PLoS ONE: ZNF93 Øger Modstand mod ET-743 (Trabectedin, Yondelis®) og PM00104 (Zalypsis®) i Human Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

ET-743 (trabectedin, Yondelis®) og PM00104 (Zalypsis®) er marine afledte forbindelser, der har antitumoraktivitet. ET-743 og PM00104 eksponering i længere perioder af behandling vil resultere i udvikling af lægemiddelresistens, men de mekanismer, der fører til resistens er endnu ikke forstået.

Metodologi /vigtigste resultater Salg

Humant chondrosarcoma cellelinier resistente til ET-743 (CS-1 /ER) eller PM00104 (CS-1 /PR) blev etableret i denne undersøgelse. CS-1 /ER og CS-1 /PR udviste krydsresistens over for cisplatin og methotrexat men ikke til doxorubicin. Humane Affymetrix Gene Chip arrays blev anvendt til at undersøge relative genekspression i disse cellelinier. Vi fandt, at et stort antal gener har ændret ekspressionsniveauer i CS-1 /ER og CS-1 /PR sammenlignet med den parentale cellelinje. 595 CS-1 /ER og 498 CS-1 /PR gener blev identificeret som overekspression; 856 CS-1 /ER og 874 CS-1 /PR transkripter blev identificeret som underexpressing. Tre zinkfingerprotein (ZNF) gener var på øverste 10 overudtrykte gener listen. Disse gener er ikke tidligere blevet associeret med resistens i tumorceller. Differential udtryk for ZNF93 og ZNF43 gener blev bekræftet i både CS-1 /ER og CS-1 /PR resistente cellelinier ved real-time RT-PCR. ZNF93 blev overudtrykt i to ET-743 resistente Ewing sarkom cellelinier såvel som i et cisplatin resistente ovariecancer-cellelinje, men blev ikke overudtrykt i paclitaxel-resistente cellelinier. ZNF93 knockdown af siRNA i CS-1 /ER og CS-1 /PR forårsagede øget følsomhed for ET-743, PM00104, og cisplatin. Desuden ZNF93 transficeret, CS-1 celler er relativt resistent over for ET-743, PM00104 og cisplatin.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse tyder på, at zink finger proteiner og ZNF93 i særdeleshed, er involveret i modstanden mod eT-743 og PM00104

Henvisning:. Duan Z, Choy E, Harmon D, Yang C, Ryu K, Schwab J, et al. (2009) ZNF93 Øger Modstand mod ET-743 (Trabectedin, Yondelis®) og PM00104 (Zalypsis®) i menneskelige kræftceller. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10,1371 /journal.pone.0006967

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: April 2, 2009; Accepteret: August 10, 2009; Udgivet: 9 September, 2009

Copyright: © 2009 Duan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet dels af en bevilling fra PharmaMar. Dr. Duan understøttes, delvis gennem en bevilling fra æggestokkene Cancer Research Foundation (oCRF), og en bevilling fra National Cancer Institute, NIH (Nanoteknologi Platform Partnership), R01-CA119617. Dr. Choy er støttet af Jennifer Hunter Yates Foundation. Support er også blevet leveret af de Gattegno og Wechsler funds.The finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi anerkender også, at de 2 ud flere kemoterapi lægemidler, der anvendes i denne undersøgelse, ET-743 og PM00104, blev fremstillet og leveret af firmaet, PharmaMar som også delvist finansieret arbejdet

Konkurrerende interesser:. Jeg bekræfter, at PharmaMar USA, Inc har ingen indflydelse på resultaterne og konklusionerne af denne undersøgelse. Jeg erklærer også, at resultater og konklusioner ikke var påvirket af en bevilling fra PharmaMar USA, Inc. Selv om denne undersøgelse blev støttet dels af en bevilling fra PharmaMar, ændrer det ikke vores tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer med andre efterforskere. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi anerkender også, at de 2 ud flere kemoterapi lægemidler, der anvendes i denne undersøgelse, ET-743 og PM00104, blev fremstillet og leveret af firmaet, PharmaMar som også delvist finansieret arbejdet.

