PLoS ONE: XMRV Fremkalde Cell Migration, Cytokine Expression og tumorangiogenese: Er 22Rv1 Cells en egnet prostatakræft Model

Abstrakt

22Rv1 er en fælles prostatakræft cellelinje anvendes i xenograft mus eksperimenter samt? in vitro-cellekultur assays til at studere aspekter af prostatakræft tumorigenese. For nylig blev denne cellelinje vist til havnen flere kopier af et gammaretrovirus, kaldet XMRV, integreret i sit genom. Mens den oprindelige prostatakræft xenograft CWR22 er fri for retrovirus, efterfølgende genererede cellelinjer 22Rv1 og CWR-R1, bære denne virus og derudover kaste smitsomme gammaretroviral partikler i deres supernatant. Selvom XMRV højst sandsynligt blev genereret ved rekombinationsbegivenheder i cellekultur dette virus er blevet påvist at inficere humane celler in vitro og 22Rv1 samt CWR-R1-celler betragtes nu biosikkerhed 2 reagenser. Her viser vi, at 22Rv1 celler med reduceret retroviral transcription viser reduceret tumorangiogenese og forøget nekrose af den primære tumor afledt af xenotransplanterede celler i SCID-mus sammenlignet med den parentale cellelinje. Tilstedeværelsen af ​​XMRV udskrifter øger sekretion af osteopontin (OPN), CXCL14, IL13 og TIMP2 i 22Rv1 celler. Desuden er disse data støttes af in vitro celleinvasion og differentieringsfaktorer assays. Kollektivt vores data tyder på, at tilstedeværelsen af ​​XMRV transkripter i det mindste delvist bidrager til 22Rv1 egenskaber observeret in vitro og in vivo med hensyn til migration, invasion og tumorangiogenese. Vi foreslår, at data modtaget med 22Rv1 celler eller tilsvarende celler bærer xenotrope gammaretroviruses omhyggeligt bør kontrolleres herunder andre testet for virale sekvenser prostatakræft-cellelinier

Henvisning:. Stieler K, Schumacher U, Horst AK, Fischer N (2012 ) XMRV Fremkalde Cell Migration, Cytokine Expression og tumorangiogenese: Er 22Rv1 Cells en egnet prostatakræft Model? PLoS ONE 7 (7): e42321. doi: 10,1371 /journal.pone.0042321

Redaktør: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Republikken Korea

Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: 2 jul 2012; Publiceret: 27 juli, 2012 |

Copyright: © 2012 Stieler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den mest almindelige type af kræft hos mænd i vestlige samfund med mere end 350.000 nydiagnosticerede kræfttilfælde og over 90.000 faktiske dødsfald om året, alene i Europa, og dermed udgør en alvorlig socio-økonomisk problem. Prostatakræft afspejler en heterogen og multi stadie sygdom, som giver en udfordring i at udvikle egnede in vitro og in vivo modeller

In vitro-modeller er afhængige af nogle få prostatakræft-cellelinier tilgængelige [1], som er af epitelial oprindelse.: de mest almindelige anvendte cellelinjer er LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] og som en fælles xenograftmodel også 22Rv1 celler [5]. Disse cellelinjer serveret i fortiden, og stadig almindeligt anvendt som modeller for at undersøge tumor progression, invasion, metastase, nye terapeutiske strategier samt resistens. Transplanteret ind immundefekte mus disse cellelinier producerer tumorer, som er magen til den parentale tumor [5]. Sådanne in vivo xenograftmodeller er etableret ved hjælp af LNCaP celler, 22Rv1 eller PC3 celler podet i immundefekte SCID, nøgen eller NOD-SCID mus. I mangel af en ideel musemodel udstiller hyperproliferation og hyperplasi i epitelceller (prostata intraepitelialneoplasi, PIN), high-grade PIN (HGPIN), adenokarcinomer og invasive prostata carcinomer (mus naturligvis ikke udvikler PC), xenograft mus forsøg med væv skiver eller human prostatacancer-cellelinier er meget udbredt.

