PLoS ONE: MIR-525-3p Forbedrer Migration og Invasion af leverkræft Celler ved nedregulering ZNF395

Abstrakt

Leverkræft er en af ​​førende årsager til kræft dødsfald. En dybere mekanistisk forståelse af leverkræft kan føre til udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske strategier. I vores tidligere arbejde, vi screenet 646 miRNA og identificeret 11 der regulerer leverkræft celle migration. Den nuværende undersøgelse viser, at MIR-525-3p er ofte opreguleret i leverkræft væv, og forstærket ekspression af MIR-525-3p kan fremme leverkræft cellemigration og invasion. Zinkfingerprotein 395 (ZNF395) er den direkte funktionel målgen for MIR-525-3p, og det er ofte nedreguleret i liver cancer væv. Høj udtryk for ZNF395 kan væsentligt hæmme mens knockdown af ZNF395 udtryk markant kan øge migration og invasion af lever kræftceller, hvilket tyder på, at ZNF395 undertrykker metastase i leverkræft. Nedregulering af ZNF395 kan mediere MIR-525-3p induceret leverkræft cellemigration og invasion. Afslutningsvis MIR-525-3p fremmer leverkræft cellemigration og invasion ved direkte målretning ZNF395, og den omstændighed, at MIR-525-3p og ZNF395 begge spiller vigtige roller i leverkræft progression gør dem potentielle terapeutiske mål.

Henvisning: Pang F, Zha R, Zhao Y, Wang Q, Chen D, Zhang Z, et al. (2014) MIR-525-3p Forbedrer Migration og Invasion af leverkræft Celler ved nedregulering ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10,1371 /journal.pone.0090867

Redaktør: Hong Wanjin, Institut for Molekylær og Cell Biology, Biopolis, USA

Modtaget: August 16, 2013; Accepteret: 7 februar 2014; Udgivet: 5 mar 2014

Copyright: © 2014 Pang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra The National 973 Key Basic Research Program (2013CB910504), Shanghai Health Bureau (XYQ2011047, XBR2011039) og The State Key Project for leverkræft (2012ZX10002-009013). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastaser er den vigtigste årsag til cancer-relaterede dødsfald [1], [2]. Systematisk studere de molekylære mekanismer i leverkræft metastase er særlig vigtig for udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier. Tumor metastaser er en etapevis kompleks proces, hvor tumorceller flytter til omgivende eller fjerntliggende væv efter at bryde væk fra den primære tumor. Denne proces indebærer transit tumorcelle gennem den ekstracellulære matrix (ECM) og basalmembranen af ​​den lokale blodkar [3], [4], [5], [6], [7], efterfulgt af bevægelse i værten mikromiljø [ ,,,0],8], [9], [10]. Nylige undersøgelser har vist, at ud over proteinkodende gener, ikke-kodende RNA’er såsom miRNA også spille vigtige regulatoriske roller i processen med metastase [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],16]. miRNA er enkeltstrengede små ikke-kodende RNA’er, og deres sekvenser er stærkt konserverede i eukaryot [17]. miRNA regulere genekspression på post-transkriptionel niveau ved at binde til target mRNA [18], [19], [20], og således deltage i forskellige biologiske proces [21], [22]. Meng et al [23] først rapporteret, at afvigende ekspression af MIR-21 kan mediere leverkræft celleinvasion ved direkte målretning PTEN. For nylig, MIR-151 og MIR-30d viser sig at være placeret på genomiske skrøbelige steder og er forbundet med cancer metastase [24], [25]. Hypoxi-inducerbar ekspression af miR-210 regulerer VMP1-medieret hypoxi-induceret leverkræft celle metastaser [26].

For at screene miRNA er involveret i leverkræft metastase, i en tidligere undersøgelse, vi screenet 646 miRNA ved hjælp sårheling assay med den levende celle billedbehandlingssystem og 11 miRNA fandtes at effektivt regulere leverkræft cellemigrering [27]. I en tidligere rapport [28], vi identificeret nogle kopi nummer variation regioner i det genomiske DNA af 58 par leverkræft væv ved hjælp af en SNP Array 6.0. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at MIR-525-3p genet er lokaliseret i et kopital amplificerede område, og det kunne lette leverkræft cellemigrering i transwell assay. Derudover MIR-525-3p er ofte opreguleret i leverkræft væv og regulerer leverkræft cellemigration og invasion ved nedregulering af ekspressionen af ​​ZNF395. Disse resultater tyder på, at miR-525-3p og ZNF395 repræsenterer potentielle mål for leverkræft behandling.