Introduktion

ET-743 (Yondelis®, Trabectedin) er marine alkaloid derivat isoleret fra det caribiske hav squirt

Ecteinascidia turbinal

[1], [2]. ET-743 har et bredt spektrum af aktivitet i tumorcellelinier til pm og lave nM koncentrationer, og det har også klinisk aktivitet over ovariecancer, brystcancer og sarkomer [2], [3]. ET-743 er blevet godkendt af EMEA /EU for patienter med avancerede sarkomer, der enten har skred frem efter behandling med antracyklin eller ikke klinisk egnet til at modtage konventionelle agenser [4]. ET-743 er sammensat af tre tetrahydroisoquinolin underenheder indeholdende et centralt carbinolamin-del gør det muligt at binde kovalent til DNA. ET-743 binder til minor groove i DNA-spiralen med sekvensspecifik binding præference for GC-holdige trillinger og efterfølgende danner kovalente addukter med N2-stillingen af ​​guanin. Som følge heraf er minor groove-eksponeret og vendt mod major groove. Når en sådan binding forekommer, DNA-strenge bliver tværbundet og ikke kan replikeres, hvilket resulterer i celledød [5], [6]. Retningen af ​​DNA drejning er en hidtil ukendt træk blandt DNA minor groove-interaktive midler, hvilket således gør ET-743 unikke.

PM00104 (Zalypsis®), afledt af bløddyr, er en hidtil ukendt kemisk enhed relateret til Jorumycin, en marine naturlige forbindelse, der tilhører familien af ​​

renieramyciner

, fremstillet af svampe [7], [8]. PM00104 har

in vitro

in vivo

anti-tumor aktivitet overfor et bredt udvalg af faste og hæmatologiske tumorer. Som med ET-743, PM00104 også binder til DNA og er cytotoksisk; dog i modsætning ET-743, PM00104 aktiverer ikke “DNA beskadigelse checkpoint” respons. Således de cytotoksiske virkninger af PM00104, selvom afhængig af DNA-bindende, ikke udløst af DNA-skader reaktionsmekanismer [8].

Som med andre kemoterapeutiske stoffer, ET-743 og PM00104 eksponering i længere perioder af behandlingen vil resultere i udvikling af lægemiddelresistens, men de mekanismer er ikke godt forstået. Forskellige undersøgelser har rapporteret modstridende beskrivelser af forholdet mellem ABCB1 ekspression og ET-743 resistens i humane cancercellelinier [9], [10]. I den humane ovarie celle IGROV-1, som er valgt for ET-743 resistens, er ABCB1 overudtrykkes [11]. Følsomhed kunne genoprettes ved tilsætning af pGP1 inhibitoren PSC-833, hvilket antyder, at ET-743 kan være en pGP1 substrat. En anden undersøgelse imidlertid bemærket, at to Pgp over-udtrykker humane epidermoide cancercellelinier (KB-8-5 og KB-C-2) var ikke resistente over for ET-743 [9]. Navnlig kunne subletale koncentrationer af ET-743 revers resistens over for doxorubicin og vincristin i disse cellelinier. Der er ingen rapporter, der beskriver den mekanisme af PM00104 modstand i tumorceller.

chondrosarcomer er en heterogen gruppe af tumorer af mesenchymal oprindelse, der udvikler i ben eller brusk og vise chondrocytisk egenskaber [12]. Disse tumorer reagerer dårligt på konventionelle behandlinger såsom kemoterapi og strålebehandling, og prognose er relateret til tumorklassificering og differentiering status. Følsomheden af ​​sarkom celler til ET-743 og PM00104 har ført os og andre til at overveje disse forbindelser som interessante kandidater til fremtidige behandling af chondrosarcoma [13], [14], [15]. Men som med andre kemoterapeutiske midler, tilbøjeligheden af ​​tumorceller at udvikle resistens mod ET-743 eller PM00104 udgør en betydelig udfordring for at bruge dette lægemiddel over en længere tidsperiode. Målet med denne undersøgelse er at undersøge mekanismerne i ET-743 eller PM00104 modstand i chondrosarcoma

Materiale og metoder

Kemoterapi narkotika

ET-743 (Yondelis®.; trabectedin) og PM00104 (Zalypsis®) blev leveret af PharmaMar (Spanien). Paclitaxel (Taxol @), doxorubicin (Adriamycin RDF®, EF-nr 2.468.183), Methotrexat (Trexall) og cisplatin (cisplatin, CDDP) blev opnået gennem ubrugt resterende kliniske materiale fra apoteket på Massachusetts General Hospital. Den stamopløsning af lægemidler blev fremstillet i overensstemmelse med de specifikationer, narkotika og opbevares ved -20 ° C.