22Rv1 er afledt af en recidiverende xenotransplanteret tumor CWR22 som er serielt transplanteret i nøgne mus [5]. I 2009 har 22Rv1 celler blevet påvist at medbringe flere integrerede kopier af gammaretrovirus XMRV (xenotropisk museleukæmivirus relateret virus); disse celler producere høj titre af virus i kultursupernatanten [6]. Nyligt arbejde dokumenterer, at to cellelinjer genereret fra en xenograft tumor CWR22, 22Rv1 (CWR22Rv1) og CWR-R1, producere infektiøse XMRV partikler i deres supernatant [7].

XMRV er oprindeligt identificeret i prostata væv fra patienter med familiær prostatacancer [8]; efterfølgende arbejde fremlagde dokumentation for XMRV protein-ekspression i op til 23% af alle tilfælde prostatakræft [9]. Men flere undersøgelser ikke har kunnet påvise XMRV i prostatakræft prøver ved hjælp af PCR eller IHC metoder [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] på grund af manglende sekvensvariabilitet af XMRV genfragmenter i patienternes isolater sammenlignet med sekvensvariabilitet identificeret i en XMRV positiv cellelinie 22Rv1 det blev postuleret, at XMRV kan være et laboratorium kontaminant snarere end en sand exogent humant virus [20]. Disse data bliver styrket af de seneste data fra Paprotka og kolleger analysere forskellige passager af CWR22 xenografter: XMRV er til stede i 22Rv1 celler og CWR-R1 celler, men tidlige passager i CWR xenograft ikke bære nogen påviselige XMRV sekvenser. Disse data er for en rekombination begivenhed under passage af xenograft CWR22 og dermed skabe XMRV [7].

22Rv1 celler er en almindeligt anvendt præklinisk model af prostatakræft [21], [22], [23] . Først for nylig blev denne cellelinje klassificeret som et bio niveau 2 cellelinie. Denne cellelinje producerer høje titre af xenotrope gammaretroviral partikler, som kan inficere humane celler [6], [7]; indavlede mus celler normalt bære en mutation i receptoren af ​​disse vira, kaldet Xpr1, og er ikke eftergivende for denne gruppe af virus. Visse museceller (vildtlevende mus og nogle indavlede stammer, der bærer den passende receptor allel [24], [25]) kan blive inficeret med virus. Advarsel til fortolkning af data udelukkende som følge af 22Rv1 celler, der bærer virussen er blevet diskuteret tidligere [26] dog ikke direkte i in vivo eller in vitro-forsøg.

I denne aktuelle undersøgelse analyserede vi årsagssammenhængen mellem gammaretrovirus XMRV og den transformerede fænotype af 22Rv1 celler under anvendelse af in vitro-assays der almindeligvis anvendes til at studere celle proliferation, migrering og differentiering ved at sammenligne 22Rv1 celler og 22Rv1 celler med reducerede virale titere i xenograft museforsøg, in vitro migration, invasion og rørdannelse assays. Vi leverer bevis for, at gammaretrovirus XMRV bidrager væsentligt til tumorigenese af 22Rv1 xenografter hos mus. Disse observationer understøttes af in vitro-resultater, som viser forskelle i cytokinfrigivelse i 22Rv1 celler inficeret med XMRV og 22Rv1 celler med reducerede virale udskrifter. Desuden giver vi dokumentation for, at XMRV infektion i prostata stromale fibroblaster væsentligt inducerer ændringer i cytokinfrigivelse. Vi observerer forskelle i celle migration af LNCaP-celler, når de anvendes i in vitro-celle migration og invasion assays sammen med kultursupernatant af stromale celler inficeret med XMRV; supernatant af celler inficeret med amfotropiske gammaretroviruses eller XMRV env pseudotype viruslignende partikler ikke påvirker celle migration af LNCaP-celler indikerer, at dette påvirke er specifik for XMRV og ikke afhængig af receptor interaktion eller receptor signalering.

Sammenfattende vores resultater viser, at den transformerende kapacitet 22Rv1 celler er stærkt afhængig af tilstedeværelsen af ​​XMRV. Derfor resultater opnås ved forsøg med 22Rv1 celler med hensyn til prostatakræft tumorigenesis skal valideres i andre virus negativ prostata cancer cellelinjer.