Materialer og metoder

Menneskelig levertumor Samples /Etik Statement

Menneskelig leverkræft og tilstødende nontumorous væv blev indhentet fra de kirurgiske eksemplar arkiver Qidong Liver Cancer Institute, Jiangsu-provinsen, Kina. Alle disse prøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke, og de protokoller blev godkendt af Etisk Review Committee for WHO Collaborating Center for Forskning i Human Produktion godkendt af Shanghai Municipal regering. De specifikke prøver, der anvendes i denne undersøgelse, er blevet beskrevet i tidligere publikation [29].

Cell Culture

HEK-293T, NCI-H1299, BxPC-3, PANC-1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7, A549, NCI-H460, Tera-1 og Tera-2 blev købt hos ATCC; HuH-7 blev købt fra japansk Collection of Research Bioressourcer (JCRB), SMMC-7721 og BEL-7402 blev købt fra Typisk kultur bevarelse provision celle bank, Kinesiske Videnskabsakademi (NCB); MHCC-97L og LM3 var gaver fra Zhongshan Hospital, Fudan University (Shanghai, Kina); SMMC-7721, BEL-7402, har MHCC-97L og LM3 anvendt i denne undersøgelse blevet beskrevet i tidligere publikation [24], [30], [31], [32].

HEK-293T, NCI -H1299, BxPC3, PANC1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, HuH-7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, Lm3, BEL-7402 og MCF7-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). A549 og NCI-H460-celler blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% FBS. Tera1 og Tera2 celler blev dyrket i McCoys 5a medium suppleret med 15% FBS. Alle cellelinjer blev dyrket i nærværelse af antibiotika ved 37 ° C med 5% CO

2.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). cDNA blev syntetiseret med Prime-Script RT reagens kit (Takara). Real-time PCR blev udført med SYBR Premix Ex Taq (Takara). Modne miRNA var omvendt transskriberet og kvantificeres ved hjælp af TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems). Proberne og primere anvendt til miRNA og mRNA detektion er anført i tabel S1 og S2.

plasmidvektor Konstruktioner Salg

Den primære MIR-525-sekvensen blev amplificeret fra det genomiske DNA fra normale væv og ligeret ind i en PGIPZ vektor (Open Biosystem). Den ZNF395 ORF sekvensen blev amplificeret fra ZNF395 vektoren (FulenGen) og ligeret ind i pWPXL vektoren (en gave fra professor Didier Trono). Den ZNF395 3’UTR blev amplificeret fra det genomiske DNA i HK-293T-celler og subklonet direkte nedstrøms for stopcodonen af ​​luciferasegenet i luciferase reporter vektor. Mutant 3’UTR blev opnået fra den klonede ZNF395 3’UTR hjælp af QuikChange lyn mutagenese kit (Agilent). Både vildtype og mutant 3’UTR sekvenser blev bekræftet ved sekventering (Invitrogen). De primer sekvenser er angivet i tabel S3.

lentivirus Produktion og Cell transduktion

Emballagen plasmid psPAX2 og konvolutten plasmidet pMD2.G var gaver af professor Didier Trono. Enten pGIPZ-MIR-525 eller pWPXL-ZNF395 vektor blev cotransficeret med psPAX2 og pMD2.G ind HEK293T celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vira blev høstet 48 timer efter transfektion og virustitere blev bestemt. SK-HEP-1 og SMMC-7721 celler blev inficeret med 1 x 10

6 rekombinante lentivirus transduktion enheder i nærvær af 6 ug /ml polybren (Sigma, MO). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-ZNF395 er puljer af stabile celler, som er inficeret hjælp lentivirus med GFP, stabile cellelinier, der anvendes i analyser med . 95% grøn fluorescens

