PLoS ONE: A Novel Curcumin Analog (H-4073) Forbedrer den terapeutiske virkning af cisplatin Behandling i hoved- og halscancer

Abstrakt

Kemoterapi udgør standarden modalitet af behandling for lokaliseret hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC). Men mange patienter undlader at reagere og tilbagefald efter denne behandlinger på grund af købet af kemo-resistens. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye lægemidler, der kunne vende den resistente fænotype. Curcumin, komponenten af ​​krydderiet gurkemeje har vist sig at have anti-inflammatorisk, anti-oxidant og anti-proliferative egenskaber i flere tumortyper. Dog er brug af curcumin er blevet begrænset på grund af dens ringe bio-absorption. For nylig, en ny klasse af curcumin analoger, baseret på diarylidenylpiperidones (DAP), er blevet udviklet ved at inkorporere en piperidon link til beta-diketon struktur og fluor substitutioner på phenylgrupperne. I denne undersøgelse, vi evaluerede effektiviteten af ​​H-4073, en parafluorinated variant af DAP, bruge begge

in vitro

og

in vivo

hoved og hals kræft-modeller. Vores resultater viser, at H-4073 er ​​en potent antitumormiddel og det signifikant inhiberede celleproliferation i alle HNSCC celle testet på en dosis-afhængig måde linjer. Desuden forbehandling af cisplatin-resistente HNSCC cellelinier med H-4073 vendte markant kemo-resistens som observeret ved celleviabilitetstest (MTT), apoptose-assay (Annexin V-binding) og spaltes caspase-3 (Western blot). H-4073 medieret sine antitumorvirkninger ved at inhibere JAK /STAT3, FAK, Akt og VEGF signalveje, der spiller en vigtig rolle i celleproliferation, migration, overlevelse og angiogenese. I SCID mus xenograftmodellen, H-4073 væsentligt forbedret anti-tumor og anti-angiogenese virkninger af cisplatin, uden tilsat systemisk toksicitet. Interessant, H-4073 inhiberede tumor angiogenese ved at blokere VEGF produktion ved tumorceller samt direkte inhibering endotelcellefunktion. Tilsammen vores resultater tyder på, at H-4073 er ​​en potent antitumormiddel og det kan anvendes til at overvinde kemoterapi resistens i HNSCC Salg

Henvisning:. Kumar B, Yadav A, Hideg K, Kuppusamy P, Teknos TN, Kumar P (2014) A Novel Curcumin Analog (H-4073) Forbedrer den terapeutiske virkning af cisplatin Behandling i hoved- og halscancer. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10,1371 /journal.pone.0093208

Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: November 27, 2013; Accepteret: 28 Februar 2014; Udgivet: Marts 27, 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Institutes of Health (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), Joans Fund Research Grant (BK P. Kumar), Eksperimentel terapi frø tilskud fra The Ohio State University Comprehensive Cancer center (P. Kumar) Arthur G. James Cancer Hospital og Richard J. søløve Research Institute (TT, P. Kumar). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er en af ​​de mest udbredte cancer i hele verden med mere end 600.000 tilfælde diagnosticeres hvert år [1]. tobak brug og alkoholforbrug har været kendt for at være de stærkeste risikofaktorer for udvikling af denne sygdom [2]. Det er imidlertid nu erkendt, at humant papillomvirus (HPV) også kan spille en rolle i udviklingen af ​​en delmængde af hoved og hals kræft [3]. Det meste af HNSCC er diagnosticeret i fremskredne stadier, og resultatet af disse patienter er ofte dårlig [4]. Cisplatin er en af ​​de almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler til behandling af cancere hoved og hals [5]. Cisplatin er et uorganisk platin middel, der kan binde til DNA, induktion intrastrand og interstreng DNA-tværbindinger, samt DNA-protein-tværbindinger. Disse tværbindinger resulterer i apoptose og celle-vækstinhibering [6]. Men mange patienter udvikler resistens over for cisplatin behandling fører til behandlingssvigt [7]. Der er derfor behov for at udvikle nye terapeutiske strategier, der er mere effektive og har færre bivirkninger end for tiden anvendte behandlingsregimer.