Resultater

prostata epitelial cellelinje 22Rv1, der stammer fra en menneskelig prostatacarcinom xenotransplanteret i immunsvækkede mus, indeholder flere kopier af gammaretrovirus XMRV integreret i værtscelle DNA. XMRV replikater aktivt i denne cellelinie resulterer i virus, der indeholder smitsomme supernatant [6], [7]. 22Rv1 celler er blevet anvendt i xenograft museforsøg i fortiden uden at vide, at et infektiøst virus er shedded af denne cellelinie. Selvom om XMRV højst sandsynligt ikke er en virus, der cirkulerer i den humane population vi analyserede bidrag af dette virus til cellelinje egenskaber:. Cellevandring og cytokinfrigørelse samt tumorprogression i immunsvækkede mus

xenotransplanteret 22Rv1 Tumorer i SCID mus med nedsat virale Udskrifter er Highly Nekrotisk og Show mindre Vessel Formation

Vi har etableret en 22Rv1 cellelinie med reducerede XMRV udskrift mængder, således mindre infektiøse viruspartikler i kultursupernatanten. To forskellige shRNAs målretning to forskellige regioner i XMRV LTR regionen (figur 1A) blev kombineret. Stabile hårnåle indeholdende sekvenserne shLTR1 og shLTR2 (tabel S1) blev individuelt klonet ind lentivirusvektoren LeGO G-puro [27]. Pseudotype virale partikler indeholdende supernatant fra begge shRNAs indeholdende lentivirale RNA’er blev anvendt til infektion af 22Rv1 celler, som efterfølgende blev behandlet med puromycin at vælge shRNA udtrykkende celler. At udelukke specifik udvælgelse af individuelle integration begivenheder, blev hovedparten udvalg i stedet for enkelt klon udvælgelse udført samt kontrol supernatant indeholdende pseudotype virale partikler med forældrenes lentivirale plasmid Lego G-puro uden shRNA insert blev genereret. Som vist i figur 1B Gag P30 /CA (capsid) protein ekspressionsniveauer blev væsentligt reduceret såvel som mængden af ​​infektiøse partikler stald i supernatanten var faldet betydeligt i shLTR1 + 2 udtrykkende 22Rv1 celler (figur 1C). Under anvendelse af disse celler i xenograft in vivo forsøg, blev i alt seks SCID mus pr shRNA gruppe subkutant injiceret med 2 × 10

6 celler i matrigel i hver lateral flanke. Tumor debut og vægt blev overvåget for 36d. Vi observerede ikke signifikante forskelle i starten af ​​tumorvækst mellem 22Rv1 kontrolceller og 22Rv1 celler, der udtrykker shLTR1 + 2 som bedømt ved daglig visuel inspektion og vægtkontrol af musene (data ikke vist). Efter 36d blev musene aflivet, og tumorvægt, nekrose samt dannelse beholderen blev analyseret. Vægten af ​​22Rv1 shLTR1 + 2 tumorer var signifikant reduceret (figur 2A venstre panel) sammenlignet med kontrolgrupper tumorer. Disse tumorer viste store nekrotiske områder (som set i figur 2B venstre panel, fig S2A (kontrolceller) og S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)) og viste signifikant færre antal fartøjer ved udførelse immunhistokemisk farvning anvende en CD34 monoklonalt antistof til tumor vævssektioner ( Figur 3A øvre paneler og figur 3B) sammenlignet med kontrollerne.

(A) Skematisk repræsentation af XMRV LTR region og 5′-UTR of Gag. Lokalisering af shRNAs anvendes til at reducere XMRV transkripter i 22Rv1 celler er vist som pile. Tre forskellige sekvenser, shLTR1 (R område), shLTR2 (U5 regionen) og shLTR3 (placeret umiddelbart nedstrøms for splejsningsdonorsitet (SD)) blev valgt under anvendelse af Ambion s siRNA Target Finder online værktøj. (B) 22Rv1 celler transduceret med lentiviral supernatant indeholdende det angivne shRNAs og puromycin valgt: 22Rv1 shLTR1 + 2 celler viser signifikant reduceret p30 protein (CA) i Western blot-analyse sammenlignet med kontrolceller. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) Real-time PCR bestemme den relative mængde af infektiøse partikler i supernatanten af ​​shRNA transducerede 22Rv1 celler.

