PLoS ONE: Differential Afhængighed af Beclin 1 om regulering af Pro-Survival Autophagy af Bc-2 og Bd-XL i HCT116 Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

Autophagy beskrives at være involveret i homeostase, udvikling og sygdom, både som overlevelse og en død proces. Dens engagement i celledød fortsætter fra indbyrdes med apoptotiske vej. Vi fokuserede på overlevelse autofagi og undersøgt dens samspil med den apoptotiske maskineri. Vi fandt, at mens Mcl-1 forblev ineffektive, Bcl-2 og Bcl-xL var nødvendige for sultet celler til at vise en fuldt funktionel autophagic vej som vist ved proteolyse aktivitet og detektion af autophagic vesikler. Sådanne pro-autophagic funktioner af Bcl-2 og Bcl-XL var uafhængige af Bax. de optrådte Men at operere gennem ikke redundante mekanismer som Bd-XL udøvede en strammere kontrol end Bcl-2 over reguleringen af ​​autofagi: i modsætning til Bcl-2, Bd-XL og Atg7 manipulation gav identiske fænotyper tyder de kunne være komponenter af samme signalering vej; Bd-XL subcellulære lokalisering blev ændret ved sult, og vigtigere Bd-XL handlede uafhængigt af Beclin 1. Stadig en intakt BH3-bindingssted var påkrævet for Bd-XL til at stimulere en fuldt funktionel autophagic vej. Denne undersøgelse understreger, at der ud over deres veletablerede anti-død funktion under apoptose, Bcl-2 og Bcl-XL har en bredere rolle i celle overlevelse. Skal bcl-2 og Bd-XL står ved korsvejen mellem pro-overlevelse og pro-død autophagy, denne undersøgelse introducerer det nye koncept, at reguleringen af ​​autophagy af Bc-2 og Bd-XL justeres i henhold til dens overlevelse eller død resultat

Henvisning:. Priault M, Hue E, Marhuenda F, Pilet P, Oliver L, Vallette FM (2010) Differential Afhængighed Beclin 1 om regulering af Pro-Survival Autophagy af Bc-2 og Bd -XL i HCT116 Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 5 (1): e8755. doi: 10,1371 /journal.pone.0008755

Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasilien

Modtaget: September 15, 2009; Accepteret: 15. december 2009; Udgivet: 18 Jan 2010

Copyright: © 2010 Priault et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Nantes, Université de Bordeaux, Conseil Regional d’Aquitaine (til UMR 5095), og Agence Nationale pour la Recherche (projekt Maba til FV). M.P. blev understøttet af en ph.d.-stipendium fra INSERM. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Makro-autofagi (herefter kaldet autophagy) er en kataboliske proces orkestreret af de evolutionære bevaret

ATG

gener (for autophagy) [1], [2], og består i tilfældig beslaglæggelse af makromolekyler med nydannede dobbelte eller flere membranbundne vesikler kaldes autophagosomes. På grund af deres størrelse (normalt mellem 500-1500 nm i pattedyrsceller) [3], [4], autophagosomes kan omslutte opløseligt materiale samt hele organeller. Nedbrydning af lasten opnås efter spirende autophagic vakuoler har smeltet med lysosomer [5]. De resulterende produkter er så tilgængelige for genanvendelse i biosyntetiske veje; således autophagy er en af ​​de vigtigste lysosomale veje for biologisk materiale omsætning.

Autophagy blev oprindeligt karakteriseret som en overlevelse mekanisme, eftersom det tillader celler at overvinde stringente betingelser derved forløbende levetid. Ved sult, mutationer i

ATG

gener resulterer i celledød i gær, klorose i planter, og nedsat voksne levetid i

daf-2

Caenorhabditis elegans mutant [1]. I pattedyr, eksisterer autophagy på et basalt niveau og styrer homeostatiske funktioner. Stimulering af autophagy var længe kendt som en reaktion på sult og hormonal stimulation [6]; Men de seneste undersøgelser har udvidet cytobeskyttende rolle autophagy til vedligeholdelse af cellelevedygtighed ved at vise, at

ATG

gener er nødvendigt for at overleve i forskellige indstillinger i pattedyr [7] – [10]. I øvrigt i disse værker, blev autofagi elegant vist at være kritisk for bioenergetik vedligeholdelse og levedygtighed celle in vitro, men også til at spille en væsentlig rolle i vivo i overlevelse hele organismen.

