PLoS ONE: Molekylær karakterisering af Peripheral Airway Field of Cancerization i Lung Adenocarcinom

Abstrakte

Field of cancerization

i luftvejene epitel er blevet mere og mere undersøgt for at forstå tidlig patogenese af ikke-småcellet lungekræft. Imidlertid er omfanget af området cancerization hele lungeluftveje er uklar. Her søgte vi at bestemme forskellen genet og microRNA udtryk forbundet med området cancerization i de perifere luftveje epitelceller fra patienter med lunge-adenocarcinom. Vi opnåede perifere luftvejs tandbørstningerne fra smoker kontroller (n = 13) og fra lungen kontralaterale til tumoren hos cancerpatienter (n = 17). Vi udførte genet og microRNA ekspression profilering på disse perifere luftvejsepitelceller celler under anvendelse Affymetrix GeneChip og TaqMan Array. Integreret gen og microRNA analyse blev udført for at identificere væsentlige molekylære veje. Vi identificerede 26 mRNA og 5 miRNA, der var betydeligt (FDR 0,1) opreguleret og 38 mRNA og 12 miRNA, der var betydeligt nedreguleret i kræftpatienter i forhold til ryger kontroller. Funktionel analyse identificeret differentielle transkriptom udtryk relateret til tumorigenese. Integration af miRNA-mRNA data i interaktion netværk analyse viste modulering af den ekstracellulære signal-regulerede kinase /mitogenaktiveret proteinkinase (ERK /MAPK) pathway i den kontralaterale lunge området cancerization. Afslutningsvis patienter med lunge-adenocarcinom har tumor relaterede molekyler og veje i histologisk normalt udseende perifere luftvejsepitelceller, en væsentlig afstand fra selve tumoren. Dette resultat kan potentielt give nye biomarkører for tidlig påvisning af lungekræft og nye terapeutiske mål

Henvisning:. Tsay J-CJ, Li Z, Yie T-A, Wu F, Segal L, Greenberg AK, et al. (2015) Molekylær karakterisering af Perifer Airway Field of Cancerization i Lung Adenocarcinom. PLoS ONE 10 (2): e0118132. doi: 10,1371 /journal.pone.0118132

Academic Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANKRIG

Modtaget: 14. august 2014 Accepteret: 5 Januar 2015; Publiceret: 23 feb 2015

Copyright: © 2015 Tsay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data er tilgængelige fra GEO-databasen, tal tiltrædelse GSE54495, GSE54541 og GSE54543

Finansiering:. JJT er finansieret af National Institutes of Health tilskud T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038, og Stony-Wold Herbert Fund Fellowship (http: //www.stonywoldherbertfund.com). WNR er finansieret af National Institutes of Health tilskud T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038, RO1 HL090316 og K24 AI080298A. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden, forbliver de tidlige molekylære ændringer dårligt forstået, med mere forskning er nødvendig for at forbedre fase diagnose tidligt og øge overlevelsen. Den skuffende lav (15%) 5-års overlevelsesraten for lungekræft afspejler, at de fleste patienter til stede med fremskreden sygdom [1]. I modsætning hertil, når lungekræft påvises i fase I og kirurgisk resektion, 10-års overlevelse er så høj som 88% [2]. Decifrere de tidlige molekylære begivenheder i lunge tumorigenese har potentiale til at forbedre den kliniske behandling af lungekræft.