SCID mus (n = 6) var s.c. injiceret med 22Rv1 shLTR1 + 2, shLTR3 eller med 22Rv1 kontrolceller. For hver cellelinie var den endelige tumor mængde n = 12. 36d p.i. mus blev aflivet, og tumorerne blev analyseret for vægt (A) og nekrose (B).

(A) Immunhistokemi farvning for CD34 afslørede rudimentær blodkarsdannelse i XMRV vælte tumorer, mens tumorer i 22Rv1 kontrol display opstod strukturer af angiogenese. (B) CD34

+ områder i tumorer blev kvantificeret i kontrol og shLTR3 tumorer (n = 10 hver). Procentdelen af ​​CD34

+ områder er udtrykt i forhold til de samlede arealer analyseres.

For at udelukke, at de observerede forskelle er en følge af såkaldte off target effekter af shRNAs målretning XMRV udskrifter eller klonselektion af en individuel integrationshændelse, en tredje shRNA med komplementære sekvenser til 5’GAG regionen (229-250, NC_007815) blev (figur 1A) klonet i LeGO G-puro plasmid. Svarende til 22Rv1 celler transficeret med shLTR1 + 2, 22Rv1 celler, der udtrykker shLTR3, udviste signifikant reduceret p30 CA /gag protein ekspressionsniveauer (figur 1B, bane 3 og 4) og op til 80% mindre infektiøse viruspartikler i kultursupernatanten (figur 1C) sammenlignet med kontrolceller. Injektion af disse celler i hver flanke af seks SCID-mus reducerede ikke tidspunktet af tumorvækst såvel som der var ingen signifikant ændring i vægten af ​​tumoren som observeret for shLTR1 + 2 (figur 2A, højre panel). Men vi observerede store nekrotiske områder i 22Rv1 shLTR3 tumorer (figur 2B, højre panel). Mens tumorer i 22Rv1 shLTR1 + 2 viste kun mindre forskelle i størrelsen af ​​nekrotiske områder, disse forskelle var statistisk signifikant i tumorer induceret med 22Rv1 shLTR3 celler. Tilsvarende CD34-farvning demonstrerede nedsat dannelse fartøj baseret på CD34 positiv IHC-farvning i tumorer induceret af 22Rv1 shLTR3 celler sammenlignet med kontroldyr tumorer (figur 3).

Disse forsøg indikerer, at karakteristika 22Rv1 xenografter i immunsvækkede mus delvist afhænge på produktionen af ​​den gammaretrovirus XMRV i disse celler.

22Rv1 celler, der udtrykker shLTR1 + 2 forskellige i Cytokine Expression Mønster Sammenlignet med Forældrekontrol celler

Kultursupernatanter fra 22Rv1 kontrol celler, der er inficeret med pseudotypet lentiviral supernatant indeholdende den tomme LeGO G puro plasmid og fra 22Rv1 shLTR1 + 2-celler blev opsamlet og analyseret for cytokiner ved anvendelse af en fast fase immunoblotting procedure (RayBio Humant Cytokine Antibody Array 5; RayBiotech) (figur S3). Supernatanterne blev påført på membraner indeholdende antistoffer mod 80 humane cytokiner. Mindre forskelle i frigivelsen af ​​cytokiner fra disse celler blev detekteret (figur S3). I 22Rv1 celler med nedsatte XMRV transkriptniveauer, Osteopontin (OPN), tissue inhibitor af matrixmetalloproteinase TIMP2 og IL13 blev let reduceret, mens hepatocytvækstfaktor (HGF) blev forøget.

Brug kvantitativ real-time PCR for den angivne mRNA udskrifter vi bekræftet disse resultater: OPN, TIMP2 og IL13 udtryk reduceres betydeligt i 22Rv1 celler, der udtrykker shLTR1 + 2 mens HGF udtryk betydeligt forøget (figur 4). Derudover testede vi udtryk for matrixmetalloproteinase MMP9 og CXCL14 udtryk i 22Rv1 celler og 22Rv1 shLTR1 + 2 celler. Mens vi ikke finde nogen forskelle i MMP9 mRNA-ekspression i disse cellelinier (data ikke vist), blev CXCL14 udtryk væsentligt reduceret i 22Rv1 shLTR1 + 2 celler.