chondrosarkom cellelinje CS-1

Den menneskelige chonodrosarcoma cellelinie, opformeres siden 1999 og betegnet CS -1, blev etableret fra en kirurgisk resektion human højkvalitets chonodrosarcoma, der ikke tidligere eksponeret for kemoterapi eller stråleterapi, og dyrket i monolag. Kort beskrevet væv blev aseptisk opnået umiddelbart efter resektion, som er tilføjet i RPMI-1640 vævskulturmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum, og vævet dyrket ved 37 ° C inkubator indeholdende 5% CO2 [13], [14]. Den detaljerede analyse af CS-1 er blevet rapporteret tidligere [13], [14], [15], [16], [17]. Totalt RNA blev ekstraheret efter CS-1 blev passeret fire gange.

Etablering af ET-743 eller PM00104 resistent cellelinje

CS-1 /ER og CS-1 /PR celler resistente over for ET -743 eller PM00104 blev etableret fra CS-1 forælder cellelinie ved udsættelse for ET-743 eller PM00104 med trin-for trin stigning koncentration af ET-743 eller PM00104 i et år ved hjælp af lignende metode som tidligere rapporteret [18], [19 ], [20]. Kort fortalt blev dyrkede CS-1-celler udsat for 0,00001 uM enten ET-743 eller PM00104 i 7 dage og derefter vasket og dyrket i medium indeholdende 0,00003 uM i 7 dage. Hvis CS-1 celler demonstrerede cytotoksiciteter efter udsættelse for en given koncentration af ET-743 eller PM00104, blev de vasket og dyrket i stoffri medium i 7 dage. For eksempel bemærkede vi 90% af CS-1-celler blev dræbt, da celler blev udsat for 0,001 pM af ET-743 eller 0.003 uM PM00104 i 7 dage. Når de levedygtige celler var kommet, blev de podet i medium indeholdende den senest eksponerede koncentration af lægemiddel igen i 3 dage. Efter gentagen flere cykler og når cellerne voksede op til 70% konfluens i dyrkningsmediet indeholdende lægemidler, vil koncentrationen af ​​stoffer øges til det næste niveau. Efter et år var den ET-743 resistent cellelinje CS-1 /ER og PM00104 resistent cellelinje CS-1 /PR etableret som bestemt ved MTT-assayet. Disse celler repræsenterer populationer af lægemiddelresistente celler snarere end en valgt klonet population. CS-1 /ER kan vokse i koncentrationer på 0,005 uM ET-743 og CS-1 /PR kan vokse op i koncentration på 0,01 uM PM00104.

Andre lægemiddelresistente cellelinje anvendt i denne undersøgelse

humanovarie cancercellelinier SKOV-3 og A2780 og en human brystcancer cellelinje MCF-7 blev indkøbt fra American Type Tissue Collection (Rockville, MD). Paclitaxel-resistente SKOV-3

TR, MCF-7

TR og cisplatin-resistente A2780cp cellelinier blev etableret som tidligere rapporteret [19], [20]. Dr. Katia. Scotlandi (Institut Orthopedics Rizzoli, Italien) billede Ewing sarkom ET-743 resistent cellelinje TC-ET [21].

Tissue kultur

Alle cellelinierne blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100-enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2-95% luftatmosfære og passeret når nær sammenflydende monolag blev opnået under anvendelse af trypsin-EDTA-opløsning. Lægemiddelresistente cellelinier blev periodisk dyrket i det respektive lægemiddel til at bekræfte deres lægemiddel-resistens egenskaber. Celler var gratis på forurening med mycoplasma som testet af MycoAlert (R) Mycoplasma Detection Kit fra Cambrex (Rockland, ME).

cytotoksicitet assay

Drug cytotoksicitet blev vurderet in vitro ved hjælp af MTT-analysen som tidligere beskrevet [22]. Kort fortalt, 2 × 10

3 celler per brønd blev udpladet i plader med 96 brønde i dyrkningsmedium (RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin) indeholdende stigende koncentrationer af lægemiddel. Efter 7 dages dyrkning, 10 pi MTT (5 mg /ml i PBS, opnået fra Sigma) blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 4 timer. Den resulterende formazan produkt blev opløst med syre-isopropanol, og absorbansen ved en bølgelængde på 490 nm (A

490) blev aflæst på en SPECTRAmax® Microplate spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Absorbansværdierne blev normaliseret ved at tildele værdien af ​​styreledningen i mediet uden lægemiddel til 1,0, og værdien af ​​den ikke cellekontrol til 0. Forsøg blev udført tre gange.

