PLoS ONE: nedregulering af AP-4 Forhindrer spredning, Fremkalde cellecyklusstop og Fremmer apoptose i Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

AP-4 hører til den grundlæggende helix -løkke-helix leucin-zipper undergruppe; den kontrollerer målgenekspression, regulerer vækst, udvikling og celle apoptose og er blevet impliceret i tumorigenese. Vores tidligere undersøgelser viste, at AP-4 ofte blev overudtrykt i gastrisk kræft, og kan være forbundet med den dårlig prognose. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge, om lyddæmpning af AP-4 kan ændre biologiske egenskaber gastriske kræftceller.

Metoder

To specifikke siRNA’er målretning AP-4 blev designet, syntetiseret, og transficeret i gastrisk cancer cellelinjer og humane normale slimhinde celler. AP-4-ekspression blev målt med real-time kvantitativ PCR og Western blot. Celleproliferation og kemo-følsomhed blev detekteret ved CCK-8 assay. Celle cyklus assay og apoptose-assay blev udført ved flowcytometer, og relative ekspression af cellecyklus regulatorer blev påvist ved real-time kvantitativ PCR og Western blot, ekspression af de involverede i apoptose pathway faktorer blev undersøgt i mRNA og proteinniveauet.

Resultater

ekspressionen af ​​AP-4 blev stille af siRNA’er transfektion og virkningerne af AP-4 knockdown varede 24 til 96 timer. SiRNA-medieret inaktivering af AP-4 undertrykte den cellulære proliferation, apoptose og sensibiliserede cancerceller for anticancerlægemidler. Desuden blev ekspressionsniveauet af p21, p53 og caspase-9 forøges, når AP-4 blev knockdown, men ekspressionen af ​​cyclin D1, Bcl-2 og Bcl-x

L blev inhiberet. Det inducerede ikke cellecyklusstop når AP-4 blev knockdown i p53 defekt mavekræft cellelinje Kato-III.

Konklusioner

Disse resultater viste, at gen silencing af AP-4 kan effektivt inhiberede celleproliferation, udløste apoptose og sensibiliserede cancerceller for anticancerlægemidler in vitro, hvilket tyder på, at AP-4 siRNAs medieret nedregulering har en potentiel værdi i behandlingen af ​​human gastrisk cancer

Henvisning:. Liu X, Zhang B, guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) nedregulering af AP-4 hæmmer proliferationen, Fremkalde cellecyklusstandsning og fremmer apoptose i human Gastrisk cancerceller. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: Juni 4, 2011; Accepteret: April 18, 2012; Udgivet: May 16, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom forekomst og dødelighed forbundet med mavekræft gradvist er faldet i de seneste år i de fleste områder af verden [1], [2], mavekræft fortsat en verdensomspændende sundhed byrde, og er stadig den mest almindelige årsag af kræft dødsfald med lille forbedring af langtidsoverlevelse. Den mest effektive behandling af gastrisk cancer var fuldstændig kirurgisk fjernelse af neoplastisk væv med D2 lymphadenectomy. Desuden adjuverende kemoterapi og strålebehandling har hjulpet til at forbedre prognosen. Alligevel 5-års overlevelse fortsat meget dårlig [1], [3]. Mere end en million nye tilfælde blev diagnosticeret hvert år, især i Østasien, som Japan, Korea og Kina. I disse lande mavekræft stadig den mest almindelige årsag til kræftrelaterede dødsfald, og den præcise patogenese forbliver ukendt [3].