Udsættelse for miljøforurening, især cigaretrøg, radon, og asbest, er den største synder i at iværksætte og fremme lunge tumorigenesis . Udsættelse for disse forurenende stoffer og værten inflammatoriske reaktioner på de irriterende resulterer i en histologisk og molekylær inden for skade i hele det centrale og perifere luftveje [3]. Begrebet felt cancerization, først beskrevet af Slaughter et al. i 1953, henviser til områder af histologisk normalt epitel, der støder op til tumorvæv, men med en unormal molekylær profil svarende til den i selve tumoren [4]. I lungekræft, har undersøgelser vist, at tilstødende histologisk normale luftvejsepitelceller har mutationer i p53, KRAS, og EGFR-gener, afvigende promotor methylering, og allele tab [5-11]. Derudover har undersøgelser af microRNA (miRNA) og deres target messenger RNA-transkripter (mRNA’er), vist, at disse molekyler spiller en vigtig rolle i lungekræft initiering og progression [12-14]. Differentielt udtrykte miRNA i normale væv og lungekræft har vist sig at målrette proteinkodende tumorsuppressorer og onkogener [15,16]. Tilsvarende har genekspression profiler i den proksimale luftvejsepitel af individer med lungekræft forudsat indsigt i effekten af ​​lunge på cancerization [17].

Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at profilere de molekylære ændringer på området af cancerization, vides der kun lidt om dette felt effekt i det perifere luftveje og hvor langt “felt” strækker sig. Transkriptom undersøgelser af perifere luftveje af rygere og ikke-rygere har vist ændringer i gener, der koder for immunitet, apoptose, mucinproduktion og reaktion på oxidanter og miljøfremmede stoffer [18,19]. Da adenocarcinom typisk skyldes perifer luftveje eller alveolære epitelceller, specifikt Clara-celler og type II pneumocytter, bedre karakterisering af de molekylære afvigelser i disse terminal luftveje bronkoalveolære celler kan føre til en bedre forståelse af tidlige begivenheder i tumorigenese. Vi antager, at ved hjælp af høj-teknologi til at samtidigt profil miRNA og mRNA-ekspression af perifere luftveje epitelceller i højrisiko-rygere og lungekræftpatienter, kan vi først finde højere orden miRNA-mRNA interaktioner forbundet med området cancerization og tumorigenese; og for det andet, demonstrere effekten af ​​lunge på cancerization i den kontralaterale lunge af tumor.

Metoder

Patient Befolkning

Mellem april 2010 og Maj 2012, vi rekrutterede 30 forsøgspersoner (17 med lunge adenocarcinom og 13 ryger kontroller), og alle underskrevet informeret samtykke. Blandt deltagerne nuværende eller tidligere (quit 5 år) rygere ( 20 pack-år), alder 55-75 år, med mistænkelige knuder, der blev henvist til diagnostisk bronkoskopi ved New York University Langone Medical Center og Bellevue Hospital Center. Vi udelukkede dem med nogen tidligere historie af kræft. Sytten individer blev bekræftet at have diagnosen adenocarcinom efter bronkoskopi. Tretten forsøgspersoner blev klassificeret som kontrol rygere; herunder rygere med godartede knuder efter normal diagnostisk bronkoskopi og med mere end tre år stabilitet på CT-scanning; og normal ryger frivillige uden nogen lungeknuder. Protokollen blev godkendt af New York University Langone Medical Center Institutional Review Board (IRB) og forskningsudvalget Bellevue (BRC) i Bellevue Hospital Center.

Airway epitelcelle indsamling og RNA behandling

Gennem bronkoskopi, vi samlet perifere luftveje epitelceller ved at børste de små luftveje i lungerne kontralaterale til den mistænkelige knude, jeg. e. den upåvirkede lunge. I kontrollerne uden knuder blev tandbørstningerne indsamlet fra de perifere luftveje i lingula eller venstre nedre lap. Tilstedeværelsen af ​​Clara-celler på cytologi børste bekræftede prøvetagning af de små perifere luftveje (se S1 Fig i online supplement). Den cytologi børste blev spundet ned, og cellepelleten blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion.

microRNA og mRNA microarray

Vi ekstraheret totalt RNA under anvendelse af Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia , CA). For at identificere målgener blev global genekspression profilering udført med Affymetrix (Santa Clara, Californien) GeneChip Human Genome U133 Plus 2,0 Array (HG-U 133 Plus 2.0). Vi anvendte TaqMan Array Humant MicroRNA A Cards v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) at profilere miRNA på de samme RNA-prøver. Alle microarray data er blevet forelagt for Gene Expression Omnibus (GEO) under accessionsnummer GSE54495 (mRNA) og GSE54541 (miRNA).