RNA-ekstraktion

Total RNA blev indsamlet fra CS-1 (parental cellelinje med passerede 4 gange), CS-1 /eR og CS-1 /PR (resistente datter cellelinjer med dyrket i et år) ved hjælp TRIzol® Reagent (GIBCO, Grand Island , NY) ifølge fabrikantens instruktioner. Redegøre for og fjerne biologisk støj, blev RNA isoleret fra tre forskellige kolber af hver cellelinie. Disse biologiske replikater blev samlet. RNA kvalitet blev bestemt

via

ethidiumbromidfarvning efter agarose /formaldehyd gelelektroforese.

Gene transskriptionsprofilering

Total RNA blev behandlet og hybridiseret til Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2,0 arrays (Santa Clara, CA) ved Gene Array Technology center på Harvard Medical School (https://genome.med.harvard.edu). Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 i den første og mest omfattende hele menneskelige genom udtryk array. Denne vifte fuldender dækning af hele menneskelige genom med over 47.000 udskrifter. Hver probe består af 20 separate 23-mer oligonucleotider. Ekspressionsniveauet af hvert mRNA kvantificeres ved at måle dets hybridisering til disse 23-mer i forhold til dens hybridisering til en en-base-fejlparring oligonukleotid.

Dataanalyse

GeneSifter blev anvendt til at analysere microarray data (https://www.genesifter.net/web/). GeneSifter giver kraftfulde analytiske algoritmer (RMA, PAM, ANOVA, Clara, Benjamini-Hochberg, etc.) via en intuitiv web interface. GeneSifter kan identificere differentielt udtrykte gener og klyngeanalyse til at identificere mønstre af genekspression og isolerer gener baseret på disse mønstre. Gange ændring i ekspression mellem følsomme og resistente cellelinier blev evalueret ved anvendelse af Mann-Whitney-test. En tifold eller større ændring i intensitet kombineret med en Mann-Whitney associeret P-værdi mindre end 0,05 blev anvendt som kriterium for medtagelse i vores filtrerede datasæt. Intensitet oplysninger blev eksporteret til Microsoft Excel efter behov.

TaqMan revers transkription-PCR til kvantificering af differentielt udtrykte gen

Real-time RT-PCR blev udført for at validere differentielt udtrykte gener. Til genekspression detektion blev cDNA revers transkription udført fra totalt RNA prøver under anvendelse af specifikke oligo dT-primere fra Taq Man RNA assays og reagenser fra TaqMan RNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Det resulterende cDNA blev amplificeret ved PCR under anvendelse af Taq Man zinkfingerprotein 93 (ZNF93), ZNF43 og Thada-assayet primere med Taq Man Universal PCR Master Mix og analyseret med et StepOnePlus Real time PCR System ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems) . GAPDH og actin blev anvendt som kontrol. De relative niveauer af genekspression blev beregnet ud fra de relevante signaler ved normalisering med signalet for GAPDH eller actin-ekspression. PCR reaktionsblandinger indeholdt Taq Man human ZNF93 eller ZNF43 og Thada og Universal PCR Master Mix i et samlet volumen på 20 AL. Cykling variabler var som følger: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C (15 S) og annealing /forlængelse ved 60 ° C (1 min). Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer

ZNF93 siRNA assay

For ZNF93 (GenBank nummer: NM_031218). Interferens, fornemmer ZNF93 oligo (5′-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 ‘) og antisense ZNF93 oligo ( 5’-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 ‘) blev erhvervet fra Applied Biosystems og anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger. For validering af ZNF93 RNAi specificitet blev siGenome SMARTpool Menneskelige ZNF93 siRNAs købt fra Dharmacon (Chicago, IL) med følgende fire mål sekvenser af ZNF93 gen. Målsekvens 1: 5’-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 ‘; målsekvens 2: 5’-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 ‘; målsekvens 3: 5′-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-3′ og målsekvensen 4: 5’-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 ‘. Til transfektion blev celler enten udpladet på 96-brønds plader for MTT-assays eller udpladet på retter til RNA-ekstraktion. Transfektioner blev udført med siPORT ™