signaltransducere og aktivatorer af transkription (stats) er en familie af signalproteiner, som er aktiveres af cytokiner og vækstfaktorer [8]. Til dato har 7 medlemmer af STAT familien blevet identificeret i pattedyr. I normale celler, få STAT-proteiner forbigående aktiveres ved phosphorylering og spille en rolle i cytokin og vækstfaktor-medierede responser som cellevækst, overlevelse og inflammation [9], [10], [11]. Imidlertid er det blevet observeret i adskillige undersøgelser, at STAT3 er konstitutivt aktiv i en række forskellige humane faste tumorer, herunder lungecancer [12], prostatacancer [13], brystcancer [14] og i mere end 95% af hoved- og halscancer [10]. Dysregulering og konstitutiv aktivering af STAT3 stimulerer cancercellevækst og bidrager til tumorudvikling og fremadskriden ved opregulering af STAT3 målgener herunder Bcl-2, c-myc, cyclin D1 og VEGF, som kan forbedre celleoverlevelse, proliferation og fremmer angiogenese [15] [16], [17]. Forøget STAT3 ekspression er blevet forbundet med dårlig prognose for patienter med gastrisk, colorektale cancere, cervical pladecellecarcinom og gliomer [18], [19], [20]. Desuden er der fundet STAT3 overekspression og signalering til at være forbundet med cisplatin modstand i HNSCC [21], [22]. Derfor har intense bestræbelser fokuseret på målretning STAT3 signalering anvende nye terapeutiske metoder, som kan inducere apoptose og sensibilisere tumorer for kemoterapi [23].

For nylig er en ny klasse af diarylidenylpiperidone (DAP) forbindelser er blevet syntetiseret ved inkorporering af et piperidon ring i beta-diketon rygraden struktur curcumin [24]. Disse forbindelser viste væsentlig højere anticanceraktivitet end curcumin i et ovariecancer model [25]. Det blev også konstateret, at disse forbindelser inhiberede aktiveringen af ​​STAT3. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere effekten af ​​en af ​​diarylidenylpiperidone (DAP) sammensatte, H-4073, enten som enkeltstof eller i kombination med cisplatin, både

in vitro

in vivo

. Vi viser, at H-4073, som et enkelt middel, var effektiv til at hæmme tumorcelleproliferation og inducere apoptose. Endvidere H-4073 medieret hæmning af STAT3, fokal adhæsionkinase (FAK), Akt og vaskulær endotelcellevækst (VEGF) signalveje og er i stand til at sensibilisere tumorceller over for virkningerne af cisplatin, hvilket resulterer i inhibering af migration og apoptose

In vitro

samt reduktion i tumor volumen

in vivo

. Vores data understøtter den terapeutiske anvendelse af H-4073 i kombination med cisplatin til behandling af hoved- og halskræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alt animalsk arbejde blev godkendt af Ohio State University IACUC Animal etik udvalg og udført i overensstemmelse med deres retningslinjer (Animal Welfare Assurance nummer A3261-01).

cellelinier og reagenser

UM-SCC-74A, UM- SCC-1, UM-SCC-74B, UM-SCC-38 og UM-SCC-47 blev opnået fra laboratoriet af Dr. Thomas E. Carey på University of Michigan [26]. CAL27 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Cisplatin resistente cellelinie (CAL27-CisR) blev dannet fra dets parentale CAL27 cellelinje (ATCC) som tidligere beskrevet [27]. Identiteten af ​​alle cellelinjer blev bekræftet af STR genotypning (AmpFlSTR Identifiler PCR-amplifikation Kit, Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Alle hoved og hals cancercellelinier dyrkedes i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin og 1% ikke-essentielle aminosyrer (Invitrogen). H-4073 blev syntetiseret som tidligere [24] beskrevne. Bestanden forbindelse blev frisk opløst i DMSO for