Transskription faktorer er vigtige regulatoriske komponenter [4]. De tilhørte helix-loop-helix familie og spillede en vigtig rolle i celle proliferation og differentiering, celle afstamning beslutsomhed, udtryk for intracellulær genetisk information, og andre vigtige processer [5]. Som medlem af den grundlæggende helix-loop-helix leucin-zipper (bHLH-LZ) undergruppe af bHLH proteiner [6], aktiverende enhancer-bindende protein 4 (AP-4) blev oprindeligt identificeret som et cellulært protein, som er bundet til abevirus 40 (SV40) enhancer og aktiveret det virale sene gentransskription [7]. AP-4 er en ubikvitært udtrykt transkriptionsfaktor og kan styre transkriptionelle netværk under cellulær differentiering ved at danne homodimerer og binding til den symmetriske DNA-sekvens, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 er en ligand for immunglobulin-kappa promotor- E-box elementer, som kan være impliceret til immundefektsygdomme [13], [14]. Derudover, i modsætning til andre HLH-proteiner, AP-4 indeholder yderligere to proteindimerisering motiver bestående af leucin gentagelseselementer LR1 og LR2. Derfor AP-4 præsenterer en specifik tredelt dimerisering struktur, hvilket antyder, at AP-4 kan interagere med en lang række forskellige transkriptionsfaktorer [8], [14]. AP-4 regulerer ekspressionen af ​​nogle gener [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. For eksempel er det aktiverer transkriptionen af ​​hMTIIA genet og deltager i reguleringen af ​​humane proenkephalin ekspression [22], og det kan spille en rolle i ekspressionen af ​​pancreatisk exokrin genfamilien [23]. For nylig blev overekspression af AP-4 rapporteret i kolorektal cancer, brystkræft og prostatakræft [9], [18], [24].

RNA-interferens (RNAi) er en proces, sekvens bestemt stilling -transcriptional gendæmpning initieret af dobbeltstrenget RNA [25], hvilket kan føre til undertrykkelse af specifik cellulær gen og giver en kraftig revers genetik tilgang med at analysere genfunktioner både in vitro og in vivo [26]. Øjeblikket de mest anvendte nukleinsyrebaserede sekvensspecifikke gendæmpning molekyler var små interfererende RNA’er [27], navngivet siRNA’er, som består af symmetriske duplexer af 19-21 basepar [28]. Den siRNA metoden kunne hæmme target genekspression med specificitet, effektivitet og udholdenhed [29].

Vi rapporterede tidligere, at AP-4 blev overudtrykt i gastrisk kræft og at det kan være forbundet med dårlig prognose [30]. I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt yderligere AP-4 funktion i human gastrisk cancer celle med RNA-interferens.

Resultater

Specifik siRNA rettet mod AP-4-ekspression i humane gastriske cancerceller og den menneskelige normale mucosa-celler

for at vurdere virkningen af ​​siRNA-medieret tavshed af AP-4-genekspression, kontrol siRNA og AP-4 specifikke siRNA’er blev transficeret ind i cellerne i 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer. Effekten i nedregulering ekspression af AP-4-genet blev påvist ved real-time kvantitativ PCR og western blot. Som vist i figur 1, kunne AP-4 specifikke siRNA’er effektivt inhiberer gentranskription og translation. MRNA og protein niveauer af AP-4 blev reduceret med AP-4 siRNA transfektion gruppen, men ikke i kontrol siRNA (figur 1). kunne detekteres siRNAs inducerede suppression af AP-4-ekspression i 24 timer efter transfektion. Hæmningen forholdet faldt 72 timer efter transfektion. Den mest effektive tidspunkt var mellem 48 timer til 72 timer i undertrykke ekspression af AP-4. De relative niveauer af mRNA-transkripter faldt betydeligt med næsten 90% i siRNA-1 gruppe, og 95% i siRNA-2-gruppe. Der var statistisk signifikans mellem siRNA’er gruppe og kontrolgruppen.