Analyse af microarray mRNA og miRNA data

Affymetrix array-data var analyseret af GeneSpring GX-version 12.6.1 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, USA) ved hjælp af lineære modeller for Microarray data (LIMMA). MiRNA Taqman array-data normaliseret baseret på komparative CT repræsentation ved hjælp af den globale normalisering metoden. DAVID 6.7 blev anvendt til funktionel berigelse analyse af mRNA-data. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) blev anvendt til at vurdere overensstemmelse mellem vores data og

a priori

defineret sæt af gener. DIANA-mirPath [20] blev udført på miRNA TaqMan array-data for Kyoto Encyclopedia of Genes og genomer (Kegg) pathway analyse. Hierarkiske heatmaps blev genereret med komplet kobling klyngedannelse metode og kvadreret Euklidiske afstand foranstaltning. Opfindsomhed Pathway Analysis (IPA) blev anvendt til at identificere de vigtigste biologiske funktioner og sygdomstilstande /lidelser, og at generere veje reguleres fra integrerede mRNA-miRNA data (https://www.ingenuity.com). Mirna forudsagde mål for integreret analyse blev genereret baseret på Targetscan 6.2 (www.targetscan.org) eller Miranda (microRNA.org). (S2 Fig for overordnede studiedesign). Vi brugte support vektormaskine (SVM) at udvikle multivariate molekylære underskrifter fra lunge på cancerization fra differentielt udtrykte miRNA og mRNA efter leave-one-out krydsvalidering protokol.

kvantitativ real-time Reverse transskription PCR-analyse

Vi isoleret total RNA ved hjælp af Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia, CA) ifølge virksomheden protokollen, og udført kvantitativ real time-polymerasekædereaktion på fire mRNA (ASCL1, AMOTL2, CLCN3, og MAP3k8) og fire miRNA (miR-486-3p, miR-483-5p, miR-374a, og miRNA-375).

statistiske Metoder og grafer

Vi brugte GeneSpring og MATLAB (The MathWorks, Inc .) til at beregne LIMMA-værdi, studerende

t

-test

s

-værdi, Benjamini-Hochberg Falsk Discovery Rate (FDR) til justering af flere sammenligninger, og fold ændring (FC) for hver enkelt gen /miRNA probe. Sammenhæng mellem fænotype og miRNA /mRNA blev vurderet ved hjælp af både korrelationskoefficient og delvis korrelationskoefficient betinget af alder, køn og rygning status. Differential udtryk blev sammenlignet tidligt stadie I og II adenocarcinom vs. sent stadie III og IV adenocarcinom. Pearsons korrelation blev anvendt til beregning korrelation mellem RT-PCR og microarray platforme. Nummer-order-analyse blev anvendt til at sammenligne miRNA-mRNA korrelation. Areal under kurven blev genereret ved hjælp af Mann-Whitney U statistik teori.

(Se S1 Metoder til mere detaljeret beskrivelse)

Resultater

demografiske og kliniske karakteristika

af de 30 forsøgspersoner rekrutteret til denne undersøgelse, 17 blev diagnosticeret med lungeadenokarcinom efter indledende bronkoskopi og 13 blev bestemt til at være ryger kontrol, fri for lungekræft. De kliniske karakteristika for disse fag er vist i tabel 1. De fleste af forsøgspersonerne var mænd, kaukasiske og havde en signifikant rygevaner ( 30 pakke år), og de fleste kræftformer var stadie III-IV lungeadenokarcinom

genekspression i den perifere luftveje kontralaterale til tumoren

for at karakterisere forskelle i genekspression fundet på cancerization i lungecancerpatienter forhold til ryger kontroller, vi samlet perifere luftvejsepitelceller fra luftvejene fjernt fra tumoren,

jeg

.