in vitro

arbejde. For

in vivo

arbejde, blev H-4073 blandet med foder (50 ppm dosis ved Harlan Tekland). Antistoffer mod pSTAT3 (Tyr705), Pakt (Ser473), pp38 (Thr180 /Tyr182), pErk1 /2 (Thr202 /Tyr204) og GAPDH blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og pFAK (Tyr397) antistof var fra Abcam ( Cambridge, MA). CD31-antistof var fra Dianova (Hamborg, Tyskland) og p21 antistof blev opnået fra Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, MA).

Cellular Optagelse

For at bestemme optagelsen af ​​H-4073 ved HNSCC celler

in vitro

blev UM-SCC-74A celler dyrket i 10 cm skåle og behandles with10 uM H-4073 eller 100 uM curcumin. Efter 1 times inkubering blev cellerne trypsiniseret, talt og vasket med PBS. Cellepelleten blev lov til at tørre, resuspenderet i methanol og sonikeret i 15 min. Sonikatet blev centrifugeret ved 10000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev fortyndet med et lige volumen af ​​methanol og målt med et UV /Vis spektrofotometer (λ = 328 nm, ε = 25000 M

-1 cm

-1).

celleproliferationsassay

følsomheden af ​​celler til cisplatin og H-4073 blev målt ved anvendelse af MTT-kolorimetrisk celleproliferation kit (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) [27]. Kort fortalt, 5000 celler /brønd blev udpladet i en plade med 96 brønde. Den næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af H-4073, cisplatin, eller en kombination af begge. Efter 72 timer, 10 pi /brønd af MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberes yderligere i 4 timer ved 37 ° C. Formazankrystallerne dannet i brøndene blev solubiliseret ved tilsætning af solubilisering opløsning og inkubering af pladerne ved 37 ° C natten over. Pladerne blev aflæst ved 590 nm på en Spectramax 190 pladelæser (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA). Den procentvise cellevækstinhibering for hver behandlingsgruppe blev beregnet ved at justere den ubehandlede kontrolgruppe til 100%. Data blev analyseret under anvendelse af GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) og dosisresponskurverne blev anvendt til at beregne koncentrationen af ​​H-4073 eller cisplatin resulterer i 50% inhibering af celleproliferation (IC50) under anvendelse af en fire parametrisk logistisk model. Alle forsøg blev gentaget mindst 3 gange

I kombinationsbehandlinger undersøgelser blev den synergistiske virkning vurderet af kombinationen index (CI) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Chou og Talalay, hvor synergisme er defineret som CI. 1, mens antagonisme er CI 1, og et additiv virkning anses som CI = 1 [28]. De Cl-værdier blev beregnet ved anvendelse CompuSyn software (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Kolonidannelse assay

Tumorceller blev udpladet i 6 cm skåle og behandlet med cisplatin, H-4073 eller en kombination af begge. Efter 48 timers behandling, 4 × 10

3 levedygtige celler fra hver gruppe blev udpladet i 6 cm skåle og dyrket i yderligere 10 dage. Kolonierne blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Der blev taget mikrofotografier, og antallet af kolonier blev talt ved Alpha Innotech billedbehandlingssoftware (San Leandro, CA).

Apoptose Assay

Celler blev udpladet i 6 cm skåle og behandlet i 24 timer. Cellekultursupernatanten og celler blev opsamlet 48 timer efter behandling. Celler blev farvet med Annexin V 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) og propidiumiodid (Sigma, St. Louis, MO) og analyseret ved flowcytometri [27].

immunblotting

cellelysater blev kørt på Novex Bis-Tris-gel (Invitrogen) under reducerende betingelser, blottet på PVDF-membraner (GE Healthcare Life Sciences /Amersham, Piscataway, NJ), probet med primære antistoffer, derefter skyllet og inkuberet med fåre-anti-muse eller æsel anti-kanin konjugeret med peberrodsperoxidase (GE Healthcare). Membranerne blev visualiseret ved hjælp af ECL Plus Kit (GE Healthcare).