De forskellige siRNA’er blev transficeret ind i cellerne i 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer. MRNA’et og proteinekspression blev undersøgt ved real-time kvantitativ PCR og Western blot. AP-4 specifik-siRNA’er effektivt kunne inhibere genekspression. Den inducerede suppression af AP-4-ekspression startes ved 24 timer, og inhiberingen forholdet faldt efter 72 timer. Den mest effektive tidspunkt var 48 timer og 72 timer, de relative niveauer af mRNA-transkripter signifikant faldt med næsten 90%. Der var statistisk signifikans mellem AP-4 siRNA’er grupper og kontrolgrupper. (* P 0,05; ** p 0,01).

nedregulering af AP-4 udtryk hæmmede celleproliferation og sensibiliseret humane gastriske kræftceller til lægemidler mod cancer

Til undersøge effekten af ​​AP-4 specifikke siRNA’er på celleproliferation og kemo-følsomhed cancerceller, blev 20 nM AP-4 specifikke siRNA’er eller kontrol siRNA transficeret og celleproliferationen blev bestemt ved CCK-8 assay 48 timer efter transfektion. Vi fandt, at knockdown AP-4 kunne inhibere proliferationen af ​​gastriske cancercellelinjer SGC7901 og AGS (figur 2), men ikke i normal slimhinde cellelinie GES-1 sammenlignet med kontrolgruppen siRNA transfektion i 48 timer (figur 2). Disse resultater indikerede, at AP-4 siRNA’er svækkede celleproliferationen af ​​gastriske cancerceller in vitro. Desuden undersøgte vi rollen som AP-4 i reguleringen af ​​kemo-følsomhed af humane gastriske kræftceller. Vi sammenlignede lægemidlet følsomhed AP-4 siRNA’er med den for kontrol siRNA eller mock celler og fundet, at de relative inhibering satser af AP-4 specifikke siRNA’er var signifikant højere end for kontrol siRNA eller mock celler (p 0,0001) (figur 2 ). Desuden AP-4 siRNA’er signifikant forøget følsomhed over celler til ADR, 5-FU eller cis-plantinum behandling på to forskelligt doser (figur 2), disse foreslog, at AP-4 nedregulering af kan have en gavnlig virkning i følsomhed kemoterapi.

Otteogfyrre timer efter transfektion, celleproliferationen og inhibitoriske virkninger af forskellige koncentrationer af 5-FU, ADR eller Cis-plantinum blev vurderet ved CCK-8 assay. Resultaterne indikerede, at AP-4 specifikke-siRNA’er kunne inhibere proliferationen af ​​gastriske cancerceller men ikke de normale mucosa-celler (p 0,01) og forbedre kemo-følsomhed gastriske cancerceller til 5-FU, ADR eller Cis-plantinum ( p 0,0001). Der var statistisk signifikans mellem AP-4 siRNA’er grupper og kontrolgrupper (* p 0,05; * p 0,01)

Silencing af AP-4-ekspression induceret cellecyklusstop og moduleret udtryk for. p53, p21 og cyklin D1

effekten af ​​AP-4 på cellecyklusprogression blev undersøgt. Humane gastriske cancerceller blev transficeret med 20 nM kontrol siRNA, og AP-4 specifikke siRNA’er i 48 timer henholdsvis efterfulgt af propidiumiodid-farvning og flowcytometri-analyse af cellecyklus. Mens celler transficeret med kontrol siRNA skred gennem forskellige faser af cellecyklus, celler transficeret med AP-4 specifikke siRNA’er vises signifikant højere frekvens af celler ved G0 /G1 faser (SGC7901 /siRNA-1: 68.81%; SGC7901 /siRNA-2: 68.97%; AGS /siRNA-1: 61.92%; AGS /siRNA-2: 63.67%) og en lavere frekvens af celler ved S-fase (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22.91%). Procentdelen af ​​celler ved G0 /G1 faser i cellen transficeret med AP-4 siRNAs var signifikant højere end den af ​​de mock celler (SGC7901: 54,65%; AGS: 48.44%) (p 0,05) eller kontrol siRNA (SGC7901 /kontrol siRNA: 52,18%; AGS /kontrol siRNA: 50,38%) (figur 3). Derfor transfektion med AP-4-specifikke siRNA’er induceret celle cyclin standsning ved G0 /G1 faser.