Oligonucleotid Transfektion

Celler blev podet i plader med 6 brønde. Efter 24 timer, 100 pmol miRNA mimic (Genepharma), inhibitor (Ribobio) eller siRNA blev transficeret under anvendelse af 5 pi lipofectamin RNAiMax reagens (Invitrogen). Celler blev høstet 48 timer senere for transwell assays eller luciferase reporter assays. SiRNA-sekvenserne er tilvejebragt i tabel S4.

transfektionseffektiviteten Detection Salg

Celler blev transficeret i plader med 6 brønde under anvendelse af 100 pmol siRNA med FAM (Genepharma) og RNAiMax reagens (Invitrogen), efter 20-24 timer blev transfektionseffektivitet påvist under anvendelse af flowcytometri (FCM).

celleproliferationsassays Salg

celleproliferation blev vurderet af Cell Counting kit-8 assaykit (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 × 10

3-celler blev podet i plader hver brønd i 96-brønd og dyrket med 90 pi medium, 10 pi CCK-8 blev tilsat til hver brønd. Efter inkuberet ved 37 ° C i 2 timer blev absorbansen registreret ved 450 nm, og OD450 værdi er korreleret med antallet af levende celler.

Migration og invasion assays Salg

cellemigrationsassay : 5 × 10

4 celler blev suspenderet i 200 pi serumfrit DMEM-medium og podet ind i det øvre kammer af hver indsats. Derefter blev 800 pi af DMEM indeholdende 10% FBS tilsat til en plade med 24 brønde. Efter inkubering ved 37 ° C (SK-HEP-1:6-8 h SMMC-7721:12-16 h), de celler, der migrerede blev fikseret og farvet i 30 minutter i en farveopløsning indeholdende 0,2% krystalviolet og 20 % methanol. Celleinvasion assay: Kamre blev ensartet dækket med 40-80 pi Matrigel (BD Biosciences) fortyndet med DMEM til en vis procentdel og inkuberet ved 37 ° C i 2-4 timer. Derefter 1 × 10

5 celler blev suspenderet i 200 pi DMEM og podet i de øvre kamre, og 800 pi DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubering ved 37 ° C (SK-HEP-1 14-16 h SMMC-7721 16-18 h) blev cellerne fikseret og farvet

Luciferase Reporter Assay

HEK293T celler. blev dyrket i en plade med 96 brønde og transficeret med 50 ng pluc-3’UTR, 10 ng Renilla luciferase plasmid og 5 pmol mIR-525-3p efterligner eller negativ kontrol. Efter 48 timers inkubation, blev luciferaseaktivitet detekteret ved anvendelse af dual-luciferase reporter assaysystem (Promega).

Western blot assay

Cellelysater blev adskilt ved 10% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad), blokeret med phosphatpufret saltvand indeholdende Tween-20 og 5% fedtfri mælk i 1 time og inkuberet med ZNF395 polyklonalt antistof (Santa Cruz) (1:1000) eller β-actin (Sigma) ( 1:10000). Antistoffet kompleks blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens (Pierce).

Statistical Analysis

Alle resultater er vist som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af Students t-test (to-sidede, p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant).

Resultater

høj ekspression af miR-525-3p Forbedrer Migration og Invasion af lever cancer Cells

for at udforske den rolle, miR-525-3p i udvikling leverkræft, blev detekteret ekspressionsniveauet af miR-525-3p i 136 leverkræft og parrede tilstødende noncancerous levervæv (NT). MIR-525-3p signifikant opreguleret i leverkræft væv (figur 1A), med opregulering observeret hos 60% af leverkræft væv (figur 1b). Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​MIR-525-3p i forskellige cancercellelinier. Resultaterne viste, at ekspressionsniveauet af MIR-525-3p relativt høj i leverkræft cellelinjer (fig S1 i File S1). For at undersøge den biologiske funktion af MIR-525 i HCC, blev stabile cellelinjer, der udtrykker MIR-525 konstrueret og benævnt SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525 (Figur S2A i File S1). CCK-8-assays foreslået, at MIR-525 ikke påvirkede HCC cellevækst (figur S3 i File S1), mens transwell assays indikerede, at overekspression af MIR-525 fremmet SK-HEP-1 og SMMC-7721 migration og invasion (figur 1C, D).