Totalt RNA af 22Rv1 kontrol og 22Rv1 shLTR1 + 2 blev analyseret for mRNA ekspressionsniveauer af de angivne cytokiner ved QRT-PCR. Data blev normaliseret mod tre husholdning gener (GAPDH, TBP, RLP13).

De Novo Infektion af prostata Stromal fibroblast med Replication Kompetent XMRV induceret Forskelle i Cytokine Expression

For at analysere, om observerede forskelle i cytokin udtryk og frigivelse er celletype afhængig, vi analyserede cytokin udtryk og slip i prostata stromale fibroblaster (PRSC) inficeret med replikationskompetente XMRV afledt fra LNCaP-celler transficeret med XMRV VP62 proviral DNA. PRSC blev isoleret fra prostatavæv ved collagenase fordøjelse og dyrkning i selektivt medium som beskrevet for nylig [28], [29]. Outgrowing celler blev ekspanderet og bekræftet ved FACS-farvning for ekspression af α-SMA (glatmuskelactin) og vimentin (markører for aktiveret stromal fibroblast) og mangel på cytokeratin ekspression [28]. Kun lave passage antal af disse celler blev anvendt i XMRV infektion eksperimenter. 2d tidligere infektion supernatant af XMRV inficeret PRSC eller mock-inficerede celler blev anvendt til en kommerciel antistof membran arrays (RayBio, se Figur S4). XMRV infektion af cellerne blev bekræftet ved XMRV gag specifik PCR (data ikke vist). Af de 60 cytokiner analyseret af antistof membran arrays otte (GRO, GROa, TIMP1, TIMP2, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) blev differentielt udtrykt ved XMRV inficeret forhold til håne inficerede celler. Mens GRO og GROa udskrifter op var reguleret i supernatant fra PRSC XMRV inficerede celler, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, blev TIMP1 og TIMP2 udtryk reduceres.

For at bekræfte resultaterne af cytokin antistof arrays og udelukke forskelle i celle fremstilling af primære prostata stromale fibroblaster, udførte vi kvantitative real-time PCR-forsøg under anvendelse af to forskellige PRSC stromal fibroblastlinier opnået fra forskellige patienter (figur 5). Celler blev inficeret med kultursupernatant indeholdende replikationskompetent XMRV afledt fra LNCaP-celler transficeret med XMRV VP62 proviralt DNA [30], [31]; totalt RNA blev ekstraheret, DNasel behandlet og efterfølgende analyseret ved QRT-PCR for forskelle i cytokinekspression. Mens vi var i stand til at bekræfte vores resultater, som Ab array til GROa, IL13 og TIMP1, vi var ude af stand til at bekræfte vores foreløbige data for TIMP2, HGF og IGFBP4. TIMP2 og IGFBP4 udtryk steg som reaktion på XMRV infektion og induktion af HGF-ekspression blev kun observeret i PrSc29 celler, mens PrSc5 celler viste den modsatte effekt.

Primær prostata stromale fibroblaster (PRSC) smittet med XMRV supernatant af LNCaPi celler eller med mock supernatant. Totalt RNA blev analyseret for mRNA ekspressionsniveauer af forskellige cytokiner ved QRT-PCR. Data blev normaliseret mod tre forskellige husholdning gener og illustreret som relativ genekspression i forhold til håne inficerede celler på hvert enkelt tidspunkt.

cytokinfrigivelse Afhængig af XMRV Replication Influences invasionsevne og Tube Formation in vitro

for at få en mekanistisk forståelse af de observerede forskelle i cytokin frigørelse af prostata epitel eller stromale celler inficeret med XMRV, flere in vitro-undersøgelser blev udført. Vi har ikke observere forskelle i celledeling mellem inficeret (22Rv1 kontrol shRNA og 22Rv1 shLTR1 + 2 eller PRSC inficerede og ikke-inficerede PRSC celler anvender en MTT assay (figur S1). Dernæst undersøgte vi, om XMRV inficerede celler kunne fremme migrationen af LNCaP-celler i en parakrin måde. Primær prostata stromale fibroblaster enten mock eller XMRV inficeret blev podet i nederste kammer af et 24-transwell kammer skålen. Gennem en eftergivende membran frigivet cytokiner direkte påvirke invasionsevne af LNCaP-celler. anvendelse af dette assay udførte vi et forløb på en XMRV infektion, der er vist i figur 6A. XMRV infektion af stromal fibroblast medfører statistisk signifikant stigning migrere LNCaP-celler der kommer yderligere forøget i celler inficeret i længere tid (28d). Denne stigning er specifik for XMRV da et beslægtet MLV (MoMCF, en amphotrop MLV hjælp pIT2 som receptor) resulterede ikke i højere mængder af migrerende LNCaP-celler (figur 6B). Interessant replikationsinkompetent viruslignende partikler pseudotype med XMRV env resulterede ikke i en forøgelse af LNCaP-migration (figur 6B ) tyder på, at begivenheder uafhængigt af receptor-binding og signalering bidrage til den observerede fænotype.