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne høstet og farvet med propidiumiodid, og andelen af ​​celler i hver fase af cellecyklus blev analyseret. I grafen er andelen af ​​celler ved G0 /G1 faser i cellen transficeret med AP-4 siRNAs var signifikant højere end den af ​​de mock celler eller kontrol siRNA. (* P 0,05; ** p 0,01).

AP-4 specifikke siRNAs induceret cellecyklus blok blev yderligere undersøgt ved at observere effekten af ​​AP-4 specifikke siRNA’er behandling på den relative ekspression af cellecyklus regulatorer: tumor suppressor p53, cyclin-afhængig kinase inhibitor p21, og G (1)-fase-specifikke cyclin D1, som var kritiske regulatorer af cellecyklus og proliferation. Otteogfyrre timer efter transfektion blev humane gastriske cancerceller indsamles for real-time PCR og immunoblotting-analyse. Transfektion med AP-4 specifikke siRNA’er kunne opregulere ekspressionen af ​​p53 og p21-protein. Den modulerende virkning af AP-4 siRNAs var større end den for kontrol siRNA (figur 4) (p 0,01). Som forventet blev cyclin D1 nedreguleres sammenlignet med kontrol siRNA gruppe og mock gruppe (figur 4) (p 0,01). Disse data understøttede yderligere den hypotese, at silencing ekspressionen af ​​AP-4 ændres ekspressionen af ​​andre cellecyklus regulatorer, induceret cellecyklusstandsning og inhiberede proliferation af humane gastriske cancerceller

Inhibering af AP-4-ekspression kunne op -regulate ekspressionen af ​​p53 og p21 mRNA og protein, men nedregulere cyclin D1. (* P 0,05; ** p 0,01).

Påvisning af apoptose og de involverede i apoptose pathway

For at kvantificere effekten af ​​AP-4 specifikke siRNA’er på faktorer, apoptose i humane gastriske cancerceller, Annexin-V og PI farvende assays blev anvendt i forbindelse med flowcytometri. Celler blev farvet med Annexin V-FITC /PI og gated i Lower Right (LR) og Øvre højre (UR) kvadranter. Celler i LR og UR blev anset for at være tidligt apoptotiske (Annexin

+ /PI

-) og sen apoptotiske (Annexin

+ /PI

+) hhv. Celler i LL (nederst til venstre) og UL (øverst til venstre) kvadranter blev anset for at være i live og nekrotisk hhv. Omfang af apoptose blev udtrykt som summen af ​​procenterne i LR og UR kvadranter. De apoptotiske satser blev vist i figur 5. Behandlede celler med AP-4 siRNA’erne viste mere apoptotiske celler (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) end den negative (SGC7901 /kontrol siRNA: 5,5%; AGS /kontrol siRNA: 6,7%) (p 0,05) og blank (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p 0,05) . Disse resultater viste, at AP-4 specifikke siRNA’er var i stand til at inducere apoptose i disse celler.

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne høstet og dobbelt farvet med Annexin-V og PI. Den apoptose på celler transficeret med AP-4 siRNAs var højere end kontrollen siRNA (p 0,05) og mock celler (p 0,05). (* P 0,05; ** p 0,01).

Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​faktorer involveret i apoptose pathway med real-time PCR i mRNA-niveau, såsom Bcl-2, Bcl -x

L, Caspase-9, caspase-8 og Bax. Den viste, at knockdown AP-4 kunne opregulere ekspressionen af ​​Baspase-9 i humane gastriske cancerceller, og den modulerende virkning af AP-4 siRNAs var større end den for kontrol siRNA (figur 6) (p 0,01). Ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bcl-x

L blev reduceret sammenlignet med kontrollen siRNA eller mock gruppe (figur 6) (p 0,01). Disse data understøttede endvidere, at inaktivering af AP-4-ekspression førte til apoptose i humane gastriske cancerceller. Imidlertid ekspressionen af ​​Caspase-8 og Bax var forskellige i forskellige cellelinier efter transfektion. Otteogfyrre timer efter transfektion, Caspase-8 og Bax var over ekspression i AGS celler. I SGC7901 celler, ekspressionen af ​​Bax steget, men ekspressionen af ​​Caspase-8 kun steget i siRNA-1 gruppe. I siRNA-2-gruppe, Caspase-8-ekspression var ikke signifikant påvirket (figur 6).

