsenterer med aggressiv klinisk adfærd præget af hurtig vækst og hyppige metastaser til hjernen, lunger, lever og knogle [2]. Især knoglemetastaser forårsager alvorlige komplikationer i SCLC og kan føre til knoglesmerter, patologiske frakturer, hypercalcæmi, rygmarv kompression og andre nerve kompression syndromer [3], [4], og det er ofte forbundet med høj morbiditet og dårlig prognose. Aktuelle behandlinger er generelt palliativ. Derfor er det yderst vigtigt at forebygge og behandle osteolytiske knoglemetastaser
knoglemetastaser er generelt klassificeret som osteolytiske, hvilket fører til knoglenedbrydning.; osteoblastiske, hvilket fører til dannelse af ny knogle; eller blandes baseret på den primære mekanisme for interferens med normal knogle remodellering. Den afbalancerede aktivitet osteolytiske og osteoblastiske faktorer menes at regulere knoglemetastaser [4], [5]. For nylig er der rapporteret flere molekyler til at spille vigtige roller som osteoblastiske faktorer involveret i osteoformation [4] – [6]. Men de præcise mekanismer, der er ansvarlige for tumorvækst i knoglerne forbliver uudforsket.
Omfattende transcriptomics giver en præcis karakteristik af de enkelte kræftformer, der skal bidrage til at forbedre de kliniske strategier for neoplastiske sygdomme gennem udvikling af nye lægemidler. Derfor “omik” teknologi tilgange er effektive til at identificere mål-molekyler involveret i kræftfremkaldende og metastatisk veje, herunder knoglemetastaser. Til dette formål, de genom-dækkende transcriptomics af menneskelig SCLC engageret i orgel-præferentiel metastase i mus blev analyseret, og flere gener potentielt involveret i knoglemetastaser blev fundet [7]. I denne undersøgelse har vi fokuseret på tidlig vækst respons 4 (
EGR4
), som er betydeligt opreguleret i knogle metastatiske tumorer i forhold til andre organsystemer metastaser (lunge, nyre og lever) afledt af humane SCLC celler [7].
EGR4
gen tilhører den tidlige vækst respons familie af umiddelbare tidlige gener, der koder fire DNA-bindende, zink-finger transkriptionsfaktorer (
EGR1
til
EGR4
) [8]. Dette gen (
pAT133
,
NGFI-C
) blev først identificeret som en zink-finger-protein straks induceret af mitogen stimulering i T-lymfocytter og fibroblaster [9], [10]. Det er blevet rapporteret, at
EGR4
-null mus har mandlig infertilitet som følge af standset spermatogenese, men ingen kvindelig infertilitet observeres [11], [12], hvilket antyder, at EGR4 spiller en kritisk rolle i visse typer humant idiopatisk mandlig infertilitet. Desuden er EGR4 kendt for at have en neural-specifik ekspressionsmønster hos rotter [13] og regulere hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) -medieret neuron-specifik kaliumchlorid cotransportør 2 (KCC2) transkription via ERK1 /2 signalvejen i umodne neuroner [14]. Men den patofysiologiske rolle EGR4 i carcinogenese i SCLC, ikke er klarlagt,. I denne undersøgelse, rapporterer vi, at EGR4 fungerer som en transkriptionel aktivator via regulering af specifikke nedstrøms gener i SCLC celleproliferation.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Den menneskelige SCLC cellelinier SBC-3 og SBC-5 blev venligst leveret af Drs. M. Tanimoto og K. Kiura af Okayama University [15]. The NSCLC cellelinien PC14PE6 blev venligst tilvejebragt af Dr. I. J. Fidler af M. D. Anderson Cancer Center [16]. Den humane SCLC-cellelinie NCI-H1048 og humant NSCLC cellelinjer A549 og NCI-H1048 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Det humane ACC-LC319 /bone2 cellelinie blev etableret som tidligere beskrevet [17]. Den MC3T3-E1 murine osteoblast subklon 4 cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Den humane lille luftveje epitelcellelinie (SAEC) blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD, USA). Alle celler blev dyrket under passende betingelser.