Ved siden af ​​dette fysiologiske rolle i væv homeostase, autophagy er også paradoksalt nok forbundet med celledød. Dette koncept opstod fra den iagttagelse, at autophagy almindeligvis ses i døende celler, når massive elimination kræves organer [11]. Eksistensen af ​​”autophagic celledød” snarere end “celledød med autofagi” [12] var længe sat spørgsmålstegn fordi autofagi og apoptose ofte aktiveres sammen som reaktion på stress [13] – [15], selv vise forskellige morfologier [16]. Direkte beviser for en

ATG

-afhængig celledød blev bragt både tab af funktion undersøgelser, der viser, at nedregulering af

ATG7

eller

ATG5

kunne undertrykke celledød i apoptose-mangelfulde celler [17], [18], og også ved overekspression eksperimenter viser, at ektopisk udtryk for mutanter af

ATG6

/Beclin 1 kunne udløse autophagy stimulation, som resulterede i

ATG5

-afhængig celledød [19]. Således kan autofagi overvejes som en alternativ død program, i det mindste i celler med nedsat apoptose maskiner. Men hvis autophagic død nu er anerkendt, den kausale begivenhed for sin debut er stadig ukendt som (i) ingen endelig bevis for autophagy som den primære initiativtager til døden er blevet rapporteret, og (ii) bevis mangler stadig af en stimulus, der ville skew pro-overlevelse autophagy i en dødbringende program.

på det seneste har det område af interesse for autophagic celledød udvidet på grund af konstateringen af, at autophagy deregulering er impliceret i kræft, og fordi molekylære samspil har dokumenteret en krydstale mellem apoptose og autophagy [20]. Derfor er skæbnen for celler uden tvivl regeret af den koordinerede regulering af apoptose og autofagi, men hvornår og hvordan er stadig uløste spørgsmål [21], [22]. Et afgørende gennembrud med hensyn til dette sidste punkt var den konstatering, at nøglen regulator af autofagi Beclin en huser en BH3-domænet [23], som binder sig til BH1-BH2- domæner af anti-apoptotiske Bcl-2 [19] eller Bd-XL [24 ]. Fortløbende blev grundige analyser af reguleringen af ​​autophagy af Bc-2 og Bd-XL gennemført og afslørede, at deres binding til Beclin 1 resulterede i hæmning af autofagi. Denne binding blev oprindeligt foreslået at aflede Beclin en fra at interagere med og stimulerende klasse III phosphatidylinositol-3-kinase Vps34 aktivitet [19], men en konsensus nu taler imod en gensidigt udelukkende interaktioner af Beclin 1 med Bcl-2 og Vps34 [24] – [26], hvilket understreger, at autophagic aktivitet ikke udelukkende drevet af Beclin en association med Bcl-2 /Bcl-xL. Følgelig Zeng et al. har rapporteret indstillinger hvor Beclin 1 ikke binder Bd-XL eller Bcl-2 [27], viser, at disse interaktioner ikke forpligter. Alle disse observationer indikerer, at den funktionelle relevans af Bcl-2 /Beclin 1 eller Bcl-XL /Beclin 1 interaktioner ikke er helt forstået endnu. Endnu mere, visningen af ​​Bcl-2 som en anti-autophagic protein [28] – [30] blev udfordret af den konstatering, at overekspression af Bcl-2 i apoptose-mangelfulde celler i stedet kan forstærke autofagi [18]

for yderligere at undersøge dette emne, besluttede vi at udforske autophagic funktioner Bcl-2 familiemedlemmer under forhold, hvor autophagy stimulation fungerer som en overlevelse proces: svarer til, hvad der blev observeret med døden-fremmende autophagy, fandt vi, at overlevelse autofagi specifikt filtret sammen med anti-apoptotiske funktioner af Bcl-2 og Bcl-xL; dog interessant, de blev begge fundet at stimulere autofagi og udstillet forskellige afhængighed Beclin en til at spille sådanne pro-overlevelse funktioner.