Inhibering af AP-4-ekspression kunne opregulere transkriptionen af ​​Caspase-9, men nedregulere Bcl-2 og bcl-x

L-ekspression i human gastrisk cancer Men Caspase-8 og Bax ekspression var forskel i forskellige cellelinier efter transfektion. Otteogfyrre timer efter transfektion, Caspase-8 og Bax var over ekspression i AGS celler. I SGC7901 celler, Bax var overekspression, Caspase-8-ekspression blev også opreguleret i siRNA-1 gruppe, men i siRNA-2 gruppe, Caspase-8-ekspression var ikke signifikant påvirket. (* P 0,05; ** p 0,01).

AP-4 lyddæmpning kunne regulere cellecyklus og celle apoptose i både p53-afhængige og uafhængige-manerer

For at verificere hvorvidt opregulering af p53 i AP-4 knockdown gastriske cancerceller var kritisk for den rolle, standsning af cellecyklus, Kato-III-celler, en slags p53 defekt gastrisk cancercellelinie blev anvendt til at evaluere afhængighed af AP-4 knockdown effekt på p53. Vi fandt, at knockdown af AP-4 i AGS med vildtype-p53 eller SGC7901 med mutant p53 kunne inducere cellecyklus arrest, men dette fænomen blev ikke observeret i Kato-III-celler (figur 7), procentdelen af ​​celler i G0 /G1 faser var 57.82% (siRNA-1), 59.05% (siRNA-2), 59,59% (kontrol siRNA) og 59.06% (mock). De, indikerede, at knockdown AP-4 måske regulere cellens cyklus ved hjælp af p53-p21-vejen. Apoptose population blev også påvist i Kato-III-celler med Annexin V-FITC og PI-farvning. Resultaterne viste, at apoptose på Kato-III-celler transficeret med AP-4 siRNA’er (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) var højere end kontrollen siRNA (3,3%) (p 0,05) og mock celler (3,5%) (p 0,05), men i mindre grad end den gjorde på AGS (p 0,05) og SGC7901 celler (p 0,05), hvilket indikerer, at silencing AP-4 kunne inducere apoptose i gastriske cancerceller gennem både p53-afhængige og uafhængige-manerer.

i Kato-III celle, AP-4-ekspression tydeligvis nedreguleret ved 48 timer efter transfektion. Imidlertid blev induktionen af ​​cellecyklus og apoptose ikke observeret i Kato-III-celler. Andelene af celler ved G0 /G1, G2 /M og S faser var ikke signifikant forskel mellem AP-4 siRNA’er grupper og kontrol eller modeller grupper. Den apoptose på Kato-III-celler transficeret med AP-4 siRNAs var højere end kontrollen siRNA (p 0,05) og mock celler (p 0,05). Men den apoptose sats i Kato-III celler med AP-4 lyddæmpning var lavere end AGS og SGC7901 celler med AP-4 lyddæmpning (p 0,05)