plasmidkonstrukter
Hele den kodende sekvens af human
EGR4
(NM_001965) blev opformeret ved PCR ved hjælp af KOD plus DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). PCR-produktet blev indsat i
Eco
RI og
Xho
sites i den pCAGGSn3FH vektor, som indeholder en N-terminal FLAG-tag. For luciferase reporter plasmider, DNA-fragmenter fra 5′-flankerende regioner af
PTHrP-V3
V4
(NM_198964.1 og NM_198966.1 henholdsvis),
SAMD5
(NM_001030060.2),
RAB15
(NM_198686.2),
SYNPO
(NM_007286.5) og
DLX5
(NM_005221.5), som omfatter potentielle EGR bindingssteder som forudsagt af Matlnspector programmet (Genomatix, https://www.genomatix.de/matinspector.html), blev amplificeret ved PCR og indsat i de passende restriktionsenzymsteder i pGL3-enhancer-vektoren (Promega, Madison, WI , USA). PCR primersæt anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel S1. DNA-sekvenserne for alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering (ABI 3500xL sequencer, Life Technologies, Foster City, CA, USA).
RNA-ekstraktion, revers transkription, semi-kvantitativ PCR og real-time PCR
Total RNA-ekstraktion, revers-transkription, semi-kvantitativ RT-PCR og realtids-PCR blev udført som tidligere beskrevet [18]. Ekspressionsniveauerne i hver prøve blev normaliseret til
β
actin mRNA indhold. Sekvenserne af hvert primersæt er anført i tabel S2.
Western blot-analyse
Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [18]. Efter SDS-PAGE blev membraner blottet med proteiner inkuberet med anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, F3165) eller anti-β-actin (AC-15, Sigma-Aldrich, A-5441) muse-monoklonale antistoffer fortyndet til 1:5000. Membranerne blev derefter inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof i 1 time, og proteinet blev synliggjort med forøget kemiluminescens (ECL) detektionsreagenser (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).
Måling af PTHrP-sekretion
HEK293T celler (1,5 x 10
5 celler /plade med 12 brønde) blev transficeret med pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock (ingen indsats) plasmider ved anvendelse FuGENE 6 (Promega). Ved 48 timer efter transfektion blev dyrkningsmediet opsamlet og centrifugeret ved 4 ° C ved 15.000 rpm. Koncentrationen af PTHrP-protein i det konditionerede medium blev bestemt ved en immunoradiometrisk (IRMA) assay (SRL Inc., Tokyo, Japan).
Virkning af konditioneret medium afledt af EGR4 overudtrykker HEK293T celler på
RANLK
,
IL-6
og
IL-8
udtryk
HEK293T celler (2,6 × 10
6 celler /10 cm plade) blev kortvarigt transficeret med pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock vektor til 48 timer, og dyrkningsmediet blev derefter erstattet med DMEM plus 0,1% FBS i yderligere 48 timer. Dyrkningsmediet blev efterfølgende opsamlet, og det konditionerede medium blev overført til murint MC3T3-E1 osteoblastceller, der var præ-dyrket med differentiering medium indeholdende ascorbinsyre (100 ug /ml) i 5 dage. Efter 48 timer, ekspressionsniveauerne af murine
RANKL
,
IL-6
, og
IL-8
blev analyseret ved real-time PCR som beskrevet ovenfor.
chromatin immunoprecipitation (chip) assay
HEK293T celler (2,5 x 10
6 celler /10 cm skål) blev transficeret med 8 ug af pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock vektor i 48 timer og derefter chip assays blev udført ved anvendelse af EZ-chip kit (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [19]. PCR primersæt at detektere EGR-bindingssteder anvendte er anført i tabel S3.
Luciferase assay
HEK293T celler (2,5 x 10
4 celler /48 brønde skål) var co-transficeret med enten 100 ng af pGL3-enhancer-promotor vektor som beskrevet ovenfor eller mock vektor i kombination med 100 ng af pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock vektor (100 ng). pRL-TK blev anvendt som en intern kontrol. Efter 48 timer blev cellerne høstet og analyseret for
Firefly
luciferase og
Renilla
luciferaseaktivitet under anvendelse af dual luciferase reporter assay (Promega) som beskrevet tidligere [19]. Data blev udtrykt som fold stigning i forhold mocktransfekterede celler (sæt på 1,0) og repræsenteret som middelværdien ± SE for to uafhængige forsøg.