Resultater

Sult-induceret Autophagy Er en overlevelse proces i HCT116 celler

kontroversen om den pro-overlevelse [7], [10] eller pro-død [17] – [19] resultatet af manipulation af autophagy under næringsstoffer begrænsende betingelser er blevet næret af konfrontationen af ​​flere undersøgelser . Derfor er vi først satte sig for at løse skæbne udsultede celler i vores indstillinger: kolorektale HCT116 celler blev valgt som de syntes, blandt alle de cellelinjer, vi har testet, at udstille den stærkeste autophagic reaktion, når de konfronteres med næringsstof begrænsning (vores upublicerede data ). Celler blev overført til sult medium og efterfulgt af video mikroskopi i løbet af 48 timer. Morfometrisk analyse (fig. 1A) afslørede, at HCT116 parentale celler meste vises apoptotiske funktioner (~55%) som bekræftet af caspase 3-aktivering (fig. 1B), mens -30% undergik en standard dødsfald som følge af en hurtig osmotisk død (inden for 20 til 30 minutter efter adskillelse fra pladen), og mindre end 5% forblev i live. HCT116-BaxKO subklon blev også analyseret for at analysere resultatet af sult i apoptose deficiente celler: som forventet morfometrisk analyse (. Figur 1A) og western blot (. Fig 1B) kunne ikke påvise nogen apoptotisk funktion, og vi observeret, at den del af celler undergår den osmotiske død forblev uændret (-30%). Interessant nok en anden fænotype dominerede som mere end 50% af HCT116-BaxKO celler løsnet fra pladen, men fastholdt levedygtighed da de genvundet normal vedhæftning og spredning, når de overføres tilbage til komplet medium (fig. 1C). Af note kunne disse løsnede celler ikke højde for mitotiske celler efter 48 timers udsultning siden næringssaltbegrænsning vides at inducere en hurtig cellecyklusstandsning [10], [31]. For at sikre, at denne reversible “stasis tilstand” var relevant i autophagic metabolisk hvilende fænotype Lum et al. har beskrevet [10], vi næste analyseret kravet om en funktionel autophagic maskiner. Autophagy anvender to ubiquitin-lignende konjugeringspartnere systemer til autophagosomes færdiggørelse, som både involverer Atg7, et protein der minder om de E1 ubiquitin-aktiverende enzymer [32] er essentielle for autofagi [33]. Som følge heraf er Atg5 konjugeret til Atg12 når autofagi er aktiveret; western blot afslørede, at sult massivt induceret autophagy i HCT116 BaxKO subklon sammenlignet med parentale celler (fig. 1B). Genetisk svækkelse af autofagi blev også udført under anvendelse shRNA målretning af Atg7, og sultet HCT116-BaxKO shAtg7 celler viste sig at undergå massiv osmotisk celledød (-80%) som følge defekt indtræden i autophagic stasis tilstand ( 5%) (fig . 1A), hvilket bekræftes af den dramatiske nedgang i Atg5-Atg12 konjugat i disse celler (fig. 1B). Den stasis tilstand var således afhængig af autophagy og viste et middel til at holde døden på afstand. Vi konkluderer, at selv om forbigående fordi celler i sidste ende dø, hvis sult forlænges, autofagi giver en overlevelse fordel i vores indstillinger.

(A) Morfometrisk analyser af celler sultet i 48 timer. Celler blev udpladet i fuldstændig medier og time-lapse video mikroskopi blev startet ved overførsel til HBSS. Levedygtige celler er defineret som adhærente celler, apoptotiske celler defineres som celler, der udviser multiple bleb’er, død efter tab af osmotisk integritet er defineret som celler, som viser opsvulmningen af ​​et enkelt bleb, og stasis celler er defineret som celler, der har løsnet sig fra undergrunden men opretholde plasmamembranintegritet. Et minimum af 700 celler blev analyseret i løbet af tredobbelte eksperimenter. Scale bar: 50 pm. (B) Western blots viser caspase 3-aktivering og Atg5-Atg12 konjugat i hele celler ekstrakter fra celler sultet i de angivne tidsrum. (C) De ikke-klæbende HCT116-BaxKO celler fra 24 timer-sultede kulturer blev indsamlet og overført til komplet medium. Celler lodes adhærere i 6 timer, derpå time-lapse video mikroskopi blev startet i 48 timer. Målestok:. 100 um

Den Autophagic Kapaciteter af kolorektal HCT116 celler er uafhængig af Bax

Den tidligere eksperiment foreslog, at når celler kan udføre både apoptose og autophagy, apoptotiske fænotyper forrang for autophagic funktioner. Vi var derfor bekymret over muligheden for, at autophagic reaktion faktisk kunne blive forringet ved udførelsen af ​​apoptose. For at løse dette spørgsmål, har vi sammenlignet autophagic kapacitet HCT116 og HCT116-BaxKO celler under betingelser, hvor macroautophagy er fremherskende i den proteinnedbrydning, nemlig efter 6-9 timers sult [34]. Fig. 2A viser nedbrydningen af ​​L – [