Diskussion

Gene. ekspression er en grundlæggende og særdeles konserveret proces. Transkription, det første skridt i genekspression, udføres ved strukturelt konserverede DNA-afhængig RNA-polymeraser, hvilket resulterer i syntesen af ​​et RNA-molekyle fra en DNA-skabelon [31]. Transkriptionsfaktorer, formular transskriptionsinitieringskompleks med RNA polymeras II, deltage i processen med transkriptionsinitiering til at regulere genekspression. De kan spille en vigtig rolle i transformation, tumorigenese, tumor progression og metastase ved at regulere transkription og derfor genekspression [32], [33], [34]. Transskription faktor AP-4, der tilhører den hastigt voksende gruppe af HLH proteiner [8] er involveret i differentiering og cellulær proliferation [35], [36], [37], [38], [39], påvirker celle cyklus begivenheder og apoptose, regulerer og styrer nogle genekspression [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. For nylig er det blevet rapporteret, at AP-4 blev opreguleret i colon carcinom, brystcancer og prostatacancer [9], [18], [24]. Desuden AP-4 positivt udtryk angivet en dårlig prognose med betydning i lønklasse, node status eller størrelse ER + brystkræft, og en mulig sammenhæng med kemo-følsomhed [40]. I vores tidligere undersøgelse har vi fundet, at ekspressionen af ​​AP-4 blev overudtrykt og det co-relaterede med en dårlig prognose [30]. Det kan være en molekylær markør for diagnose og prognose af gastrisk cancer. I den foreliggende undersøgelse ,. Vi designede to AP-4 specifikke siRNA’er til at inhibere ekspressionen af ​​AP-4-genet i humane gastriske cancerceller. De var godt etableret og transficeres i celler at resultere i knock-down af AP-4-genekspression. Vi fandt, at den mest potente tidspunkt til undertrykkelse AP-4 ekspression i gastriske cancerceller var 48 timer og 72 timer efter transfektion. Vi valgte derfor den tidligere for yderligere at gennemføre den relevante undersøgelse.

Tidligere er det blevet vist, at transkriptionsfaktor AP-4, i modsætning til andre HLH-proteiner, indeholdt to særskilte leucin gentagne elementer, som også direkte dimerisering og tillade selektiv kompleksdannelse af allestedsnærværende AP-4 protein [8], [41].

AP-4 kunne spille en vigtig rolle i modulering af cellulære funktioner via regulering af gener involveret i viral produktion [7], [16 ], [22], [42], [43], cellevækst og overlevelse [9], [17], [23], [44], immunrespons [14], [41], [45], og angiogenese [21]. Peter Jung, et al fandt, at AP-4 kunne kode for et c-myc-inducerbar repressor til at inhibere p21 ekspression [9], og formentlig spillet en vigtig rolle i mediering den proliferative aktivitet af c-MYC [10]. Desuden AP-4 påvirket følsomheden over for apoptose ved at regulere ekspressionen af ​​Caspase-9 [17]. I denne undersøgelse fandt vi, at nedregulering af AP-4 inhiberede proliferation af humane gastriske cancerceller in vitro. Proliferationen hæmning forhold mellem AP-4 specifikke siRNA’er var signifikant lavere end den for celler transficeret med kontrol siRNA eller mock gruppe.

Kemoterapi er en vigtig strategi ved behandling af gastrisk cancer, men det ofte mislykkes på grund af modstanden mod anticancerlægemidler. Det blev rapporteret, at AP-4 positivt udtryk muligvis var forbundet med kemo-følsomhed [40]. Vi næste undersøgte rolle AP-4 i reguleringen af ​​kemo-følsomhed af humane gastrisk kræftceller og fandt, at hæmning af AP-4 væsentlig grad kan øge følsomheden af ​​disse celler til ADR, 5-FU eller cis-plantinum behandling, hvilket tyder at inhibering af AP-4 kan have en gavnlig virkning i kemo-følsomhed.

Desuden inaktivering af AP-4, fremkaldte cellecyklusstandsning ved G0 /G1 faser, analyse af et potentielt mekanismer bag virkningerne af AP-4 silencing på inhibering af human gastrisk cancer celleproliferation blev karakteriseret ved ekspressionen af ​​cellecyklus-relaterede regulatorer. Vi fandt, at nedregulering af AP-4-ekspression inhiberede ekspression af cyclin D1, men opreguleret ekspression af p53 og p21. p53 og p21 er blevet antaget at være en negativ regulator af cellecyklussen og proliferation [46], [47], på den anden side, cyclin D1 fremmet progression gennem G

1-S-fasen af ​​cellens cyklus [48 ]. Nedreguleret ekspression af AP-4, p21 og p53 i mellemtiden kunne gøre cellecyklusstandsningen forårsaget knockdown af AP-4 forsvinden. Disse resultater er i overensstemmelse med en model, hvor AP-4 inducerer cellecyklusstop ved at regulere ekspressionen af ​​cellecyklus regulatorer, såsom p53, p21 og cyklin D1.