Migration Assay

Effekten på cellemigration ved behandling blev målt ved hjælp af xCELLigence RTCA DP Instrument (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) [29]. Kort beskrevet blev celler dyrket i serum-frit medium i 24 timer. Den nederste kammer af CIM-pladen 16 blev fyldt med 160 pi komplet medium. Den nederste og øverste kamre blev klikket sammen. Serumfrit medium blev anbragt i det øverste kammer og inkuberet i 1 time i CO

2 inkubator ved 37 ° C. Celler blev trypsinbehandlet, pelleteret og resuspenderet så 80.000 celler blev tilsat til hver brønd i den øverste kammer i serumfrit medium indeholdende cisplatin, H-4073 eller en kombination af begge. CIM-Plate 16 blev placeret i RTCA DP station og migration blev overvåget i 24 timer.

In vivo studier

For anti-tumor effektstudier, nøgne athymiske mus med tumorxenoplantater blev brugt . Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne fra The Ohio State University Komité for brug og pasning af dyr. Tumorceller (1 × 10

6) blev blandet med 100 pi Matrigel og injiceret subkutant i flanken område af musene [30]. Efter 8 dage blev musene stratificeret i forskellige grupper (n = 5), således at det gennemsnitlige tumorvolumen i hver gruppe var sammenlignelige. Dyr blev behandlet med H-4073 ved at blande den med foder (50 ppm dosis, Harlan Teklad), startende på dag 8. Dyr blev behandlet med cisplatin (5 mg /kg) på dag 8, 11, 14, 17, 21, 24, og 28 via intraperitoneale injektioner. Tumorvolumen målinger [Mange (mm

3) = L × W

2/2 (længde L, mm, bredde W, mm)] begyndte på dag 6 og fortsatte to gange om ugen indtil forsøgets afslutning. Efter 30 dage blev primære tumorer omhyggeligt fjernet, fotograferet, og analyseret for pSTAT3, TUNEL-positive celler og tumor angiogenese.

Immunhistokemi

xenograft tumorvæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd natten over og paraffinindlejret. Vævssnit blev deparffinized, forbehandlet med antigen hentning buffer (EDTA, pH 8,0; pSTAT3) (Citrate, pH 6,0; CD31) [27]. Endogen peroxidase og ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret, og sektionerne blev inkuberet med pSTAT3 (Tyr 705) eller CD31. Det primære antistof-binding blev detekteret ved anvendelse af biotinyleret gede anti-kanin IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) eller biotinyleret gede-anti-rotte-IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). Objektglassene blev derefter inkuberet med avidin-biotin-kompleks (Vector Laboratories). Reaktionsstederne blev visualiseret under anvendelse 3,3′-diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Snittene blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret med Permount.

ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA) blev anvendt til at detektere apoptotiske celler ved terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning ( TUNEL) -farvning i xenograft tumorsnit ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev snit deparaffineret, rehydreret og inkuberet med proteinase K i 15 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket. Den endogene peroxidaseaktivitet blev standset, og efter vask blev snittene inkuberet med arbejde koncentration af terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) ved 37 ° C i 1 time. Snittene blev derefter vasket og inkuberet med anti-digoxigenin-konjugat (peroxidase) ved stuetemperatur. Signalet blev visualiseret med DAB som kromogen.

Statistical Analysis

Data fra alle forsøgene er udtrykt som middelværdi ± SEM fra mindst 3 uafhængige forsøg. Den statistiske signifikans af resultaterne blev evalueret ved to-vejs variansanalyse eller Students t-test (hvor det er relevant) og en p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant. IC

50 værdier for H-4073 og cisplatin til tumorcelleproliferation inhibering blev beregnet ved anvendelse af GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) og kombinationen (CI) blev beregnet ved anvendelse CompuSyn software (ComboSyn, Inc ., Paramus, NJ).