14C] valin-mærkede proteiner der lever længe. Den basale proteolyse målt under kontrol betingelser var sammenlignelig i begge cellelinier og henholdsvis indstillet som intern reference (hvide søjler). Sult resulterede ligeledes i en to-gange forøget proteolyse i begge cellelinier (sorte søjler). Denne proteolyse var (i) i det væsentlige lysosomal siden bafilomycin A1 (Baf A1, en inhibitor af lysosomal ATPase proton pumpe) fuldstændig forhindret dens udvidelse (mørkegrå søjler), og (ii) i forbindelse med autophagy siden dets stimulering blev signifikant vendes ved 3-MA (lys grå søjler). Som en kontrol, et apoptotisk induktion af etoposid i samme periode stimulerede ikke nogen proteolyse (skraverede søjler). Vi analyseret også omdannelsen af ​​cytosolisk Atg8 /LC3-I i autophagosome-bundne phosphatidylethanolamin konjugat LC3-II, som er en af ​​kendetegnene ved autofagi. Western blots (fig. 2B) bekræftede, at HCT116 og HCT116-BaxKO begge produceret sammenlignelige mængder af LC3-II upon sult. Den diffuse cytosoliske af punktformig lokalisering af mCherry-LC3 blev også overvåget i muse embryonale fibroblaster (MEF’er) som et alternativ cellelinie, og viste, at sult udløste samme autophagosomal relocalisation af LC3 i vildtype-MEF’er og Bax bankede-out MEF’er (Fig . S1). Tilsammen vores eksperimenter viser, at apoptose udførelse ikke forringer autophagic respons, og vi konkludere, at den autophagic kapacitet er uafhængig af Bax

(A) HCT116 og HCT116-BaxKO celler blev inkuberet med L -. [

14C] valin, og jaget i 9 timer i komplet medium (hvide søjler), HBSS (sorte søjler) eller HBSS suppleret med enten 0,1 uM Baf A1 (mørkegrå søjler), eller 10 mM 3-MA (lysegrå søjler) eller i komplet medium +20 uM etoposid (skraverede søjler). Resultater rapporterer stimulering af proteolyse i forhold til de respektive basale niveauer målt under ikke-sultende betingelser (hvide søjler). Værdierne er de hjælp af mindst 3 uafhængige forsøg ± s.d. (B) Western blot og kvantificering af omdannelsen af ​​LC3-I i phosphatidylethanolamin konjugeret LC3-II. Celler blev dyrket i komplet medium eller udsultet i 9 timer i nærværelse af E-64d (20 ug /ml) og leupeptin (20 pg /ml) for at forhindre nedbrydningen af ​​intra-autophagosomal LC3-II. 150 ug helcellelysat blev påsat 15% SDS-PAGE. * Student test p. 0,02