(A) Primære stromale fibroblaster (PRSC) 8d eller 28d pi med XMRV blev udsået i bunden rum i en invasion kammer. Invasionsevne af LNCaP-celler blev beregnet i tre uafhængige forsøg udført in duplo. (B) PRSC celler inficeret med xenotropisk MLV’er (XMRV) fremkalde invasion af prostata cancer celler in vitro, mens stromale celler inficeret med amfotropisk MoMCF eller XMRV env pseudotypet viruslignende partikler ikke øger invasion af LNCaP celler. (C) og (D) XMRV infektion inducerer rør dannelsen af ​​HMEC-celler. Celler podet på matrigel blev inkuberet med supernatant af enten XMRV eller mock-inficerede stromale fibroblaster og dannelse rør blev fulgt i 5 timer. Repræsentativt billede af dannelse rør observeret er vist i (C). (D) Kvantificering af to uafhængige forsøg udført in triplo. Billeder af tre forskellige visuelle felter pr brønd blev analyseret for rørlængde (20 rør pr felt) ved hjælp af Adobe Photoshop lineal værktøj

Desuden har vi udført in vitro-angiogenese analyser:. Dannelse rør blev analyseret ved hjælp af supernatanter fra enten XMRV eller mock-inficerede celler som en stimulans, som de indeholdt differentielt udtrykt /eller forskellige niveauer af pro-angiogene cytokiner. Kultur supernatant fra prostata stromale fibroblaster blev tilsat til HMEC celler på matrigel og rør-dannelse blev fulgt i 5 timer. Ændringer i cytokinfrigivelse som reaktion på XMRV infektion signifikant øget længden af ​​kapillære netværk dannet af HMEC celler (Figur 6C og D), hvilket er i tråd med vores in vivo resultater.

Diskussion

Vores undersøgelse viser, at xenotrope gammaretroviruses, der er hyppigt identificeret i kræft cellelinjer, der er etableret ved at føre dem selv nøgne mus, ikke kun bærer risikoen for infektion, men også i væsentlig grad kan påvirke de eksperimentelle data, der modtages med disse cellelinjer. Navnlig prostatacancer-cellelinie 22Rv1 almindeligvis anvendes i prostatacancer in vitro-undersøgelser samt in vivo xenograftmodeller bærer flere kopier af XMRV integreret og aktivt kaster infektiøst virus i sin supernatant.

XMRV blev oprindeligt identificeret i human prostatacancer væv og dets associering med humane patologier er blevet foreslået i de senere år. De seneste data tyder på en rekombination af to forfader mus XMRV sekvenser, kaldet Pre-XMRV1 og Pre-XMRV2, i cellekultur og derved generere XMRV [7] sammen med flere undersøgelser registrerer ikke XMRV sekvenser i humane prøver [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] spørgsmålstegn en sammenslutning af XMRV med sygdomme hos mennesker.

Still, analyse af XMRV transformation potentiale er af væsentlig interesse siden 22Rv1 celler og CWR22-R1 celler producerer infektiøs virus og er en generelt accepteret in vitro model samt xenograftmodel at studere prostatacancer tumorigenese, progression, biomarkører og udvikling af terapeutiske strategier.