NIH3T3 celleproliferationsassay
NIH3T3 celler (0,5 × 10
5 celler /6-brønds skål) blev transient transficeret med 3 pg pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock vektor ved anvendelse FuGENE 6 (Promega). Celleproliferationsassays blev udført ved 48, 72 og 96 timer efter transfektion, henholdsvis ved hjælp af celle Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) som tidligere beskrevet [18]. Disse forsøg blev udført tre gange. Western blot-analyse blev udført som beskrevet ovenfor.
Gene silencing effekter ved siRNA behandling
Vi brugte siRNA oligonukleotider (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan) at vælte
EGR4
,
DLX5, SYNPO SAMD5
RAB15
udtryk i SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 eller PC14PE6. Sekvenserne målretning hvert gen er anført i tabel S4. Cellerne blev forgyldt med 12 brønde (SBC-5 og PC14PE6 1.5 × 10
4 celler /brønd, SBC-3; 2,5 × 10
4 celler /brønd, NCI-H1048, 5,0 × 10
4 celler /brønd). Transfektion af 100 nM siRNA til SBC-5 og PC14PE6 celler blev udført under anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Life Technologies) som tidligere beskrevet [20]. SBC-3 og NCI-H1048-celler blev transficeret med 50 nM siRNA’er anvendelse af Lipofectamine RNAi Max transfektionsreagens (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. På 48, 96 eller 120 timer efter transfektion, total RNA-ekstraktion blev real-time PCR og celleproliferationsassays udført som beskrevet ovenfor.
Identifikation af EGR4 nedstrøms gener ved DNA microarray
SBC- 5 celler (1 x 10
6 celler /35 mm skål i 24 timer) blev transficeret med 10 nM siRNA rettet mod EGR4 (EGR4-2) eller EGFP (siEGFP; en kontrol) ved hjælp af Lipofectamine RNAi Max-transfektionsreagens (Life Technologies ). Totalt RNA blev ekstraheret fra hver prøve ved 48 og 72 timer efter transfektion af siRNA. DNA microarray og data analyser De blev udført ved hjælp af Agilent Whole Human Genome Microarray (4 × 44K, G4110F, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og GeneSpring software (version 11.5, Agilent Technologies) som tidligere beskrevet [21]. En korrigeret
P
blev beregnet med Benjamini Hochberg falsk opdagelse sats (FDR) analyse, og
P
0,05 blev betragtet som signifikant. Omfanget og retningen af den differentielle ekspression mellem tidspunkter (48 og 72 h) blev bestemt ved at beregne fold ændringsværdier. De mikromatrice analysedata er blevet indsendt til NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database serie GSE40558.
RNAseq dataanalyse af lungekræft
Offentligt tilgængelige genekspression data (normaliserede værdier fra Illumina RNAseq v2, niveau 3, LUAD og LUSC) fra The Cancer Genome Atlas (TCGA, blev https://cancergenome.nih.gov/) downloades fra TCGA matrix. Den differentielle ekspression (ved fold ændring) mellem cancervæv og det tilstødende normale lunge blev beregnet ifølge den normaliserede genekspression værdi af hver prøve.
Statistisk analyse
udførtes Statistisk analyse ved anvendelse af Students
t
-test.
P
0,05 blev betragtet som signifikant
Resultater
EGR4 direkte regulerer transkriptionelle aktivitet af
PTHrP
gen
Analyse. af genomet hele genekspression profil orgel-præferentielle metastaser af den humane SCLC cellelinie SBC-5 i mus identificeres tidligt vækst svar 4 (
EGR4
), som i væsentlig grad blev opreguleret i knogle metastatiske tumorer (
s
0,001, forholdet, 2.22) i forhold til andre organsystemer metastaser (lunge, nyre og lever) [7]. For det første at præcisere, hvilken rolle EGR4 som en transskription faktor involveret i knoglemetastaser, vi fokuseret på parathyreoideahormon-relateret protein (
PTHrP
) gen som en kandidat nedstrøms mål for EGR4 fordi
PTHrP
gen vides at være en potent aktivator af osteoklastisk knogleresorption [4] og koder for et protein, der udskilles fra SBC-5-celler [22], [23]. Endvidere er det blevet rapporteret, at behandling med et anti-PTHrP neutraliserende antistof hæmmer produktionen af SBC5 celle knoglemetastaser i SCID-musemodellen [22], [23].