Resultater

H-4073 er ​​en potent hæmmer af HNSCC spredning

De væksthæmmende virkninger af cisplatin i et panel af HNSCC cellelinjer var evalueret ved anvendelse MTT assay. Som vist i fig. 1A, cisplatin behandling inhiberede væksten af ​​HNSCC cellelinjer på en dosisafhængig måde. Vi valgte to cellelinjer (CAL27-CisR og UM-SCC-74A), der var mest modstandsdygtige over for cisplatin til yderligere forsøg. UM-SCC-74A er pladecellecarcinom cellelinie afledt fra en basis af tungen tumor. Denne cellelinje blev plukket til at efterligne naturlige eller iboende cisplatin modstand. CAL27-CisR blev udvalgt ved dyrkning af den parentale tungen pladecellecarcinom cellelinje (CAL27) i stigende koncentrationer af cisplatin over en længere tidsperiode [27]. Denne cellelinje blev genereret til at efterligne erhvervet cisplatin resistente fænotype. Curcumin har været omfattende undersøgt for dets STAT3-inhiberende egenskaber og antitumor-aktivitet [31]. Men på grund af den dårlige biotilgængelighed og hurtig metabolisme, curcumin har ikke skiftet til klinikken. Derfor har vi udviklet et syntetisk analog af curcumin, H-4073 (fig. 1B). I vores undersøgelse, H-4073 (10 uM) viste 5 gange højere cellulær optagelse i en hoved- og halscancer cellelinie (UM-SCC-74A) sammenlignet med curcumin (100 pM, figur 1 C.). H-4073 var meget effektive til at inhibere celleproliferation af alle HNSCC cellelinjer der blev testet, uanset deres p53 status eller human papillomavirus status (HPV, figur 1D). I vores mekanistisk forsøg observerede vi en markant hæmning af STAT3, FAK og Akt phosphorylering af H-4073 behandling i en koncentrationsafhængig måde (fig. 1E). Desuden H-4073 behandling inducerede også aktiveringen af ​​p38 MAPK, en stress aktiveret kinase, der er kendt for at mediere celledød

A:. Salg HNSCC cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin (CDDP) og celleproliferation blev vurderet ved MTT-assayet.

B:

Kemiske strukturer af curcumin og H-4073.

C:

UM-SCC-74A-celler blev dyrket i 10-cm dyrkningsskåle og behandlet med curcumin eller H-4073 i 1 time. Cellulære optagelse af curcumin og H-4073 blev målt med et UV /Vis spektrofotometer.

D:

HNSCC cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af H-4073 og celleproliferation blev vurderet ved MTT-assayet.

E:

UM-SCC-74A-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af H-4073 i 2 timer. STAT3, FAK, Akt og p38 phosphorylering blev undersøgt ved Western blotting og lige protein belastning blev bekræftet ved stripning af blots og Fornyet probing med GAPDH antistof.

H-4073 synergistisk forbedret anti-tumor effekt af cisplatin i HNSCC celler

Vi næste undersøgt, om H-4073 behandling kunne vende cisplatin modstand i hoved- og halscancer celler og øge sin anti-tumor effekt i en synergistisk måde. Vi valgte to cisplatin-resistente cellelinier, UM-SCC-74A (naturligt cisplatin resistente) og CAL27-cis-R (genereret i vores laboratorium) for alle vores undersøgelser. Den anti-proliferative virkning af H-4073 og cisplatin (CDDP) kombinationsbehandlingen blev målt ved at beregne kombinationen (Cl) ifølge Chou-Talalay-fremgangsmåden [28] under anvendelse af en fast dosis-forhold. Både H-4073 og CDDP blev tilsat til tumoren cellekulturer ved 0,25 ×, 0,5 ×, 1 ×, 1,5 × og 2 × deres respektive IC