Ektopisk ekspression af Bel-2 og Bd-XL, men ikke Mcl-1, Stimulerer Autophagy

Sidstnævnte resultat forudsat jordforbindelse for vores beslutning til bruge apoptose-mangel subklonen HCT116-BaxKO at tage fat på reguleringen af ​​pro-overlevelse autophagy af anti-apoptotiske proteiner, mens adskille bidraget fra Bcl-2 familiemedlemmer til apoptose. HCT116-BaxKO celler blev transficeret med plasmider, der koder enten Bcl-2, Bcl-XL eller Mcl-1, hvilket resulterer i henholdsvis 9, 2 og 3 fold protein stigning (fig. 3A). Sult ikke ændre udtryk profiler (fig. S2). Video mikroskopi af udsultede celler viste, at overekspression af Bcl-2 og Bcl-XL markant stigning i antallet af celler ind i autophagic stasis tilstand (fig. 3B, henholdsvis 88% og 82%), hvorimod Mcl-1 overekspression augmented i stedet antallet af levedygtige adhærente celler (fig. 3B, hvid bar = 48%). Således Bcl-2 og Bd-XL klart haft en anden effekt end Mcl-1 på autofagi. Dette blev bekræftet ved autophagic proteolyse (fig. 3C) og transmission elektronmikrofotografier (TEM), hvor nedbrydende vesikler var mere rigelige i celler, der udtrykker Bcl-2 og Bcl-XL mens dem udtrykker Mcl-1 forblev som utransficerede celler (fig. 3D, og . fig S3 for forstørrelse); bemærke, lejlighedsvis, omfattende vakuolisering optrådte i cellers cytoplasma over-udtrykkende Bd-XL (Fig. 3D, venstre panel). Når vi bruges BaxKO MEF’er og overvåges mCherry-LC3 fluorescens mønster, fandt vi, at relocalisation af proteinet mod punktformig strukturer blev signifikant stimuleret i Bcl-2 eller Bcl-XL-transficerede celler (fig. 3E), hvilket viser, at fænomenet var bevaret i en alternativ cellelinie. Alle guld standard teknikker, der anvendes hidtil enstemmigt viste, at kun autophagic vesikler (AVS) er påvirket af Bcl-2 eller Bcl-xL overekspression mens andre lipide vesikler som multi-vesikulær organer ikke; derfor vi brugte monodansylpentane (MDH) [35] (et lipofilt farvestof, som allerede vist sig at plet AVS [36]) for at køre computer-assisteret analyser af AVS, måle deres størrelse, og bestemme deres påvisningsfrekvensen (Fig S4.): udsultet HCT116-BaxKO celler transficeret med Bcl-2 eller Bcl-xL afslørede en forøgelse af antallet af Avs, korreleret med en øget frekvens af forekomst af større AVS, nogle er dobbelt så stort som klassiske autophagosomes som bekræftet ved lejlighedsvis TEM. På den modsatte, Mcl-1 transficerede celler var ikke statistisk forskellige fra utransficerede celler. Derfor konkluderer vi, at mens Mcl-1 ikke spiller en væsentlig rolle i overlevelse autophagy, Bcl-2 og Bd-xL specifikt stimulere autophagic kapacitet og øge AVS antal og størrelse.

(A) Western blots af celler transficeret med en tom vektor, eller vektorer, der koder Bcl-2 eller Bcl-xL eller Mcl-1. 50 ug af proteinekstrakter blev analyseret på en 12% SDS-PAGE. MCL-1 blev detekteret som et modent protein (m), en splejset variant (er) og en caspase-spaltet produkt (c). (B) Morfometrisk analyser af HCT116-BaxKO-afledte stabile cellelinier: celler blev udsået i komplette medier og time-lapse video mikroskopi startede, da cellerne blev overført til HBSS (sult) eller ej (komplet). Et minimum af 700 celler blev analyseret i mindst tredobbelte eksperimenter. (C) Relativ stimulering af sult-induceret 3-MA-sensitive nedbrydning af langlivede proteiner i HCT116-BaxKO cellelinier transficeret eller ikke med Bcl-2 eller Bcl-XL eller Mcl-1. Celler blev sporet i 6 timer i HBSS eller HBSS + 3-MA. Det 3-MA følsom aktivitet målt i HCT116-BaxKO celler blev sat til 1 og resultaterne repræsenterer 3-MA følsomme aktiviteter for hver cellelinje i forhold til den, der findes i ikke-transficerede celler. Dataene er den gennemsnitlige (± standardafvigelse.) På mindst 3 uafhængige forsøg. Student-test blev anvendt til statistiske signifikans af resultaterne i forhold til utransficerede celler: (*) p = 0,010 (**) p = 0,001 og (***) p = 0479. (D) TEM af HCT116-BaxKO celler overudtrykker Bcl-2 eller Bcl-XL eller Mcl-1 efter 6 timers sult i HBSS. Pile peger på nedbrydende autophagosomes. Målestok: 2 um. (E) 24 timer efter transfektion med enten mCherryLC3 alene eller med mCherryLC3 og Flag-Bd-XL eller Flag-Bcl-2, BaxKO MEF-celler dyrket i komplet medium eller sultet i 6 timer blev fastsat. Immonocytochemistry afslører Flag-mærkede konstruktioner (grøn). Billeder er repræsentative for mindst 4 uafhængige forsøg. Målestok:. 10 um