National Center for Biotechnology Information ( NCBI-databasen),
PTHrP
gen er rapporteret at have fire transkriptionelle varianter, betegnet
PTHrP
variant 1 (PTHrP-V1, GenBank nr. NM_198965.1), variant 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), variant 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) og variant 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). De cDNA’er i fuld længde af
PTHrP-V1
,
V2
,
V3
og
V4
består af 1331, 1881, 1862 og 1312 nukleotider, indkode 177, 175, 175 og 177 aminosyrer, og består af 5, 4, 3, og 4 exons hhv. V1 variant mangler exon 3, og V2 variant mangler exon 3 og besidder exon 5b, som er 1.027 bp længere ved 3′-enden end exon 5a. V3 og V4 varianter almindeligvis mangler exon 1 og 2 og besidde exon 3, som er placeret i intron 2 med en længde på 281 bp. V3 varianten mangler yderligere exon 6, og besidder exon 5b og V2 variant. Den V4 variant besidder exon 5a og exon 6, hvilket indikerer, at
PTHrP-V1 /V2
V3 /V4
varianter har forskellige promotorområder (figur 1A). Efterfølgende real-time RT-PCR-analyse bekræftede, at
PTHrP-V3
V4
splejsningsvarianter blev overvejende opreguleres på det transskriptionelle niveau i EGR4 overudtrykker HEK293T celler sammenlignet med mock-transficerede celler ( Figur 1B). Derfor, for at opnå direkte bevis for opregulering af
PTHrP-V3
V4
af EGR4, vi først søgt efter formodede EGR DNA-bindende motiver med Matlnspector programmet (beskrevet ovenfor), fordi det har blevet rapporteret, at EGR familien, herunder EGR4 protein, fortrinsvis binder til en EGR konsensus motiv (5′-GCGG /TGGGCG-3 ‘) [24] – [27]. Vi fandt en potentiel EGR DNA bindende motiv inden for
PTHrP-V3
V4
promoter region (-515 til -499). Efterfølgende undersøgte vi transkriptionsaktivitet EGR4 af en luciferase reporter assay under anvendelse af en pGL3 luciferase plasmid indeholdende EGR4 bindende motiv i
PTHrP-V3 /V4
promotoren. En betydelig stigning i luciferaseaktivitet blev observeret med FLAG-EGR4 transfektion sammenlignet med mock kontrolvektoren i HEK293T celler (figur 1C). For yderligere at undersøge, om EGR4 kunne binde sig til en potentiel
PTHrP-V3
V4
EGR bindende motiv, vi udførte en chip assay. Det genomiske fragment herunder den potentielle EGR-bindende motiv (-515 til -499) af
PTHrP-V3
V4
blev specifikt bundet af EGR4 protein i produkter immunpræcipiteret med et anti-FLAG-antistof, hvilket antyder, at EGR4 direkte bundet til promotorområdet af
PTHrP-V3
V4
varianter (figur 1D). Tilsammen tyder disse resultater på, at EGR4 direkte kan opregulere
PTHrP-V3
V4
varianter i SCLC celler
A:. Genomisk strukturer af de fire splejsningsvarianter af
PTHrP
. De grå og hvide felter angiver kodende og ikke-kodende regioner, henholdsvis. Pilene angiver de anvendte primersæt til at udføre RT-PCR for hvert transkript. Tallene i parentes angiver længden af hver exon. B: Upper panel: Western blot analyse af HEK293T celler, der udtrykker exogent FLAG-mærket EGR4 (FLAG-EGR4) eller celler transficeret med mock vektor. Lavere panel: real-time RT-PCR-analyse af
PTHrP
splejsningsvarianter (
V1 /V2
V3 /V4
) i EGR4-overekspression HEK293T celler. C: Luciferase assay af
PTHrP-V3
-V4 Hotel (
V3 /V4
) promotorområder (n = 2, *
P
0,05). Dette eksperiment blev udført ved anvendelse af en del af lysaterne fra celler, der udtrykker exogent FLAG-EGR4 eller dem transficeret med mock vektor, der anvendes i B. D: Chip assayet
PTHrP-V3 /V4
promotorregion. Chip assays blev anvendt til at bestemme direkte EGR4 binding til
PTHrP-V3 /V4
promotoren. PCR-produktet var fra -620 til -318 af regionen opstrøms af 5 ‘enden af exon 3 af
PTHrP-V3 /V4
, der blev udpeget som en position.