50 doser. Celleproliferation i både cellelinier blev markant nedsat efter kombinationsbehandling ved de multiple parrede koncentrationer sammenlignet med behandling med enten af ​​enkelte midler alene (fig. 2). Kombination (CI) for forskellige virksomme doser (ED) blev beregnet under anvendelse CompuSyn software. Cl-værdier for UM-SCC-74A-celler ved ED50, ED75 og ED90 var 0.550, 0.537 og 0,244 henholdsvis. CI værdier for CAL27-CisR celler 0,628, 0,606 og 0,507 ved ED50, ED75 og ED90, hhv. Disse resultater antyder, at H-4073 og cisplatin kombinationsbehandlingen var yderst effektive til at inhibere tumorcelleproliferation på en synergistisk måde i begge cisplatin resistente cellelinier

A og C:.

UM-SCC -74A

(

En

)

eller CAL27-CisR

(

C

)

celler behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombination ved 0,25, 0,5, 1, 1,5 og 2 gange deres respektive IC

50 doser og celleproliferation blev vurderet ved MTT-assayet. Resultaterne blev analyseret efter Chou-Talalay-metoden og kombinationen indeks (CI) værdier beregnet af CompuSyn software.

B og D:

Bar diagrammer, der viser celleproliferation resultater for UM-SCC-74A

(

B

)

CAL27-CisR

(

D

) dele på IC

50 doser H-4073 og cisplatin (CDDP). * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05). Sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper

Derefter undersøgte vi den virkning af H-4073 alene eller i kombination med cisplatin på tumorcellevækst kolonidannelse. Som observeret med celleproliferationsassay, en kombinationsbehandling med H-4073 og cisplatin ved deres respektive IC

50 doser inhiberede tumorcelle kolonidannelse på en synergistisk måde (93% i UM-SCC-74A og 92% i CAL27-CisR celler) (fig. 3A-C).

CAL27-CisR

(

A-B

)

eller UM-SCC-74a

(

C

)

celler blev behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombination i 48 timer. Fire tusinde levedygtige celler fra hver gruppe blev dyrket i yderligere 10 dage i 6-cm plader. Hvert assay blev fotograferet, og antallet af kolonier analyseres. * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05). Sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper

H-4073 inhiberede cellevandring og forbedret tumorcelle apoptose

Vi næste undersøgte virkningen af ​​H-4073 og cisplatin kombinationsbehandling på tumorcellemotilitet ved bunden assay. H-4073 og cisplatin-behandling alene viste 48% og 44% inhibering af UM-SCC-74A cellemotilitet og 46% og 42% inhibering af CAL27-CisR cellemotilitet, (fig. 4A-B). H-4073, når det kombineres med cisplatin viste signifikant højere inhibering af UM-SCC-74A og CAL27-CisR cellemotilitet (85% og 82%), henholdsvis. I næste sæt af eksperimenter undersøgte vi, hvis H-4073-medierede antitumorvirkninger medieres af apoptose. Faktisk H-4073 i kombination med cisplatin viste signifikant højere tumorcelle apoptose (Annexin V-farvning, Fig. 4C) sammenlignet med ubehandlede celler eller H-4073 og cisplatin-behandlede celler alene. Desuden kombinationsbehandling betydeligt hæmmet STAT3 aktivering og markant øgede niveauerne af aktiverede caspase 3 og p21 (figur 4D.)

A-B:.

Tumorcellemotilitet blev undersøgt ved bunden assay . Hvert assay blev fotograferet og afstande mellem de vandrende celle kanter blev kvantificeret og procentvise cellemigrering blev beregnet. * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper.

C-D:

UM-SCC-74A-celler blev behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombination. Efter 24 timer blev cellerne enten farvet med Annexin V og analyseret ved flowcytometri eller western blottet for pSTAT3, p21 eller spaltet caspase 3. Lige protein loading blev verificeret ved stripning blottene og Fornyet probing med GAPDH-antistof.