(A) mIR-525-3p ekspression blev bestemt ved TaqMan Real time PCR i leverkræft og tilstødende noncancerous levervævsprøver (NT) (n = 136). MIR-525-3p ekspressionsniveauet blev normaliseret til U6b snRNA. Den relative udtryk for miR-525-3p rapporteres i en kasse plot med en log

10 y-aksens skala. Enderne af kasserne definerer 25

th og 75

th percentiler, og linjen angiver medianen. Statistisk analyse blev udført ved en parret t-test, og stjernerne angiver statistisk signifikante resultater på P 0,05 (*). (B) Lagkagediagrammet viser andelene af leverkræft væv, i hvilke MIR-525-3p ekspression blev opreguleret (60%), nedreguleret (5%) og uændret (35%). (C) Transwell migration assays af SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler der udtrykker MIR-525 eller vektorkontrol. (D) Transwell invasions assays af SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler der udtrykker MIR-525 eller vektorkontrol. Repræsentative billeder vises til venstre, og 3 tilfældigt udvalgte felter er kvantificeret til højre. De her viste værdier repræsenterer middelværdien ± SEM, og stjernerne indikerer statistisk signifikante resultater på P 0,01, ** eller P. 0,001, ***

MIR-525-3p Post-transkriptionelt nedregulerer ZNF395 Expression ved direkte Målretning sin 3’UTR

Vi næste søgte bestemme målgener af miR-525-3p. Potentielle målgener blev forudsagt ved hjælp af miRNA forudsigelse algoritmer Targetscan, Miranda og DIANA. Fælles forudsigelser af hver to software blev kombineret og 30 kandidatgener blev fundet (figur 2A). blev påvist Ekspressionsniveauerne af disse gener efter MIR-525-3p efterligner blev indført i SK-HEP-1 og SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 og MLST8 blev inhiberet med mere end 40% (figur S4 i File S1). For at forstå, om disse fem gener er relateret til leverkræft, påvistes ekspressionsniveauerne af disse gener i 12 par leverkræft vævsprøver. RANBP10, IRF1 og ZNF395 fandtes at være nedreguleret i leverkræft væv, mens ekspressionsniveauerne af NACC1 og MLST8 forblev uændret (figur S5 i File S1).

(A) Schema af kandidatgener produceret ved forskellige prædiktionsalgoritmen. Hver cirkel repræsenterer en forudsigelse algoritme og antallet af gener, at det forudsagt, og tallene anført i de regioner, hvor cirklerne overlapper repræsenterer antallet af gener forudsagt af begge algoritmer. (B) Western-blot-assays af de ZNF395 proteinniveauer i SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler inficeret med miR525 eller vektorkontrol. (C) Potentielle bindingssekvenser for miR525-3p i ZNF395 3’UTR af human (HSA), chimpanse (Ptr), rhesus (mm L), hund (CFA) og kanin (Ocu). Seed-sekvenser er understreget. (D) Luciferase reporter plasmider blev konstrueret ved at indsætte den ZNF395 3’UTR og tilsvarende fragmenter i regionen nedstrøms for luciferasegenet. De forudsagte bindingssekvenser for MIR-525-3p er vist, herunder vildtype fuldlængde UTR (WT) eller mutant (MT, understreget) bindingssteder. (E) Relativ luciferaseaktivitet blev analyseret efter HEK-293T-celler blev co-transficeret med WT eller MT ZNF395 3’UTR reporterplasmider og MIR-525-3p. Værdierne er angivet som middelværdien ± SEM, og stjernerne indikerer statistisk signifikans på P. 0,01, **

For at forstå, om RANBP10, IRF1 og ZNF395 er potentielle funktionelle målgener af miR-525 -3p disse gener blev knockdown hjælp siRNA. Resultaterne viste, at interferens med IRF1 udtryk kunne hæmme migration af SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler, en fænotype, der er i overensstemmelse med fænotype af miR-525-3p overekspression. Knockdown af endogen RANBP10 og ZNF395 udtryk var i stand til at fremme migrationen af ​​SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler. Denne fænotype er i overensstemmelse med fænotypen af ​​MIR-525-3p overekspression. (Figur S6 i File S1). Derefter blev den RANBP10 og ZNF395 proteinniveauer analyseret i SK-HEP-1-525 og SMMC-7721-525-celler for at bestemme, om MIR-525 overekspression kunne inhibere ekspressionen af ​​disse proteiner. Resultaterne viste, at ZNF395 proteinniveauet blev signifikant reduceret i SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525 celler (figur 2B). Ud fra følgende betragtninger RANBP10 proteinniveauet ikke var signifikant påvirket (Figur S7 i File S1). Således blev ZNF395 udvalgt til yderligere undersøgelse.