parakrine virkninger af PTHrP udskilles fra EGR4-overekspression celler
det er blevet rapporteret, at PTHrP protein, der udskilles fra kræftceller regulerer ekspressionen af
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener, som har været impliceret som faktorer, der forbedrer osteoklastdannelse og knoglenedbrydning i maligne sygdomme [28] – [30] i osteoblast celler. Ifølge disse data og vores resultater som vist i figur 1, vi hypotese, at PTHrP proteinet udskilles fra EGR4-overudtrykkende celler. Vores resultater viste, at PTHrP proteinkoncentrationen blev forøget betydeligt i medier konditioneret fra EGR4 overudtrykker HEK293T celler (14,43 ± 1,04 pmol /l) sammenlignet med konditioneret medium fra mock-transficerede celler (11,83 ± 0,15 pmol /l,
P
0,05, figur 2A)
A:. Sekretion af PTHrP protein fra EGR4-overekspression HEK293T celler (n = 3, *
P
0,05). B: Måling ordning for de parakrine virkninger af konditionerede medier fra EGR4-overudtrykkende celler. C: Real-time PCR-analyse af de parakrine virkninger på ekspressionen af
RANKL, IL-6
og
IL-8
gener, når medium fra EGR4-overekspression HEK293T celler blev dyrket med musen MC3T3-E1 osteoblast celler (n = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01).
Næste, vi evalueret de parakrine virkninger af konditioneret medium fra EGR4 overudtrykker HEK293T celler på osteoblastceller. Som vist i figur 2B, overføres vi konditioneret medium fra HEK293T celler transficeret med FLAG-EGR4 konstruktion til MC3T3-E1 muse osteoblastceller og derefter udført real-time PCR for at undersøge virkningerne af det konditionerede medium på ekspressionsniveauet af
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener. Alle tre gener blev signifikant opreguleret i osteoblast celler behandlet med konditioneret medium fra HEK293T celler ektopisk udtrykker FLAG-EGR4 sammenlignet med mock-transficerede celler (figur 2C). Kollektivt, disse resultater tyder på, at stigningen i PTHrP sekretion fra EGR4-overekspression celler kan øge ekspressionen af
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener i osteoblast celler.
Effekt af
EGR4
på cellevækst
Vi først undersøgte
EGR4
udtryk i SCLC celler ved semikvantitativ RT-PCR og fandt, at
EGR4
blev højt udtrykt i SBC-3, SBC-5 og NCI-H1048-celler, men ikke i den lille luftveje epitelcellelinie SAEC (figur 3A). Dernæst at vurdere, om EGR4 er afgørende for væksten af SBC-5-celler anvendte vi et RNA interferens tilgang med to forskellige siRNA oligonukleotider. Real-time PCR-analyse viste, at
EGR4
-specifikke siRNA’er (siEGR4-1 og siEGR4-2) betydeligt undertrykt udtryk for EGR4 sammenlignet med siEGFP som en kontrol (figur 3B). MTT-assay viste, at indførelsen af siEGR4s (siEGR4-1 og siEGR4-2) undertrykte signifikant væksten af SBC-5-celler (figur 3C), som er i overensstemmelse med EGR4 knockdown resultater. Vi bekræftede også betydelig væksthæmmende effekter af
EGR4
knockdown i andre SCLC cellelinjer SBC-3 og NCI-H1048 overekspression
EGR4
(Figur S1). For yderligere at bekræfte den vækstfremmende effekt af
EGR4
, FLAG-EGR4 konstruere eller mock vektor blev forbigående transficeret ind i NIH3T3-celler, og MTT-assay blev udført som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 3D, FLAG-EGR4-transficerede celler voksede væsentligt hurtigere end de transficeret med mock vektor. Disse resultater tyder på, at overekspression af
EGR4
kan være involveret i væksten af SCLC celler
A:. Angivelse af
EGR4
i SCLC og NSCLC cellelinjer blev bestemt ved semi -quantitative RT-PCR. B: Effekter af
EGR4
knockdown på celleproliferation i SBC-5 celler. Real-time PCR af
EGR4
i siEGFP- eller siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) -behandlede celler på 5 dage efter siRNA behandling (n = 2, *
P
0,05).