nedregulering af Bd-XL er en mere potent hæmmer af Autophagy end Bcl-2

Vi næste undersøgt effekten af ​​Bd-2 og Bd-xL nedregulering sammenlignet med den for Atg7 i udsultede celler. En infektionsmultiplicitet (MOI) på 4 forårsagede mindst 90% dæmpning af målgenerne (fig. 4A) uden nogen indbyrdes påvirkning på hinanden (ikke vist). Over tidsrammen for eksperimentet levedygtighed transduceret celle forblev på kontrolværdier ( 90%, data ikke vist) både i komplet medium eller efter 6h sult. TEM viste, at dobbelt membranbundne vesikler var knap påviselige i udsultede celler, hvor Bcl-2, Bcl-XL eller Atg7 var blevet nedreguleret i forhold til SCR transducerede celler (fig. 4B). Plasmidet anvendt til at transducere den shRNAs koder for det grønt fluorescerende protein (GFP) og vi kunne således korrelere effektiviteten af ​​infektion med autophagic respons afsløret ved mCherryLC3 lokalisering (fig. 4C). Ved udsultning, celler udviser en høj grad af transduktion med shAtg7 (stærkt GFP-positive celler) udviste en diffus cytosolisk fordeling af mCherryLC3 viser, at autofagi var effektivt forringet, medens ikke transducerede celler vises punktformet mCherryLC3 organisation. I holde, sultet celler hvori shBcl-2 eller shBcl-xL var blevet effektivt transduceret udstillet en diffus mCherryLC3 farvning, selvom shBcl-xL reproducerbart udløste en stærkere hæmmende fænotype end shBcl-2. Således Bcl-2 eller Bcl-XL nedregulering havde en inhiberende virkning på autofagi dog dette eksperiment kunne indikere, at Bcl-2 og Bcl-XL ikke kan være helt overflødig for den molekylære kontrol af overlevelse autofagi. I et forsøg på at kvantificere en sådan forskel, vi endelig analyseret sult-induceret proteolyse af shRNAs transducerede celler: for en MOI på 4, Bcl-2 bankede-down celler bibeholdt 75% af den 3-MA følsomme proteolyse sammenlignet med en scramble shRNA (SCR). Dette plateau blev nået allerede med en MOI på 2 og forblev uændret selv for højere MOI (ikke vist). I modsætning hertil Bd-XL og Atg7 lyddæmpning faldt nedbrydningshastigheden henholdsvis 15 og 17% (fig. 4D). Derfor Bcl-2 og Bcl-XL-knockdown begge havde en overbevisende inhiberende virkning på autophagic proteolyse. Dog kun Bd-XL nedregulering efterlignede den for Atg7 og viste en central molekylær kontrol med autofagi.

(A) Western blots af HCT116-BaxKO celler inficeret med stigende mængder af viruspartikler transducerende shRNA mod Bcl- 2, Bcl-xL eller Atg7, eller en kodet shRNA (SCR). Totale proteinekstrakter blev udført, og 50 ug proteiner blev analyseret på SDS-PAGE. (B) HCT116-BaxKO celler inficeret med virale partikler, der bærer shRNA mod Bcl-2, Bcl-XL eller Atg7 med en MOI = 4 blev analyseret for autophagic nedbrydning af langlivede proteiner kort efter infektion. Celler blev sporet i 6 timer i HBSS eller HBSS + 10 mM 3-MA. 3-MA følsom aktivitet målt i SCR-inficerede celler blev sat til 100%, og resultaterne repræsenterer 3-MA følsomme aktiviteter af hver inficeret cellelinje i forhold til den, der findes i SCR-inficerede celler. Dataene er den gennemsnitlige (± standardafvigelse.) På mindst 3 uafhængige forsøg. Når fejlen ikke er angivet, bar var for lille til at blive set. (C) HCT116-BaxKO celler stabilt transficeret med mCherryLC3 blev inficeret med virale partikler, der bærer shRNA mod Bcl-2, Bcl-XL eller Atg7 med en MOI = 4. Celler blev analyseret for deres GFP-fluorescens (inficerede celler) og LC3 relocalisation efter 6 timers udsultning. Målestok: 15 um. (D) TEM efter 6 timers udsultning af HCT116-BaxKO celler, hvor Bcl-2 eller Bcl-XL eller Atg7 ekspression blev stille. Målestok:. 2 um

Bd-XL Regulerer Survival Autophagy Uafhængigt af Beclin 1

Undersøgelser rapporterer anti-autophagic funktioner Bcl-2 og Bd-XL skildrer tilstande, hvor stimuleret autofagi resulterede i celledød, og viste, at deres binding til Beclin 1 blokerede indtræden af ​​autofagi. På den modsatte, Zeng et al. rapporterede, at i ikke-sultede U-251 glioblastom celler, hverken Bcl-2 eller Bcl-xL var normale endogene bindingsenheder for Beclin 1 [27], hvilket tyder på, at afhængigt af indstillingerne, er disse proteiner ikke forpligter partnere.