ZNF395 3’UTR indeholder et bindingssted for MIR-525-3p (forudsagt af Targetscan), og bindingen sekvens er stærkt konserveret i forskellige arter, såsom human, chimpanse, rhesus abe, hund og kanin (figur 2C). For at bestemme om MIR-525-3p direkte regulerer ZNF395 ved at målrette dens 3’UTR blev en ZNF395 fuldlængde 3’UTR luciferase reporter vektor konstrueret. Luciferaseaktivitet faldt signifikant efter cotransfektion med miR-525-3p efterligner og luciferase 3’UTR konstruktioner. I modsætning hertil har den relative luciferaseaktivitet ikke ændre sig væsentligt, når mutant bindingssteder blev indført (figur 2D, E), hvilket tyder på, at miR-525-3p kunne regulere ZNF395 udtryk ved direkte binding til dets 3’UTR.

ZNF395 er ofte nedreguleret i leverkræft og kan inhibere leverkræft cellemigration og invasion

zinkfingerprotein 395 er medlem af zinkfingerproteinet familie Krüppel C2H2-typen, og de fleste proteiner i denne familie funktion som transskriptionelle aktivatorer eller inhibitorer. ZNF395 ikke tidligere er blevet rapporteret at være involveret i leverkræft eller tumormetastase. Derfor bør virkningerne af ZNF395 om udvikling og progression af leverkræft og mekanismen bag disse virkninger undersøges. ZNF395 var signifikant nedreguleret i leverkræft væv (Figur 3A), med nedregulering observeret i 62% af leverkræft væv (figur 3B). For at tydeliggøre effekten af ​​ZNF395 i leverkræft celle migration og invasion, den stabile cellelinie SK-HEP-1-ZNF395 blev etableret (Figur S2B i File S1) og siRNA’er mod ZNF395 blev bestilt, blev knockdown effektivitet ZNF395-siRNAs bestemt ved real -tid PCR (fig S2C i File S1), og transfektionseffektiviteten af ​​SK-HEP-1 og SMMC-7721 var 89,5% og 97,0% (figur S2 D, E, F, G i File S1).

(A) relative ekspressionsniveauer af ZNF395 i HCC væv eller matchede noncancerous væv (NT) blev bestemt ved anvendelse af kvantitative revers-transskription PCR-assays. (B) Den lagkagediagram viser andelene af leverkræft prøver, hvor ZNF395 blev nedreguleret (62%), uændret (32%), og opreguleret (6%). ZNF395 ekspression blev bestemt ved TaqMan Real time PCR i leverkræft og tilstødende noncancerous levervæv (NT) (n = 136), og ZNF395 ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH. Den relative ekspression af ZNF395 præsenteres i en kasse plot. Statistisk analyse blev udført med en parret t-test. (C, D) lentivirus-medieret overekspression eller siRNA-induceret knockdown af ZNF395 ekspression blev detekteret ved Western blot i SK-HEP-1. ((E) Relative ekspressionsniveauer af modent miR-525-3p i ZNF395 overekspression eller knockdown SK-HEP-1 celler. (F) Transwell migration og invasion analyser af SK-HEP-1cells stabilt udtrykker ZNF395 eller vektor kontrol. ( .. G) Transwell migration og invasion analyser af SK-HEP-1 celler efter knockdown af endogene ZNF395 Repræsentative billeder vises til venstre, og 3 tilfældigt udvalgte felter er kvantificerede på højre Fejl søjler repræsenterer SEM, stjerner angiver statistisk signifikans på P 0,05, *; P 0,01, ** eller P .. 0,001, ***

ZNF395 udtryk niveau blev påvist ved western blot analyse (figur 3C, D) og relative ekspressionsniveauer af modent miR-525-3p blev ikke åbenbart ændret i ZNF395 overekspression eller knockdown SK-HEP-1 celler (figur 3E), så kan udelukke muligheden af ​​en cross-regulering af miR-525 med ZNF395 . Denne analyse viste, at overekspression af ZNF395 væsentlig grad kan hæmme SK-HEP-1 migration og invasion (figur 3F), mens interferens med endogen ZNF395 udtryk i væsentlig grad kan fremme migration og invasion af SK-HEP-1 celler (figur 3G) .