H-4073 væsentligt forbedret den terapeutiske virkning af cisplatin i cisplatin resistente hoved og hals kræft

Vores

in vitro

data antydede, at H-4073 vendte markant cisplatin modstand i hoved og hals kræft celler . Vi yderligere valideret vores

in vitro

resultater ved at bruge en atymiske, nøgne mus xenograftmodel. I det første sæt eksperimenter anvendte vi et naturligt resistente hoved- og halscancer cellelinie (UM-SCC-74A). H-4073 (50 ppm) og cisplatin (5 mg /kg) behandling alene viste 33% og 39% hæmning af tumorvækst på dag 30, (fig. 5A-B). H-4073 i kombination med cisplatin viste signifikant højere tumorvækstinhibering i sammenligning med ubehandlede gruppe (84%) eller enkelt middel alene (fig. 5A-B). Desuden blev kombinationsbehandlingen meget veltolereret, og det ikke forårsage nogen dyr toksicitet eller inducere signifikant fald i kropsvægt.

Dyr bærende UM-SCC-74A, CAL27 og CAL27-CisR blev behandlet med H -4073 (50 ppm) eller cisplatin (CDDP, 5 mg /kg) alene eller i kombination.

A:

Repræsentative mikrofotografier af UM-SCC-74A tumorer fra ubehandlede, cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073-behandlede grupper.

B:

Tumor vækstkurver for UM-SCC-74A tumorer behandlet med cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073.

C:

Tumor vækstkurver for CAL27 og CAL27-CisR tumorer behandlet med cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073. * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05). Sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper

I andet sæt eksperimenter anvendte vi cisplatin-resistente cellelinje (CAL27-CisR, IC

50 28 pmol /l) og dets parentale cisplatin-sensitive cellelinje (CAL27, IC

50 3 pmol /L). Som vi tidligere har vist [27], cisplatin behandling (5 mg /kg) af dyr, der bærer CAL27-CisR tumorer påvirkede ikke signifikant tumorvækst (9%) på dag 30, hvorimod cisplatin behandling af sine parentale celler (CAL27) markant nedsat tumorvækst (45%). H-4073 behandling i CAL27-CisR celler var signifikant mere effektiv til at reducere tumorbelastning (32%). H-4073 og cisplatin kombinationsbehandlingen var mest effektive til at hæmme tumorvækst i CAL27-CisR tumorer (77%, fig. 5C).

H-4073 og cisplatin kombinationsbehandling signifikant hæmmede STAT3 fosforylering

in vivo

og forbedret tumorcelle apoptose

i vores

in vitro

undersøgelse har vi observeret, at H-4073 er ​​en potent hæmmer af STAT3 phosphorylering. Vi næste undersøgt, om H-4073 behandling hæmmede SAT3 fosforylering

in vivo

. UM-SCC-74A tumorer fra mus xenograftmodel blev farvet med pSTAT3 antistof. H-4073 og cisplatin behandling inhiberede signifikant STAT3 phosphorylering (43% og 30%, henholdsvis). H-4073 og cisplatin kombinationsbehandlingen var mest effektive til inhibering STAT3 phosphorylering (94%) (fig. 6A-B). Tilsvarende H-4073 og cisplatin kombinationsbehandlingen var mest effektive til at inducere apoptose i tumorceller

A-D (Fig 6C-D.):.

Paraffin-embedded UM-SCC-74A tumorprøver blev farvet for pSTAT3 (Y705) og apoptotiske celler (Apop Tag kit).

A:

Repræsentative mikrofotografier af tumorprøver farvet for pSTAT3 fra ubehandlet, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombination grupper.

B:

pSTAT3 positive celler blev kvantificeret i 5 høj effekt felter (400 ×) af hver tumor prøver og procentdelen af ​​positive celler beregnet.