i denne aktuelle studie vi genereret en 22Rv1 cellelinje med reduceret XMRV udskrifter og virale protein niveauer ved anvendelse af shRNAs målrettet to forskellige regioner i XMRV LTR regionen. in vivo eksperimenter viste at tumorer induceret af 22Rv1 celler med nedsatte XMRV transkripter var meget nekrotisk og viste signifikant mindre vaskularisering som bedømt ved CD34-farvning (figur 3) og CEACAM-1-farvning (data ikke vist). For at udelukke integration valg af lokalitet samt shRNA forbi mål påvirker disse forsøg blev gentaget ved hjælp uafhængige 22Rv1 Lego shXMRV LTR infektion eksperimenter samt ved hjælp af forskellige shRNA sekvenser rettet mod en tredje region i XMRV (shLTR3). I modsætning til de eksperimenter med 22Rv1 shLTR1 + 2 celler, blev observeret nogen signifikante forskelle i tumorstørrelse, som kan være på grund af det lille antal dyr per gruppe. Alternativt forskellene observeret i tumorstørrelse i det første sæt af xenograft eksperimenter med shRNA sekvenser rettet mod LTR regionerne 59-79 og 103-125 kunne være en konsekvens af såkaldte off-target effekter i cellerne. Vi gør opmærksom på, at i stedet for shRNA mod luciferase- eller andre sekvenser generelt ikke findes i det humane genom, blev en tom lentiviral vector anvendes til at generere kontrol lentiviral supernatant efterfølgende anvendes til at transducere 22Rv1 celler. Således kan vi ikke udelukke en mætning af komponenter i siRNA maskiner resulterer i uspecifikke virkninger. Men vi ikke observere nogen fænotype, forhøjede niveauer af apoptose, nedsat levedygtighed af celler, der er blevet beskrevet at være korreleret med uspecifikke virkninger ved at mætte siRNA vej [38]. Off-target effekter blev udelukket ved at gentage dyreforsøg med en tredje, anden region i XMRV genomet som en shRNA sekvens.

Ingen metastaser dannelse i lunge, milt og lever samt knoglemetastaser blev påvist i kontrolmus samt shLTR mus (data ikke vist). Desuden har tumorer ikke variere i differentiering status, stromacelle- organisation heller ikke svulsterne vise forskelle i leukocyt infiltration, afspejlet ved den relative forekomst af CD18

+ leukocytter (data ikke vist). Interessant nok afslørede både sæt xenograft eksperimenter (shLTR1 + 2 samt shLTR3) reduceret vaskularisering og øget områder med nekrose. Da vi ikke skabe et XMRV virus med en ændret målsted af de anvendte shRNAs som vi kunne bruge til at supplere 22Rv1 celler transduceret med shLTR3, er det muligt, at den observerede in vivo og in vitro forskelle i disse celler er en konsekvens af at læse igennem eller rekombinant XMRV og cellulære udskrifter.

Nylige undersøgelser har antydet vigtige funktioner af cytokiner i forskellige aspekter af tumorvækst. De fleste af de cytokiner er identificeret i vores assays er blevet beskrevet at påvirke tumormikromiljøet dannelse under prostata tumorigenese. GRO /GROa (CXCL1), et medlem af CXC-kemokin-familien, fremmer angiogenese og rekrutterer neutrofiler og endotelceller under malign progression i prostatakræft. Den afvigende ekspression af HGF (hepatocytvækstfaktor) og dens receptor, c-Met, ofte korrelerer med fremskreden prostatacancer stadier. Tilsvarende IGFBP2 og 4 (insulinlignende vækstfaktor-bindende proteiner 2 og 4) er biomarkører for fremskreden prostatacancer stadier. Vævsinhibitorer af matrixmetalloproteinases (TIMP) har uafhængigt af deres funktion – inhibere proteinase aktivitet af MMP (matrixmetalloproteinases) blevet beskrevet som faktorer involveret i tumorudvikling: TIMP 1 og 2, begge hæmme tumor celle apoptose; TIMP 1 fremmer tumor angiogenese og TIMP 2 accelererer tumorprogression

XMRV-induceret cytokinfrigørelse synes ikke at være tumor epitelcelle specifikke, men kan også observeres under anvendelse prostata stromale fibroblaster (figur 5; S4).. Vi vil gerne påpege, at i disse eksperimenter XMRV virale lagre stammer fra LNCaP-celler transficeret med provirale XMRV VP62 DNA blev brugt. Vi har ikke sekventere virus befolkning stammer fra de novo inficerede LNCaP celler for at udelukke akut omdanne XMRV varianter afledt af rekombinationsbegivenheder som for nylig offentliggjort [39].