Restaurering af ZNF395 Hæmmer miR-525-induceret leverkræft Cell migration og invasion

i et forsøg på at teste, om ZNF395 er den direkte funktionelle formidler af miR-525 induceret migration og invasion, en ZNF395 lentiviral vektor indeholdende fuldlængde ORF bortset 3’UTR blev introduceret i SK-Hep1-525 stabil cellelinie (figur 4A). Relative ekspressionsniveauer af kønsmodne MIR-525-3p blev ikke åbenbart ændret i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-525-ZNF395 celler (figur 4B). Resultaterne viste, at høj ZNF395 ekspression var i stand til at udligne MIR-525-inducerede ændringer i SK-HEP-1 migration og invasion (figur 4C, D). Disse resultater viste, at ZNF395 er en direkte funktionel målgen for MIR-525-3p.

(A) Western blot assays for SK-HEP-1-vektor eller SK-HEP-1-525 celler med eller uden genindførelse af ZNF395. (B) Relative ekspressionsniveauer af modent miR-525-3p i ZNF395 overekspression eller Knockdown SK-HEP-1 celler. (C, D) Transwell migration, invasion assays for SK-HEP-1-vektor eller SK-HEP-1-525 celler med eller uden genindførelse af ZNF395. Disse resultater er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført med t-test. Fejl søjler repræsenterer S.E.M, og stjerner angiver statistisk signifikans på P 0,05, *; og P. 0,001, ***

Diskussion

MIR-525 er placeret på kromosom 19q13.42 uden en vært gen. Ekspressionsniveauet af MIR-525-3p steg 6,8-8 gange i to cisplatin-resistente kønsceller tumorcellelinjer [33]. Wang et al [34] opdaget miRNA udtryk ved hjælp miRNA microarray og fandt, at miR-525-3p blev opreguleret i tre par leverkræft væv. Der er ingen rapporter om funktion og mekanismen for miR-525-3p i kræft. I denne undersøgelse for første gang, fandt vi, at forhøjet ekspression af MIR-525-3p fremmer leverkræft cellemigration og invasion. ZNF395, identificeres som en direkte funktionel målgen for MIR-525-3p.

ZNF395 er medlem af Krüppel C2H2 typen zinkfingerproteinet familie. Det er almindeligt udtrykt og blev oprindeligt identificeret som en transkriptionsfaktor der regulerer human papillomavirus (HPV) ekspression; Således er det også kendt som HPV-bindende faktor (PBF) og kan binde til HPV-promotorregionen [35]. ZNF395 udtrykkes i hypoksi-induceret glioblastomcellelinier og i blodkarrene af voksent glioblastom væv [36]. Tsukahara et al [37] fandt, at ZNF395 er et tumor-associeret antigen. ZNF395 viste sig også at regulere PI3K /Akt pathway at inhibere cellevækst [38] ved aktivering caspase-3 til at fremme apoptose [39]. Der er ingen rapporter om ZNF395 blive involveret i tumormetastaser.

Vi rapporterer for første gang, at ZNF395 ofte nedreguleret i leverkræft væv, og at miR-525-3p kan specifikt målrette ZNF395 3’UTR . Over-ekspression af ZNF395 kan inhibere leverkræft cellemigration og invasion, mens restaurering af ZNF395 inhiberer MIR-525-medieret leverkræft cellemigration og invasion. Over-ekspression af ZNF395 og MIR-525 har ingen virkning i NF-KB, MAPK-vejen, men kan regulere PI3-K /Akt pathway via ændring af status af p-Akt (figur 5, figur S8 i File S1).

Western blot analyse af PI3-K /Akt pathway i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-ZNF395 celler.

sammenfattende denne undersøgelse viser, at høj ekspression af mIR-525-3p fremmer leverkræft cellemigration og invasion. ZNF395 er en direkte funktionel målgen af ​​MIR-525-3p; MIR-525-3p fremmer leverkræft cellemigration og invasion ved nedregulering af ekspressionen af ​​ZNF395. Dette fund afslører en ny mekanisme for leverkræft metastaser og nye mål for behandling af leverkræft.