i vores paradigme cytobeskyttende autofagi, endogene Beclin 1 blev immunpræcipiteret fra kontrol eller sultede cellelysater (fig. 5A). Bcl-2 blev effektivt trukket ned, men ikke Bd-XL; af note, gjorde Bcl-2 /Beclin en forening ikke variere i udsultet versus kontrol celler. Det modsatte immunpræcipitation af endogent Bcl-2 bekræftet disse observationer, mens Bd-XL igen undladt at pull-down nogen påviselig Beclin 1. Disse eksperimenter understøtter en differentieret regulering af pro-overlevelse autophagy af Bc-2 og Bd-XL, men yderligere forsøg var nødvendige for at konstatere, at Bd-xL handlet uafhængigt af Beclin 1. Subcellulær fraktionering viste, bortset fra den mitokondrielle del af bcl-2, væsentlige mængder af Bcl-2 og Beclin 1 overlap i lette fraktioner, og i yderligere overensstemmelse med IP resultater, none af disse proteiner ændret lokalisering i kontrol- eller udsultede celler. I modsætning hertil blev Bd-XL detekteret i hele gradient i kontrolceller og blev relocalised til meget lette fraktioner i udsultede celler; betragtning af antallet af rum, hvor Bd-XL er til stede, er det rimeligt at antage, at det kan interagere med mange partnere, og dette kan forklare, at Beclin 1 ikke findes som sin vigtigste interagerende partner gennem IP eksperimenter. Konfokale analyser viste, at Bd-XL co-lokaliseret med den mitokondriske indre membran-protein ATP1 i kontrol og udsultede celler (Fig 5C.); dermed lette fraktioner hosting Bd-XL i sultede celler er i umiddelbar nærhed af mitokondrier.

(A) Co-immunopræcipitationsforsøg af endogent Beclin 1 med endogent Bcl-2 og Bd-XL i HCT116-Bax KO celler dyrket i komplet medium eller sultet i 6 timer. (B) Subcellulær fraktionering af HCT116-Bax KO celler dyrket i komplet medium eller sultede i 6 timer. Celler blev brudt med en Dounce homogenisator, blev post-nukleare supernatanter fyldt på toppen af ​​en kontinuerlig 10-55% saccharosegradient for ultracentrifugering natten over. Fraktioner på 500 pi blev opsamlet, og totalt protein udfældes. Det samme volumen af ​​hver fraktion blev separeret på en 14% tris-tricin SDS-PAGE. Western-blots var som beskrevet i metodeafsnittet. (C) Immuncytokemi på endogene Bd-XL og ATP1 i HCT116-BaxKO celler dyrket i komplet medium eller sultet i 6 timer.

Fordi IP eksperimenter viste en interaktion mellem Bcl-2 og Beclin 1 men var usikkert for Bd-xL og Beclin 1, vi endelig besluttet at oprette en sidste række eksperimenter for yderligere at udforske de funktionelle forskelle mellem Bcl-2 og Bd-xL og deres afhængighed af Beclin 1. vi analyserede autofagi i celler overudtrykker Beclin 1 eller BH3 mutanter Beclin 1

F123A og Beclin 1

125A som henholdsvis løs eller bevarer deres binding til Bcl-2 og Bcl-xL [19], [37] (protein ekspressionsniveauer er vist i fig. S5 ). Fig.6A viser, at som forventet, Beclin 1 ektopisk ekspression stimulerede sult-induceret autophagic proteolyse. En sådan egenskab var strengt afhængig af et funktionelt BH3-domænet (dvs. i stand til at interagere med BH1-BH2 indeholdende partnere) siden Beclin 1

125A efterlignede vildtypeproteinet, mens Beclin 1

F123A var helt ude af stand til at udløse autofagi. De BH1 mutanter af Bcl-2 og Bd-XL (dvs. Bcl-2

G145A eller Bd-XL

G138A), som både løs samspil med BH3 domæne Beclin 1 [19], [24] var analyseret i hinanden. Niveauer af over-ekspression i HCT116-BaxKO celler lignede dem af ektopisk Bcl-2 og Bcl-XL (Fig. S2). Forhindre bindingen af ​​Bcl-2 til Beclin 1 fuldstændigt ophævet stimulering af autophagic proteolyse observeret med nativ Bcl-2. TEM bekræftede, at mængden og størrelsen af ​​autophagic vesikler i Bcl-2