ACTB
blev brugt som en kvantitativ kontrol for real-time RT-PCR. C: Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assay på 5 dage efter siRNA behandling (n = 3, ***
P
0,005). (Si-1, siEGR4-1, si-2; siEGR4-2). D: Vækst-fremmende effekt af eksogen EGR4 på NIH3T3 celler (*
P
0,05, **
P
0,01,
NS
, ingen betydning). Western blot-analyse blev udført ved 96 timer efter transfektion (venstre panel). MTT-assayet blev udført ved 48, 72 og 96 timer efter transfektion med FLAG-EGR4 (sort) eller mock-vektor (hvid) (højre panel). Disse forsøg blev udført i tre eksemplarer.
Identifikation af
EGR4
målgener
For at få yderligere indsigt i biologiske rolle
EGR4
på cellevækst, vi forsøgte at identificere nedstrøms gener specifikt reguleret af EGR4 i SCLC celler. siEGR4 eller siEGFP (kontrol siRNA) blev transficeret ind SBC-5-celler i hvilken
EGR4
blev højt udtrykt (figur 3A), og ændringer i genekspression ved to tidspunkter blev overvåget ved DNA microarray analyse. At identificere de gener putativt reguleres af EGR4, vi valgte gener med følgende to kriterier: (i) ekspressionsniveau blev reduceret med mere end to gange ved 48 og 72 timer hos celler transficeret med siEGR4 sammenlignet med celler transficeret med kontrol siEGFP, og (ii) et formodet EGR bindende motiv blev forudsagt at eksistere inden 500 bp af transkriptionsstartstedet af Matlnspector programmet (beskrevet ovenfor). Vi identificerede 13 gener, der blev nedreguleret ved knockdown af EGR4 ekspression (tabel S5). Real-time PCR-analyse bekræftede, at syv transkripter var signifikant nedreguleret ved begge tidspunkter i EGR4-knockdown celler (figur 4A). Efterfølgende har vi evalueret også opregulering af disse gener upon eksogen EGR4 udtryk i HEK293T celler og i sidste ende valgt fire EGR4 kandidat målgener, herunder distal-mindre homeobox 5 (
DLX5
), synaptopodin (
SYNPO
), steril alpha motiv domæne, der indeholder 5 (
SAMD5
), og RAB15, et medlem af RAS onkogen familie (
RAB15
), som i væsentlig grad blev opreguleret af
EGR4
overekspression (figur 4B). Vi bekræftede betydelig nedregulering af
DLX5
,
SYNPO
og
SAMD5
gener ved
EGR4
knockdown i SBC-3 celler (Figur S2).
A: Real-time PCR af
EGR4
og syv nedstrøms gener (
DLX5, SYNPO, SAMD5
,
MREG, AHNAK, RAB15
, og
PTPN23
) i siEGFP- eller siEGR4-behandlet SBC-5-celler (n = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01, * **,
P
0,005). B: Real-time PCR af
DLX5
,
SYNPO
,
SAMD5
, og
RAB15
gener i mock- eller EGR4-overekspression HEK293T celler (n = 2, *,
P
0,05, ***,
P
0,005). Dette eksperiment blev udført ved anvendelse af totalt RNA fra celler, der udtrykker exogent FLAG-mærket EGR4 (FLAG-EGR4) eller dem transficeret med mock vektor, der anvendes i figur 1B. C: Luciferase assay af
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
og
DLX5
gener. (N = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01). D: chip assays blev anvendt til at bestemme den direkte binding af EGR4 til initiativtagerne til den
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
og
DLX5
gener .
for at opnå direkte bevis for transaktivering af fire EGR4 kandidat målgener, vi målte den transkriptionelle aktivitet af EGR4 af en luciferase reporter assay. FLAG-EGR4-transficeret celler havde signifikant højere luciferaseaktivitet end mock-transficerede celler (figur 4C). Dernæst undersøgte vi rekrutteringen af EGR4 til hver EGR4-bindingssted af Chip assay. EGR4 blev vist at binde til den forudsagte EGR-bindende motiv i promotoren regioner af alle målgener (figur 4D). Disse resultater tyder på, at EGR4 direkte transaktiverer
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
og
DLX5
. Efterfølgende undersøgte vi den biologiske rolle af de fire EGR4 målgener i proliferationen af SCLC celler. Indførelse af siRNA’er i SBC-5, SBC-3 og NCI-H1048-celler resulterede i en signifikant reduktion i ekspressionen af målgener ledsaget af signifikant undertrykkelse af celleproliferation (figur 5A-D, fig S3), hvilket antyder, at disse gener vil sandsynligvis også spille en afgørende rolle i udbredelsen af SCLC celler via EGR4 transkriptionel aktivering.