Støtte oplysninger

tabel S1. Salg Sekvenserne af miRNA sonder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s001

(DOCX)

tabel S2.

real-time PCR primere til forudsagte potentielle target gen kandidater

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s002

(DOCX)

tabel S3.

Primere for miR-525, ZNF395, ZNF395 3’UTR og mutant 3’UTR kloning

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s003

(DOCX)

Tabel S4.

siRNA-sekvenser mod IRF1, RANBP10 og ZNF395

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s004

(DOCX)

File S1.

Støtte oplysninger om opnåede resultater, der indeholder figur S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 og S8. Figur S1. Ekspressionsniveauerne af MIR-525-3p i forskellige cancercellelinjer. miR-525-3p udtryk blev bestemt ved TaqMan Real time PCR i kræftceller. De Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til U6 snRNA. Figur S2. Ekspressionsniveauerne af stabile cellelinier stærkt udtrykkende MIR-525 og ZNF395. (A) relative ekspressionsniveauer af modent miR-525 i SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525 blev ABI TaqMan miRNA analyser anvendte og data blev normaliseret ved U6b snRNA. (B) Den relative ekspressionsniveau af ZNF395 i SK-HEP-1 eller vektorkontrol, data blev normaliseret ved GAPDH. (C) Knockdown effektivitet ZNF395-siRNAs. Blandingen af ​​ZNF393-siRNA-1, ZNF393-siRNA-2, og ZNF393-siRNA-3 blev betegnet ZNF393-siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G) Transfektionseffektivitet af FAM-siRNA i SK-HEP-1 og SMMC-7721 celler. Stjerner er angivet til at vise signifikans, P 0,01, **; P 0,001, ***. Figur S3. miR-525 har ingen væsentlig indvirkning på HCC cellevækst. Celleproliferationsassays for SMMC-7721 (A) og SK-HEP-1 (B) celler inficeret med lentivirus udtrykker miR525 eller vektorkontrol. Celletælling kit-8 (CCK-8) assay blev anvendt til at vurdere Celleproliferation. Gennemsnittet af værdierne er plottet som vist, og søjlerne angiver middelfejl i tre eksemplarer. P = ns (ikke signifikant) ved Students

t

-test. Figur S4. Ekspressionsniveauerne af forudsagte potentielle målgenprodukter kandidater. Dataene blev normaliseret ved GAPDH, og præsenteres som gennemsnit ± middelfejl. Figur S5. Ekspressionsniveauerne af kandidatgener i leverkræft væv. Ekspression af (A) RANBP10, (B) IRF1, (C) ZNF395, (D) NACC1 og (E) MLST8 blev bestemt ved kvantitativ real-time PCR-assays i leverkræft og tilstødende noncancerous levervæv (NT) (n = 12 ). Dataene blev normaliseret ved GAPDH, er stjerner indikeret at vise signifikans, P 0,05, *; P 0,001, ***. Figur S6. Interferens IRF1 kan RANBP10 og ZNF395 udtryk hæmme eller fremme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migration. (A) Interferens IRF1 udtryk kunne hæmme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migration. Interferens RANBP10 (B) og ZNF395 (C) udtryk kunne fremme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migration. Figur S7. RANBP10 udtryk er ikke åbenbart ændret i MIR-525 overudtrykkes celler. Western blot analyser af RANBP10 udtryk i SK-HEP-1 og SMMC-7721 celler inficeret med miR525 eller vektor kontrol. Figur S8. Over-ekspressionen af ​​MIR-525 og ZNF395 har ingen effekt i NF-KB, MAPK pathway eller EMT markører. Western blot analyse af NF-KB (A), MAPK (B) pathway og EMT markører (C) i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-ZNF395 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone .0090867.s005

(DOC)

tak

Vi takker professor Didier Trono (School of Life Sciences, Ecole polytechnique Fe’de’rale de Lausanne, 1015 Lausanne, Schweiz) til de generøse gaver af de pWPXL, psPAX2 og pMD2.G plasmider.