NeoFX

™ siRNA transfektionsreagenser (Ambion. Inc, Austin, TX) som anvist af producenten. Lyddæmperen ™ EGFP siRNA (Ambion) og siRNA Control® reagens (Dharmacon) blev anvendt som positive og negative kontroller i alle eksperimenter. For ZNF93 inhibering, slutkoncentrationen af ​​siRNA var enten 25 nM eller 100 nM. Medium blev erstattet med RPMI1640 tilsat 10% FBS 24 timer efter transfektion. Totalt RNA blev isoleret efter 72 timers ZNF93 siRNA transfektion for Real-time RT-PCR bekræftelse.

pIRES

ZNF93 ekspressionsvektor bygge- og transfektion

En 1907 basepar cDNA fragment indeholdende fuld ORF af human ZNF93 blev amplificeret ved RT-PCR fra RNA fra CS-1 /PR cellelinie, som stærkt overudtrykker ZNF93. RT-PCR blev udført ved anvendelse af sense- og antisense-primere for menneskers ZNF93: sense primer 5′-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 ‘at indføre et Not I sted som understreget, og antisense-primer: 5′-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3’ (GenBank # NM_031218) til indføre et BamHI sted som understreget. De indførte restriktionsenzymsteder blev designet til efter transfektion studier. Clonetech s (Palo Atlo, CA) mammale ekspressionsvektor pIRESneo blev anvendt til funktionel ekspression undersøgelse. Den resulterende ZNF93 RT-PCR-produkt blev klonet i pCR®2.1 vektor under anvendelse Invitrogens Original TA Cloning Kit. Efter sekvensbekræftelse blev ZNF93 skåret fra pCR®2.1 vektor, oprenset, subklonet i MCS af ekspressionsvektoren pIRESneo, og efterfølgende sekventeret for at bekræfte den korrekte ORF. Ekspression af ZNF93 cDNA var under kontrol af den pCMV. Transfektioner blev udført under anvendelse af lipofectamin Plus reagenser (Invitrogen) som følger: ca. 5 × 10

5 CS-1-celler blev udpladet i 90 millimeter vævskulturskåle og dyrket natten over. Før transfektion blev vækstmediet udskiftet med serumfrit RPMI 1640 og dyrket i tre timer. Lipofectaminreagens indeholdende 5 ug pIRES

tom, pIRES

ZNF93 blev kombineret med Plus reagens og anvendt til cellerne. Efter dyrkning i fire timer blev mediet erstattet med RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum. G418 sulfat (Invitrogen) selektion (300 ug /ml) blev startet ved 24 timer efter transfektion. Udvælgelsen blev udskiftet hver 2. dag. Effekter af overekspression ZNF93 på ET-743 og PM00104 blev bestemt ved MTT cytotoksicitet assay.

Resultater

CS-1 /ER, CS-1 /PR cellelinjer er resistente over for flere kemoterapeutiske stoffer

CS-1 /ER og CS-1 /PR blev udvalgt fra forældrenes cellelinie, CS-1, ved udsættelse for trinvise stigninger i eT-743 eller PM00104 koncentrationer i en periode på et år. Lægemidlet resistens fænotype blev fundet at være stabil efter 14 måneders kontinuerlig kultur i lægemidler eller i mindst 6 måneder under stoffri betingelser. Ingen signifikant forskel mellem CS-1 og CS-1 /ER eller CS-1 /PR-celler blev observeret

in vitro

cellevækst (svarende fordoblingstid) og mikroskopisk morfologi. MTT cytotoksicitet analyse viser, at CS-1 /ER, CS-1 /PR er 10- 20 gange mere resistent over for ET-743 og PM00104 i forhold til den følsomme forælder cellelinjen. IC

50-værdi af ET-743 i CS-1-celler var 0. 0008 uM i sammenligning med 0. 01 pM i CS-1 /ER-celler (12,5-fold resistens). IC

50-værdi på PM00104 i CS-1-celler var 0. 002 pM sammenlignet med 0. 04 pM i CS-1 /PR-celler (20-fold resistens). Desuden CS-1 /ER og CS-1 /PR udviser resistens over for cisplatin og methotrexat men ikke til doxorubicin (fig. 1).