C:

Repræsentative mikrofotografier af tumorprøver farvet for apoptotiske celler fra ubehandlede, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombinationsgrupperne.

D:

TUNEL-positive celler blev kvantificeret i 5 høj effekt felter (400 ×) af hver tumor prøver og procentdelen af ​​positive celler beregnet. * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05). Sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper

H-4073 inhiberede tumor angiogenese ved nedregulering VEGF-sekretion fra tumorceller

en række undersøgelser har vist, at STAT3 er en vigtig regulator af angiogenese [16], [32]. Vi undersøgte næste hvis H-4073 og cisplatin kombinationsbehandlingen påvirket tumorangiogenese. H-4073 og cisplatin-behandling alene viste 24% og 31% inhibering af tumorangiogenese i UM-SCC-74A (fig. 7A-B), hvorimod H-4073 og cisplatin kombinationsbehandling udviste 62% inhibering af tumorangiogenese. Vi undersøgte dernæst, hvis H-4073 inhiberede tumor angiogenese ved at blokere VEGF produktion ved tumorceller. UM-SCC-74A-celler blev behandlet med H-4073 og VEGF-niveauer i kultursupernatanter blev målt ved ELISA. Ubehandlede UM-SCC-74A-celler producerede høje niveauer af VEGF (1121 pg /ml /10

6 celler, fig. 7C). H-4073 og cisplatin-behandling alene viste 36% og 55% inhibering af VEGF-niveauer. H-4073 og cisplatin kombinationsbehandling signifikant hæmmet produktion VEGF (83%). I det næste sæt af eksperimenter undersøgte vi, hvis H-4073 direkte kan påvirke angiogen funktion af endotelceller ved at hæmme VEGF-signalering. Vores resultater fra denne undersøgelse viser, at H-4073 markant inhibere VEGF-medieret ERK1 /2 og Akt phosphorylering (fig. 7D). Ud over at inhibere pro-overlevelse signalmolekyler (ERK1 /2 og Akt) H-4073 også aktiveret p38 MAPK (en pro-apoptotisk molekyle) på en dosisafhængig måde (fig. 7D).

A:

Repræsentative mikrofotografier af tumor blodkar farvning for ubehandlet, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombination grupper for UM-SCC-74A tumorer.

B:

mikrokar tæthed i tumorprøver blev beregnet ved at tælle 5 tilfældige felter (200 ×) og udtrykt som fartøj tæthed ± SE.

C:

UM-SCC-74A-celler blev behandlet med cisplatin eller H-4073 alene eller i kombination. Efter 72 timer blev kultursupernatanter opsamlet og analyseret for VEGF-niveauer. * Repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, repræsenterer en signifikant forskel (p 0,05) sammenlignet med enkelt behandlingsgrupper.

D:

Endotelceller blev behandlet med VEGF i nærværelse eller fravær af forskellige koncentrationer af H-4073 i 30 minutter. ERK1 /2 blev Akt og p38 phosphorylering undersøgt ved Western blotting og lige protein belastning blev bekræftet ved stripning af blots og Fornyet probing med GAPDH antistof.

Diskussion

Patienter med hoved og hals kræft omfatte en heterogen gruppe, og selv med avancement i behandlingsmuligheder, har den samlede overlevelse for patienter med fremskreden sygdom ikke ændret sig væsentligt i de seneste årtier [33]. Kirurgi efterfulgt af adjuverende strålebehandling har længe været anvendt i behandlingen af ​​patienter med HNSCC [34]. For nylig, er platin-baserede regimer bliver integreret i behandlingsmuligheder [35]. Men mange af de patienter udvikler resistens over for cisplatin, en af ​​de mest udbredte platin agent, hvilket fører til behandlingssvigt [21], [36]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye terapeutiske midler, som specifikt er rettet mod pro-overlevelse veje. Nylige undersøgelser har vist, at STAT3 konstitutivt aktiveres i tumorceller og overudtrykkes i cisplatin-resistente cellelinier [21], [37].