XMRV infektion af stromal fibroblast resulterede i statistisk signifikant stigning migrere LNCaP-celler, som blev yderligere forøget i celler inficeret i længere tid (28d). Denne stigning kan være specifik for XMRV og afhængig af XMRV replikation: en beslægtet MLV (MoMCF, en amphotrop MLV hjælp pIT2 som receptor) resulterede ikke i højere mængder af LNCaP-celler migrerer (figur 6B). Interessant, gjorde supernatant fra celle inficeret med replikationsdefekt XMRV-env pseudotype-partikler ikke medføre ændringer i celle migration tyder på, at receptorbinding ikke bidrager til de observerede ændringer.

Generelt vores observationer er i konkordans med nogle aspekter af nyligt offentliggjorte data viser, at XMRV infektion af LNCaP celler fremmer proliferation, transformation og invasivitet af disse celler in vitro [40] såvel som det for nylig blev vist, at XMRV infektion kan inducere apoptose i nogle humane cellelinjer [41]. Mens vi også observere en stigning i invasiv af celler, når inkuberet med kultursupernatanten af ​​XMRV inficerede celler, vi ikke observere en stigning i spredning på grund af XMRV infektion, hverken 22Rv1 celler transduceret med shRNAs målrettet XMRV udskrifter (Figur S1) eller LNCaP celler eller stromale celler inficeret med XMRV (data ikke vist) viste en fald eller stigning i udbredelsen sats

Vi har ikke observere forskelle i MMP9 mRNA-niveauer som følge af XMRV infektion som for nylig offentliggjort [40].; selvom der blev observeret en reduktion af TIMP2 frigivelse af PRSC celler inficeret med XMRV. Eftersom MMP hovedsagelig reguleres på proteinniveauer kan vi ikke udelukke forskel i MMP9-aktivitet. Cytokine antistof arrays anvendes her ikke omfatter MMP9 eller MMP2 såvel som vi ikke inkluderer zymografi teknikker til at teste for forskelle i MMP9 eller MMP2 protein aktivitet. Det forstås, at hastigheden og omfanget af angiogenese er en kritisk komponent i tumorudvikling. Den nøjagtige mekanisme, gennem hvilken XMRV kan påvirke angiogenese, dannelse fartøj og forskelle i cytokinfrigivelse er ikke forstået.

Retrovirus forurening synes at være hyppige blandt udbredte cellelinjer [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Den ukendte tilstedeværelse retrovirus i cellelinier ved siden af ​​biohazard risiko kan påvirke resultaterne af forsøgene. Nylige undersøgelser viser klart, at humane cellelinjer, herunder prostatakræft-cellelinier almindeligvis bære gammaretroviral sekvenser [6], [20], [48]. For nogle af dem infektiøs partikeldannelse er påvist: human T-cellelinie Jurkat J6, lymfoblastoidcellelinie A3.0 /F7 [47], B-cellelinje DG75 [45] og prostatakræft-cellelinier LAPC4, VCap og EKVX [6], [48]; men i kun få eksempler konsekvensen på eksperimentelle resultater er blevet påvist [44], [47], [49]. Vi konkluderer, at eksperimentelle resultater opnået in vitro eller in vivo udført med retrovirus positive cellelinier (især 22Rv1 eller CWR-R1) kan afspejle molekylære egenskaber af viruset frem for celletypespecifikke karakteristika. Derfor bør gives samt undersøgelser (herunder xenograft in vivo forsøg) retroviral status cellelinjer anvendes til forsøg bør valideres ved hjælp af flere cellelinjer.

Materialer og metoder

cellelinier

human prostatacancer-cellelinier LNCaP (ATCC # CRL-1740) og 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco) suppleret med 10% FCS, 5% Penicillin /streptomycin og L- glutamin. Lignende betingelser blev anvendt til shRNA behandlet 22Rv1 celler. TE671 (ATCC # CRL-8805) og 293T-celler (ATCC # CRL-11268) blev dyrket i DMEM Glutamax (Gibco) suppleret med 10% FCS, 5% Penicillin /Streptomycin. HMEC celler (Lonza) blev dyrket i endotelcellevækst Medium MV2 (Promocell). Stromale cellelinier (PRSC) blev etableret som beskrevet [29], [50], [51].