CS-1 /ER, CS-1 /PR og CS- 1-celler blev udsat for varierende koncentrationer af lægemidler i 6 dage. Vækstinhibering blev bestemt ved inkubering med tetrazoliumfarvestoffet MTT og ved absorbans måling ved 490 nm. Dataene afspejler tre gentagelser ved hver koncentration.

Et stort antal gener er forbundet med ET-743 og PM00104 modstand

Menneskelig Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2,0 arrays blev brugt til at undersøge relative RNA ekspressionsniveauer mellem CS-1, CS-1 /ER, og CS-1 /PR. Ekspressionsniveauerne profiler af disse tre chondrosarcoma cellelinjer blev evalueret ved Genesifter. Derudover har vi indsendt vores microarray data til Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), og disse array-data er blevet tildelt en GEO tiltrædelse nummer som GSE16748. Vi fandt et stort antal gener havde signifikant forskellige niveauer af ekspression i CS-1 /ER og CS-1 /PR sammenlignet med CS-1. At fokusere på gener med kun signifikante ændringer i ekspressionsniveauer, identificerede vi gener med en ti gange eller større forandring i ekspressionsniveauer. Brug dette kriterium, 595 (CS-1 /ER), 498 (CS-1 /PR) gener udstillet mere end ti gange overekspression i ET-743 og PM00104 resistente linjer i forhold til deres udtryk i de følsomme forældrenes linjer (fig. 2A). Desuden 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) transkripter var mere end ti gange mindre i de resistente cellelinier sammenlignet med kontroller (Fig. 2B). Ændringer i ekspressionsniveauer varierede fra 10- til 536- fold. Generne identificeret var stort set ikke-overlappende mellem cellelinier og kodet for proteiner med en lang række biokemiske funktioner. Generne identificeret koder for proteiner, der binder DNA har katalytiske aktiviteter, molekylære transducerelementer aktiviteter, regulere transkription, transportproteiner og molekyler, regulere enzymer og der er mange andre gener, som har begrænset karakterisering. De 20 mest overeksprimeres og underexpressed gener i hver af de resistente cellelinier er opsummeret i tabel 1. Der var syv gener overudtrykt i både CS-1 /ER og CS-1 /PR og et gen, der underexpressed i begge cellelinier. I disse to resistente cellelinier, der er mere overlappende gen i top 20 over udtrykt liste gener sammenlignet med under udtrykte gener listen. Vi bemærkede også graden af ​​ændring i genekspression var mere dramatisk i sættet af under udtrykte gener (tabel 1).

Gener overudtrykt /under udtrykkes i mere end én cellelinje er angivet i de overlappende områder af cirklerne.

Gener forskelligt udtrykt i både resistente cellelinier

fig. 2 Venn diagram viser, at 185 gener blev overudtrykt, 174 gener blev underexpressed i både CS-1 /ER og CS-1 /PR resistente cellelinier i sammenligning med CS-1 (fig. 2A og fig. 2B). De 20 mest overexpresssed gener i begge resistente cellelinier er opsummeret i tabel 2. Som 3 ud top 20 overecpressing gener i både CS-1 /ER, og CS-1 /PR resistente cellelinier er zinkfingerprotein gener (ZNF93, ZNF43 og ZNF568), besluttede vi at yderligere at validere disse gener ved real-time RT-PCR.

TaqMan real-time RT-PCR-analyse af differentielt udtrykte gener

for at validere array-data, udførte vi Real-Time RT-PCR af tre gener, der blev differentielt udtrykt i de to resistente cellelinier. ZNF93, ZNF43, og Thada RNA-ekspression blev målt ved TaqMan RNA assay kit. Differentiel ekspression af ZNF93 og ZNF43 blev bekræftet i begge CS-1 /ER og CS-1 /PR resistente cellelinier (fig. 3A, fig. 3B og fig. 3C). Thada overekspression blev ikke bekræftet i resistent cellelinje CS-1 /ER

A

(figur 3D.):. Forstærkning plot for β-actin gen.