effekter af
EGR4
nedstrøms gener
SAMD5 Hotel (a),
RAB15
(B),
SYNPO
(C) og
DLX5
(D) på celleproliferation blev bestemt ved siRNA knockdown i SBC-5 celler. Det venstre panel viser real-time PCR-resultater for målgener i siRNA-behandlede celler (n = 2). Højre panel viser resultater fra celledeling analyser som målt ved MTT assay (
SAMD5
RAB15
: n = 2,
DLX5
SYNPO
:. n = 3, *,
P
0,05, **,
P
0,01, ***,
P
0,005)
diskussion
i denne undersøgelse vores mål var at identificere og karakterisere molekyler eller veje potentielt involveret i kræft metastaser, især knoglemetastaser. Gennem en genom-dækkende transkriptom analyse af orglet-præferentielle metastaser af humane SCLC celler i mus, fandt vi, at
EGR4
, et medlem af en familie på fire relaterede zink-finger Cys
2-His
2 typen proteiner (
EGR1
til
EGR4
), er signifikant opreguleret i knogle metastatiske tumorer i forhold til andre organer, dvs, lunge, nyre og lever [7]. EGR4 blev oprindeligt identificeret som en zink-finger-transkriptionsfaktoren straks induceret af mitogen stimulering i T-lymfocytter og fibroblaster [31]. Gentargeting undersøgelser af mus har vist, at EGR4 regulerer flere kritiske gener involveret i de tidlige stadier af meiose og spiller en uundværlig rolle i mandlig murine fertilitet [11], [12]. Endvidere er det blevet rapporteret, at EGR4 binder til nukleare faktor aktiverede T-celler (NFAT) eller nuklear faktor kappa B (NFKB) at øge transkriptionen af nedstrøms gener, der koder inflammatoriske cytokiner, såsom IL-2, TNF-α og ICAM-1 [32], [33]. En tidligere rapport beskrev, at ekspressionsniveauet af
PTHrP
, en potent aktivator af osteoklastisk knogleresorption, i knoglemetastaser tendens til at være højere end i metastaser til nyrerne, lever og lunger bruger hele genomet transcriptomics af humane SCLC-celler i mus [7]. I overensstemmelse hermed i denne undersøgelse har vi fokuseret på
PTHrP
, en potent aktivator af osteoklastisk knogleresorption, som EGR4-nedstrøms gen at afklare patofysiologisk rolle EGR4 som en transskription faktor i SCLC knoglemetastaser.
PTHrP er kendt for at være en vigtig mediator af humorale hypercalcæmi maligniteter og osteolytiske lungekræft metastaser [22], [23], [34]. Ca. 80% af patienter med solide tumorer og hypercalcæmi har øget PTHrP koncentrationer i deres plasma [35]. Det er blevet rapporteret, at PTHrP protein, der udskilles fra cancerceller regulerer ekspressionen af
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener, som har været impliceret som faktorer, der forbedrer osteoklastdannelse og knoglenedbrydning i maligne sygdomme [28] – [30] i osteoblast celler. Vi fandt, at EGR4 direkte transaktiverer specifikke varianter (
V3
og
V4
) i
PTHrP
gen, hvorved man kunne fremme udskillelsen af PTHrP protein i EGR4-overekspression celler , hvilket resulterer i efterfølgende transaktivering af
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener via parakrin virkning af PTHrP. RANKL er kendt for at binde RANK-receptoren på osteoklastpræcursorer og fremkalde osteoklastdannelse. IL-6 og IL-8 er også blevet rapporteret at være vigtig for osteoklastogenese og osteoklast aktivering, henholdsvis [30]. Derfor er disse fund tyder på, at induktion af PTHrP af EGR4 overekspression kan være ansvarlig for knoglemetastaser af SCLC lunge cancerceller.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.