Apoptose, eller programmeret celledød, er kendt at deltage i forskellige biologiske processer ved to apoptotiske veje, mitokondrier (intrinsisk) pathway og død receptoren (extrinsic) pathway [49]. Vi fandt, at silencing AP-4-ekspression trigged celle apoptose i vores eksperiment, der demonstrerede, at AP-4 undertrykt apoptose i humane gastriske cancerceller.

I vores eksperiment, stigende niveauer af caspase-9 og nedregulering af Bcl-2 og Bcl-x

L blev påvist i humane gastriske cancerceller, hvilket indikerer, at knockdown af AP-4 aktiverede både indre og ydre veje til apoptose i cancerceller. [49], [50]

Sammenfattende data viser, at RNAi-medieret nedregulering af transkriptionsfaktor AP-4 inhiberede effektivt celleproliferation, angivet cellecyklusstop, udløste apoptose og øget kemo-følsomhed af humane gastriske cancerceller med reduceret ekspression af cyclin D1, Bcl-2 og Bcl-x

L og aktiveret p21, p53 og caspase-9-ekspression, som foreslog AP-4 kan være en onkogen spiller en vigtig rolle i tumorigenese . Selvom den præcise mekanisme af denne rolle skal undersøges nærmere, kan AP-4specific-siRNA’er være potentielle værdier som nye terapeutiske midler til human mavekræft.

Materialer og metoder

Cell linje og cellekultur

Humane gastriske kræftceller AGS med vildtype p53, SGC7901 med mutant p53 (opnået fra Wuhan University) og Kato-III med p53 genom sletning (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) blev dyrket i DMEM medium eller RPMI1640-medium (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Specifik siRNA og transfektion

cDNA-sekvensen af ​​AP-4-genet blev opnået fra Genbank ( NM_003223), og de målsekvenser af to 21-nucleotid forskellige siRNA’er blev udformet og kemisk syntetiseret (Qiagen Tyskland). Nucleotidsekvenserne var som følger: siRNA-1, 5′-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 ‘(sense), og 5′-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3′ (antisense). siRNA-2, 5’-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 ‘(sense), og 5′-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3’ (antisense). Allstars negativ kontrol siRNA (Qiagen Tyskland) blev anvendt som en kodet siRNA kontrol. Celler blev udpladet i 6-brønds plader og siRNA’er blev transficeret ind kultur celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Real-time kvantitativ PCR

Total RNA ekstraktion blev udført hjælp RNAiso Plus (Takara, Japan) ifølge fabrikantens protokol. CDNA’erne fra totalt RNA blev syntetiseret under anvendelse PrimeScript® RT reagens Kit (Takara, Japan). MRNA-ekspression blev vurderet ved realtids-PCR på en ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapore) med Fast SYBR Green PCR-reagenser. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. Koncentrationerne af reagenser blev justeret for at nå et endeligt volumen på 20 pi, der indeholdt 2 pi revers-transkriberet produkt, 10 pi Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), og 0,5 pi 10 pM fremad og reverse primere. Reaktionen blev udført ved 45 amplifikationscykler ved 95 ° C i 3 s og 60 ° C i 30 s. De følgende primere blev udformet (Table.1). PCR-primere blev designet af Primer 5,0 og BLAST-søgning for at kontrollere specificiteten. Primer sekvenser anvendt er anført i tabel 1. Resultaterne blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode.