B

: Forstærkning plot for ZNF93 gen.

C

: Relative ekspressionsniveauer af ZNF93 mRNA.

D

: Opsummering af relative ekspressionsniveauer af ZNF93, ZNF43 og Thada mRNA

Angivelse af ZNF93 i andre multiresistent cellelinjer

ZNF93 gen overudtrykt i begge. CS-1 /eR og CS-1 /PR-cellelinier og funktionen af ​​ZNF93 er uklart, selv om proteinet er blevet impliceret i den cellulære transkriptionel regulering. Som ZNF93 genet ikke tidligere har været forbundet med lægemiddelresistens og blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Vi evaluerede yderligere ekspressionen af ​​ZNF93 i andre multilægemiddelresistente cellelinjer ved real-time RT-PCR. Resultaterne viste, at ZNF93 overudtrykkes i to ET-743 resistent Ewing sarkom cellelinie, TC-ET, såvel som i en cisplatin resistente ovariecancer-cellelinje, A2780cp, sammenlignet med deres ET-743 eller cisplatin følsomme parentale cellelinier, men ZNF93 blev ikke overudtrykt i paclitaxel resistente cellelinier SKOV-3

TR og MCF-7

TR (fig. 4).

Alle real-time RT-PCR-data er blevet normaliseret for p actin.

Virkninger af hæmning af ZNF93 udtryk af siRNA på narkotika følsomheder

for at afgøre, om ZNF93 spiller en rolle i eT-743 og PM00104 følsomhed, vi hæmmede sit udtryk i CS -1 /PR celler under anvendelse siRNA knockdown. De relative drug følsomheder blev evalueret ved sammenligning af IC

50 værdier bestemt ved MTT i siRNA-behandlede, ikke-specifikke siRNA-behandlede og ikke-behandlede kontrol multilægemiddelresistente cellelinier. Først cytotoksicitet til ET-743 og PM00104 blev målt 4 dage efter transfektion af resistente celler med ZNF93 siRNA oligoer fra Applied Biosystems. Vi observerede, ZNF93 nedregulering nåede grad overvinde følsomheden til PM00104 (fig. 5A) i CS-1 /PR-cellelinien. Real time RT-PCR afslørede ZNF93 udtryk var faldt betydeligt efter de celler behandlet med siRNA (Fig. 5B). Lignende resultater blev fundet i lægemiddelresistent cellelinie CS-1 /ER (data ikke vist). Hertil kommer, for validering af ZNF93 RNAi specificitet blev siGenome SMARTpool Menneskelige ZNF93 siRNAs købt fra Dharmacon med de fire målsekvenser af ZNF93 genet og testet i cisplantin resistent cellelinje A2780cp. Udtrykket ZNF93 i siRNA transficerede A2780cp celler blev signifikant nedsat som evalueret af Real-Time RT-PCR (fig. 5D). MTT assay viste IC

50 værdier af siRNA behandlede A2780cp celler var lavere sammenlignet med de ubehandlede resistente linjer (fig. 5C), hvilket antyder, at ZNF93 siRNA inhiberer ZNF93 ekspression og delvist genskaber følsomheden af ​​resistente cellelinie til cisplatin .

A

: CS-1 /PR blev transficeret med ZNF93 siRNA * (Applied Biosystems) såvel som ikke-specifik siRNA.

C

: A2780cp blev transficeret med ZNF93 siRNA

† (Dharmacon) såvel som ikke-specifik siRNA. Den relative følsomhed hver behandling til PM00104 eller cisplatin blev bestemt ved MTT-analyse 72 timer efter transfektion.

B og D

: Bekræftelse af ZNF93 knockdown af real-time RT-PCR. Totalt RNA blev isoleret 72 timer efter transfektion og ZNF93 udtryk blev analyseret ved real-time RT-PCR.