e

. i den kontralaterale lunge, som vi kalder den kontralaterale perifere luftveje. RNA-prøver blev ekstraheret og kørt på en Affymetrix HG-U 133 Plus 2.0 chip. Efter justering for alder, køn og rygning status, brugte vi FDR korrektion på 0,10 som tærskel. 64 mRNA i kontralaterale perifere luftveje epitelceller viste sig at være udtrykt forskelligt mellem patienter med lungecancer og ryger kontroller (S1 tabel); de øverste 30 mRNA’er er vist i fig. 1A. Af disse 64 mRNA blev 38 mRNA nedreguleret i lungekræft patienter, hvoraf de øverste 5 mRNA var CHGB, B4GALT1, ZNF434, GLB1, og ASCL1 (

s

≤0.0001). Af de 26 mRNA, der var opreguleret, INSIG1, SGK223, RND3, TUFT1, DPYD, og ​​AMOTL2 var den mest betydningsfulde (

s

≤0.0001). Fig. 1B-C viser individuelle dot grunde til hver af de øverste 30 mRNA identificeret som signifikant forskellig mellem cases og kontroller. Disse resultater tyder på eventuelle forskelle i de underliggende biologiske processer.

A) Brug Affymetrix Gene Chip HG U133 Plus 2.0, Top 30 differentierede mRNA i perifert luftveje inden for cancerization af kræftpatienter (sort bjælke) vs. perifere luftveje af rygeren kontroller (grå bjælke) er vist. 13 mRNA’er blev kraftigt opreguleret og 17 mRNA’er var kraftigt nedreguleret i perifert luftveje inden for cancerization. Genekspression gange ændring er vist som middelværdien udtryk i forhold til en referenceværdi. nedenstående tabel viser FDR værdi base på Benjamini-Hochberg test og log2 fold ændring af kræftpatient i forhold til rygeren kontrol multiple. B) Individuel dot plot af kræftpatienter (n = 17) sammenlignet med rygere kontroller (n = 13) med op-regulerede mRNA. C) Individuel dot plot med ned-regulerede mRNA.

For yderligere at evaluere de biologiske processer, der forekommer i det perifere luftveje inden for cancerization, vi udførte DAVID Bioinformatik funktionel berigelse analyse fra ovenstående gen listen. Funktionel Annotation analyse (S2 Table) med en “medium” klassifikation stringens genereret en liste over biologiske processer, hvoraf de øverste vilkår inkluderet apoptose (fold berigelse = 3,9, p-værdi = 0,01), programmeret celledød (fold berigelse = 3,9, p -værdi = 0,01), disaccharid metaboliske proces (fold berigelse = 133,1, p-værdi = 0,01), celledød (fold berigelse = 3,3, p-værdi = 0,02), og celleproliferation (fold berigelse = 3,9, p-værdi = 0,04). Apoptose, programmeret celledød, og celledød gener inkluderet TNS4, BAD, AHR, B4GALT1, og PLG. Celledeling gener inkluderet Calca, TUSC2, ASCL1, INSIG1, og BAD. Disse differentielt udtrykte biologiske processer i den kontralaterale perifere luftveje, hvoraf mange er vigtige i tumorigenese, tyder på, at væv langt fra tumoren kan også have unormale molekylære udtryk. Udførte vi GSEA brug af offentligt tilgængelige datasæt. Vi identificerede overensstemmende forhold med 10 gen sæt (FDR 0,1) i C4 beregningsmæssige gen-apparater, kræft gen kvarterer indsamling af Broad Institute Molekylær Underskrifter Database (MSigDB). Disse gen-sæt er involveret i apoptose (MORF_DAP, MORF_CSNK2B, MORF_PHB), DNA-reparation (MORF_DDB1), og onkogener MYC (MORF_NME2) og RAS (MORF_RAN). (S3 Fig, S3 tabel). Vi identificerede også 14 gen sæt (FDR 0,1) i C4 beregnings gen-apparater, kræft moduler samling af MSigDB (flere detaljer i S4 tabel). Top 5 gen sæt er vist i S4 Fig. Både David og GSEA identificeret tilsvarende biologiske processer i det perifere luftveje inden for cancerization, hvoraf mange vedrører lungekræft patogenese.