G145A udtrykkende celler var meget forskellige fra Bcl-2 udtrykkende celler, og var faktisk sammenlignelig med ikke-transficerede celler (sammenlign med fig. 3D og fig. 6B højre). Derfor Bcl-2 pro-autophagic funktioner helt afhængige af binding af et BH3 indeholdende partner (sandsynligvis Beclin 1 ifølge IP eksperimenter og for proteolyse data opnået med Beclin 1

F123A). I modsætning hertil Bd-XL

G138A stadig bevaret en svag evne til at stimulere autophagic nedbrydning, selv om det var langt mindre effektiv end dets native modstykke (fig. 6A). TEM indikerede, at Bd-XL

G138A stimulerede AVS syntese så effektivt som Bd-XL (sammenlign med fig. 6B venstre med fig. 3D). Relocalisation af mCherry-LC3 i BaxKO-MEF’er transficeret med Bd-XL

G138A bekræftede denne observation (sammenlign fig. 6C med fig. 3E). Colocalisation af LC3 og Lamp1A i udsultede HCT116 BaxKO celler, der udtrykker Bcl-xL eller Bcl-xL

G138A viste, at autophagic vesikler indeholdt begge mærker, og dermed repræsenterer nedbrydende autophagosomes. Derfor er mutation af Bcl-xL BH3-bindingssted resulterede i et strukturelt intakt, men funktionelt svækket autophagic pathway. Dette sæt af data indikerer, at nedbrydende AVS dannes i Bd-XL

G138A men er behov for yderligere eksperimenter for at forklare, hvorfor disse AVS er mindre funktionel end i Bd-XL udtrykkende celler. Sammenligning af mængden af ​​Atg5-Atg12 konjugat i ikke transficerede celler eller i celler, der udtrykker Bcl-xL eller Bcl-XL

G138A identificerede ikke nogen forskel, hvilket indikerer, at konjugation trinnet ikke er begrænsende, og kan ikke blive yderligere stimuleret af Bcl- xL ekspression (fig. S6). Fremtidige forsøg vil tage sigte på at sammenligne kinetik AVS modning i Bd-XL og Bd-XL

G138A udtrykker celler. Som en konklusion, Bcl-2 og Bd-XL udviser en differentieret afhængighed Beclin 1 finder vise deres pro-autophagic funktioner. Mens Bcl-2 påberåbt fuldt på dens binding til Beclin 1, går Bd-XL ikke styre dannelsen af ​​autophagosomes via Beclin 1, og vi foreslår, at et protein, der anvender BH3-bindende domæne hjælper Bd-XL stimulere en funktionel autophagic pathway.

(A) Relativ stimulering af sult-induceret 3-MA-sensitive nedbrydning af langlivede proteiner i HCT116-BaxKO cellelinier transficeret eller ikke med Bcl-2, Bcl-2

G145A, Bcl- xL, Bd-xL

G138A, Beclin 1, Beclin 1

F123A eller Beclin 1

I125A. Celler blev sporet i 6 timer i HBSS eller HBSS + 3-MA. Resultaterne repræsenterer de 3-MA følsomme aktiviteter af hver cellelinje i forhold til den, der findes i ikke-transficerede celler. Dataene er den gennemsnitlige (± standardafvigelse.) På mindst 3 uafhængige forsøg. Student-test blev anvendt til statistiske signifikans af resultaterne i forhold til utransficerede celler; p-værdier ikke er angivet på grafen er p 0,01. (B) TEM af HCT116-BaxKO celler transficeret med Bcl-XL

G138A (venstre) eller Bcl-2

G145A (højre) efter 6 timers udsultning. Målestok: 2 um. (C) 24 timer efter cotransfektion af mCherryLC3 med Flag-Bd-XL

G138A, BaxKO MEF dyrket i komplet medium eller sultede i 6 timer blev fastsat. Immonocytochemistry afslører Flag-mærkede konstruktioner (grøn). Billeder er repræsentative for mindst 4 uafhængige forsøg. Målestokken: 10 um. (D) HCT116BaxKO celler overudtrykker Bd-XL eller Bcl-XL

G138A blev transficeret med mCherryLC3 og mEGFP-Lamp1A. Efter 6 timer af sult blev celler fikseret og observeret med et 100x objektiv. (Skala bar: 5 um)

Diskussion

De molekylære baser at forudsige cytobeskyttende eller pro-