Western blot

Protein blev ekstraheret med protein udvinding kit (Beyotime, Kina) ifølge retningen. Proteinet blev fortyndet til 3 pg /pl og blev separeret ved 10% SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, USA), og derefter blev blokeret i 5% fedtfri mælkepulver i TBST i 1 time ved stuetemperatur. Immunoblotting blev udført under anvendelse af anti-AP-4-antistof (Sigma-Aldrich, Shanghai, fortynding 1:1000), anti-p21-antistof (Sigma-Aldrich, Shanghai, fortynding 1:1000), anti-p53-antistof (Abcam, UK, fortynding 1:500) og anti-cyclin D1-antistof (Abcam, UK, fortynding 1:500) natten over ved 4 ° C. Efter tre gange skyllet med TBST blev membranen inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (fortynding 1:2000, Boster, Kina) i 1 time ved stuetemperatur. Resultatet blev visualiseret ved ECL Plus Western blotting påvisning ifølge fabrikantens instruktioner. Anti-β-actin (fortynding 1:1000, Boster, Kina) antistof fungerede som intern kontrol.

Måling af celleproliferation

Virkningen af ​​lyddæmpende AP-4 på mavekræft celledeling efter 48 timers transfektion blev målt ved Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Kina), ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, gastrisk cancer celler blev dyrket i plader med 96 brønde og transficeret med 20 nM kontrol siRNA, AP-4 specifikke siRNA’er. Efter 48 timer blev 10 pi CCK-8 reagens til hver brønd, Efter 1 times inkubation ved 37 ° C, absorbansen målt ved 450 nm. De relative niveauer af celleproliferation i hver gruppe af celler blev beregnet efter den følgende formel: R = (A2-A1) /A2 × 100% og P = A1 /A2 × 100% hvor R var relativt inhibitorisk sats og P var relativt proliferation forhold af cellevækst; A1was betyder absorbans værdi af transficerede celler; og A2 var gennemsnitlig ekstinktionværdi af utransficerede kontrolceller uden nogen lægemiddelbehandling. Alle eksperimenter blev udført med 5 brønde pr eksperiment og gentaget mindst tre gange.

Cell cyklus Assay

Celler blev høstet 48 timer efter transfektion og fikseret i 70% iskold ethanol natten over, vasket med 1 × PBS og farvet med propidiumiodid (PI) (50 ug /ml) i 1 × PBS suppleret med RNase (50 ug /ml) i 30 minutter. Tests blev udført tre gange for hver prøve, og blev udført af flowcytometer (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) i overensstemmelse med producentens retningslinier.

Chemo-følsomhed test in vitro

som tidligere beskrevet, blev CCK-8-assay anvendes til at vurdere effekten af ​​kemo-følsomhed gastriske cancerceller til anticancerlægemidler. Kort fortalt, seks timer efter transfektion blev mediet fjernet og erstattet med frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af anti-tumor lægemiddel (ADR, 5-FU eller cis-platin) og inkuberet i 48 timer. Relativt inhibitorisk rate af cellevækst blev beregnet i overensstemmelse med den ovennævnte formel

Apoptose analysen af ​​Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) farvning

For at vurdere hastigheden af ​​celle apoptose., Apoptose blev kvantificeret ved annexin-V-FITC og propidiumiodid dobbelt farvning under anvendelse af et annexin-V /FITC kit (Antgene, Kina). Celler blev opsamlet ifølge producentens instruktioner 48 timer efter transfektion, vaskes med kold PBS og suspenderet i bindingspuffer, og derefter blev cellerne inkuberet 30 minutter i mørke ved 4 ° C med Annexin V-FITC og PI i phosphatpuffer og analyseres på flowcytometeret (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) inden for 1 time efter farvning.

Statistisk analyse

Alle data blev vist som gennemsnit ± SD. Forskel mellem grupper blev analyseret ved envejs ANOVA og Student-Newman-Keuls (SNK) -q test med en SPSS 12.0 til Windows-software. Statistisk signifikans blev defineret som * p 0,05 og ** p. 0,01

Tak

Vi takker Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Hang og Li Wei for deres ekspert teknisk bistand .