Vi næste brugte kvantitativ RT-PCR for at bekræfte vores Affymetrix microarray resultater. Først har vi valideret to af de mest væsentligt ændret gener, ASCL1 og AMOTL2, i en delmængde af 20 forsøgspersoner (13 lungekræftpatienter og 7 kontroller). De forskellige genekspression påvisningsmetoder produceret lignende

p

-værdier og fold ændringer (Fig. 2A). ASCL1 blev signifikant reduceret i cancer sammenlignet med kontrol af 0,32-fold, p = 0,003 (RT-PCR) vs. 0,36 gange

s

= 0,0001 (Affymetrix microarray). AMOTL2 blev øget betydeligt i kræft i forhold til kontrollen med 1,2 gange,

s

= 0,006 (RT-PCR) vs. 1,7 gange,

s

= 0,0001 (Affymetrix microarray). Ligeledes anvendte vi RT-PCR for at evaluere ekspression af to andre tilfældigt udvalgte gener, CLCN3 og MAP3k8, og fundet gange ændring i samme størrelse og retning ved hjælp af de to metoder (fig. 2B). CLCN3 blev nedsat i kræft i forhold til kontrol af 0,80 gange,

s

= 0,09 (RT-PCR) vs. 0,84 gange,

s

= 0,01 (microarray). MAP3k8 blev øget i kræft i forhold til kontrol af 1,51 gange,

s

= 0,11 (RT-PCR) vs. 1,57 gange,

s

= 0,001 (microarray). Korrelationskurver mellem RT-PCR-data og microarray data for de enkelte fag er vist i S5 Fig.

A) To meget væsentlige differentielt udtrykte gener (ASCL1 og AMOTL2) påvist ved microarray i det perifere luftveje epitelceller af kræftpatienter sammenligne med rygere kontrol, blev bekræftet med RT-PCR, der producerer lignende p-værdi og fold forandring. B) To tilfældigt udvalgte gener (CLCN3 og MAP3k8) blev bekræftet med RT-PCR for at frembringe gange ændring i samme retning og med samme størrelsesorden som set med microarray. Genekspressioner blev udtrykt som middel ± standardafvigelser af midler. C-D) Tre opreguleret miRNA og en fjerde down-regulerede miRNA var vælges for RT-PCR til bekræftelse miRNA udtryk. miR-486-3p, miR-483-5p, og miR-374a var opreguleret og miR-375 blev nedreguleret i det perifere luftveje inden for cancerization i kræftpatienter lunge sammenlignet med rygere kontrol; fold skift mellem kræftpatienter og ryger kontrol var i samme retning. MiRNA udtryk blev udtrykt som midler og ± standardafvigelser af midler.

Det er interessant at bemærke, at når vi sammenlignet vores prøver baseret på tumor stadie, analyse af fase I /II (tidligt) vs. stadium III /IV (sen) ikke producere statistisk signifikante mRNA (FDR 0,1); hvilket antyder, at patogenesen af ​​området cancerization kan afvige fra det af tumormetastase. Det er muligt, at denne undersøgelse ikke kan drives til at analysere genekspression forskelle mellem tumor faser; Alternativt er det muligt, at nogen forskelle blev opdaget, fordi der ikke var nogen direkte metastaser til den kontralaterale lunge i vores fag.