Virkninger af overekspression af ZNF93 på ET-743, PM00104 og cisplatin følsomheder

Vores analyser af endogen ZNF93 udtryk viste, at ZNF93 ofte er opreguleret i ET-743, PM00104 og cisplatin flere lægemiddelresistente kræftceller, ZNF93 nedregulering af siRNA kunne delvist genvinde følsomhed over for ET-743, PM00104 og cispatin. Disse resultater tyder på, at ZNF93 protein kan være kritisk involveret i udviklingen af ​​resistens over for disse lægemidler. For yderligere at bestemme, om ZNF93 direkte deltager i oprettelsen af ​​den resistente fænotype, vi transficeret ET-743 og PM00104 sensitive cellelinje CS-1 med en ZNF93 ekspressionsvektor og genereret stabil cellelinie, som overudtrykker ZNF93 (figur 6D). Vi spurgte, om eksogen overekspression af ZNF93 var tilstrækkelig til at give øget ET-743 og PM00104 modstand. Resultaterne fra MTT-assayet i de transficeres cellelinier er vist i fig. 6. ZNF93 transficerede CS-1-celler er relativt resistente over for ET-743, PM00104 og cisplatin, mens der ikke blev observeret nogen signifikant ændring i modstanden i CS-1-celler transficeret med tom vektor (figur 6A til C). Forhøjet ZNF93 udtryk i de transfekteret celler blev bekræftet ved real-time RT-PCR (fig. 6D).

En

,

B

og

C

: Relativ cytotoksicitet af eT-743, PM00104 og cisplatin i CS-1 afledte cellelinier (CS-1 /pIRES

ZNF93) stabilt transficeret med en pIRES

ZNF93 ekspressionsvektor og i den parentale (CS-1) og tom vektor (CS-1 /pIRES) kontrol blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer.

D

:. Bekræftelse af ZNF93 overekspression i pIRES

ZNF93 transficeres CS-1 celler ved real-time RT-PCR, som beskrevet i Materialer og metoder

Diskussion

Resultater fra flere kliniske undersøgelser tyder på, at ET-743 har antitumoraktivitet mod adskillige cancertyper, herunder bløddelssarkomer, brystkræft og ovariecancer [2], [3]. Patienter med fremskreden ovariecancer og brystkræft samt knogle eller bløddelssarkomer typisk gennemgå flere linjer af anti-cancer regimer før til sidst bukker under for deres sygdom. Multilægemiddelresistens menes at spille en vigtig rolle i den uundgåelige svigt af tumorer til at reagere på hver successiv serie af kemoterapi. Derfor forstå de mønstre og mekanismer krydsresistens og finde måder at overvinde det er et vigtigt mål. Flere undersøgelser har undersøgt mekanismerne i ET-743 lægemiddelresistens med forskellige tilgange. Imidlertid har modstridende resultater er publiceret fra forskellige grupper, der forsøger at korrelere resistens over for forskellige ekspressionsniveauer af RNA’er og proteiner i resistente celler [9], [10], [13], [14], [21]. Yderligere opløsning af forskellene mellem disse resultater kan bedst fremmes ved genom-dækkende transkriptionel array analyse.

I denne undersøgelse rapporterer vi vellykket etablering af to chondrosarcoma cellelinier resistente over for ET-743 eller PM00104. Vi spurgte derefter, hvordan genekspressionsniveauer relateret til forskelle i lægemiddelresistens i disse to cellelinjer. Vi brugte Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2 for at undersøge genom-dækkende udtryk for RNA-transkripter. Sammenlignet med adskillige undersøgelser under anvendelse af mindre målestok gen array, dette array fuldstændig dækker hele det humane genom med over 47.000 transkripter. Vi valideret gen array-resultaterne for generne med de væsentligste ændringer med real-time RT-PCR. Som forventet er der en lang række transkriptionelle ændringer i forbindelse med

in vitro

erhvervet resistens til ET-743 og PM00104. Faktisk ca. 5% til 10% (med cut off værdi på 2 gange) af transkripter over-udtrykt eller under-udtrykt i de resistente cellelinier CS-1 /ER og CS-1 /PR sammenlignet med følsomme parentale celle linje.

på listen over de bedste 20 over at udtrykke gener for både CS-1 /ER og CS-1 /PR, de samme tre zink finger protein gener, ZNF93, ZNF43 og ZNF568 (tabel 2) blev alle identificeret. Disse gener er ikke tidligere blevet forbundet med resistens. Real-time PCR bekræftede ZNF93 og ZNF43 er konsekvent over til udtryk i disse resistente cellelinier (fig. 3). Foreløbig evaluering af ZNF93 bekræfter, at dets ekspression er forbundet med multiresistent fænotype i yderligere cellelinier.