MicroRNA udtryk i perifere Airways Kontralateral til Tumor

Vi brugte samme RNA-prøver ekstraheret fra den kontralaterale perifere luftveje epitelceller af patienter med lungecancer og ryger kontrol for at profilere miRNA udtryk ved hjælp TaqMan Array Menneskelig MicroRNA A Cards v2.0. Justeret for alder, køn og rygning status, og ved hjælp FDR 0,1 filter, blev fundet 17 miRNA skal differentielt udtrykte (fig. 3A). Af disse 17 miRNA (S5 tabel), 12 miRNA var nedreguleret i patienter med lungecancer; MIR-224, MIR-708, MIR-221, og MIR-328 var den mest betydningsfulde. Af de 5 miRNA, der var opreguleret i tilfælde med lungekræft, miR-483-5p, miR-374a, og miR-486-3p var den mest betydningsfulde. Fig. 3B-C viser individuelle dot grunde til hver af de 17 miRNA. Forskelle i miRNA udtryk mellem kræftpatienter og ryger kontroller tyder på, at modulation af miRNA kan aktivere biologiske veje vedrørende tumorigensis

A) Brug TaqMan miRNA Array, 5 miRNA var meget (FDR. 0,1) opreguleret i perifere luftveje inden for cancerization af kræftpatienter (sort bjælke) vs. perifere luftveje af ryger kontrol (grå bar). 12 miRNA (FDR 0,1) var stærkt nedreguleret. MiRNA gange ændring er vist som den gennemsnitlige ekspression i forhold til en referenceværdi. nedenstående tabel viser FDR værdi base på Benjamini-Hochberg test og log2 fold ændring af kræftpatient i forhold til rygeren kontrol multiple. B) Individuel dot plot af kræftpatienter (n = 17) i forhold til perifere luftveje af ryger kontroller (n = 13) med op-regulerede miRNA. C) Individuel dot plot med ned-regulerede miRNA.

For at udforske de biologiske veje, der kan være reguleret af disse miRNA, vi udførte en Kegg pathway klassificering analyse ved hjælp af DIANA-mirPath [20] med microT -CDS forudsigelse. MicroT-CDS forudsigelse identificeret de fem mest betydningsfulde Kegg veje: ErbB signalvejen (p = 2.3×10

-26, 14 miRNA), prostatakræft (p = 2.3×10-26, 14 miRNA), TGF-beta signalvejen (p = 2.1×10

-25, 13 miRNA), mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalveje (p = 6.2×10

-49, 24 miRNA), og veje i kræft (p = 5.1×10

-21, 16 miRNA) (S6 fig). Interessant fleste Kegg veje skyldes fire miRNA: miR-374a, miR-26a, miR-27b, og miR-320a. Modulation af kræftrelaterede veje støtter tilstedeværelsen af ​​området cancerization på miRNA-niveau i de kontralaterale perifere luftveje epitelceller.

For at validere vores microarray resultater, vi tilfældigt udvalgte fire miRNA at kvantificere ved kvantitativ RT-PCR og sammenlignet med kvantificering af miRNA ved TaqMan-array i en undergruppe på 19 patienter (12 lungekræftpatienter og 7 kontroller). De op-regulerede miRNA inkluderet: miR-486-3p, med 2,9 fold ændring (

s

= 0,034) ved RT-PCR vs. 4,8 fold ændring (

s

= 0,001) ved TaqMan matrix; miR-483-5p, med 2,5 gange ændring (

s

= 0,014) ved RT-PCR vs. 4,1 fold ændring (

s

0,0001) ved TaqMan vifte; og MIR-374a, med 1,3 gange ændring (

s

= 0.24) ved RT-PCR vs. 1,9 gange ændring (

s

= 0,001) ved TaqMan array (Fig. 2C-D) . MiRNA-375 blev nedreguleret, med 0,8 fold ændring (

s

= 0,21) ved RT-PCR vs. 0,3 fold ændring (

s

= 0,002) ved TaqMan array. Korrelationskurver mellem RT-PCR-data og TaqMan array-data for de enkelte fag er vist i S7 Fig. Vigtigt er det, forskelle i miRNA ekspression var i samme retning for de to metoder. Men størrelsen af ​​forskellen mellem cases og kontroller var større for de TaqMan array-data.

Integreret mRNA og miRNA-analyse identificeret ERK /MAPK Pathway

For yderligere at udforske de veje, der er forbundet med identificerede ændringer i uengagerede perifere luftveje epitelceller fra kræftpatienter vs. ryger kontrol, integreret vi differentielt udtrykte miRNA-data med de negativt korrelerede forudsagt mRNA-mål fra disse 30 patienter til analyse. Antages større statistisk styrke ved at integrere miRNA og mRNA data, valgt vi negativt korreleret miRNA og mRNA med FDR 0,15. I alt 24 miRNA og 67 mRNA’er sonder blev udvalgt efter filter, der producerer 102 miRNA-mRNA parringer (S6 tabel). Brug IPA-programmet analyse identificerede vi de øverste biologiske funktioner af disse miRNA-mRNA parringer som indblandet i cellulære udvikling (

s

= 7.8×10

-8, 38 molekyler), cellulær vækst og proliferation (

s

= 2.5×10

-7, 43 molekyler), celledød og overlevelse (

s

= 1.1×10

-6, 44 molekyler), cellulær bevægelse (

p

= 3.1×10

-5, 31 molekyler), og cellecyklus (

s

= 2.6×10

-5, 19 molekyler). IPA netværk generation identificeret, at størstedelen af ​​disse mRNA og miRNA (54 molekyler) blev netværk til det ekstracellulære signal-regulerede kinase /mitogenaktiveret proteinkinase (ERK /MAPK) pathway (fig. 4), som repræsenterer en komposit af fusionerende 3 top interaktion netværk baseret på “netværk score”. Denne højere ordens analyse var i stand til at identificere en tidligere kendt onkogen signalvej, MAPK, i det perifere luftveje inden for cancerization, tyder på, at interaktionen mellem mRNA og miRNA kan være vigtige i forbindelse med cancerization .

IPA blev anvendt til at generere et netværk af molekyler fra mRNA og miRNA, der var signifikant forskellige i perifert luftveje inden for cancerization i lungekræft patienter sammenlignet med ryger kontroller. Denne sammensatte netværk fusionere tre øverste netværk baseret på “netværk score”, som konvergerer på ERK /MAPK-vejen: specifikt fletning på Ekstracellulære signal-relaterede kinaser 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminale kinaser (JNK’erne) og p38-kinaser underfamilien. Rød er opreguleret og grøn nedreguleres.

miRNA og mRNA-ekspression korrelation identificerer miR-374a og ASCL1 interaktion

For yderligere at karakterisere miRNA-mRNA interaktion i det perifere luftveje inden for cancerization, vi udforskede specifikke miRNA-mRNA fodboldmesterskaber. VOSA og kolleger identificeret miR-374a som prognostisk biomarkør i tidligt stadie ikke-småcellet lungecancer [21]. Vi identificerede også miR-374a som et differentielt udtrykt miRNA i det perifere luftveje på cancerization; dets ekspression blev øget i patienter med lungecancer sammenlignet med smoker kontroller (Fig. 3). Ved hjælp af en offentligt tilgængelig miRNA target forudsigelse program, Miranda, vi søgte efter mulige mål for miR-374. En af de forudsagte mål, ASCL1, et gen medlem af de grundlæggende helix-loop-helix familie transkriptionsfaktorer, blev også identificeret i vores undersøgelse som differentielt udtrykt. Kvantitativ RT-PCR bekræftede vores microarray resultater (Pearsons korrelation = 0,47, p = 0,04) (S7 Fig). Når vi korreleret den miR-374a og ASCL1 kvantitative RT-PCR-udtryk i hvert enkelt, fandt vi en signifikant negativ korrelation (p = 0,013), som forventet med miRNA-mRNA parringer (fig. 5.) Mens der er betydelig litteratur der beskriver funktion af ASCL1, lidt om miR-374a. Vi ved, at ASCL1 er vigtig i pulmonal neuroendokrine celleudvikling, lungelæsion reparation, luftvejs dysplasi, og neuroendokrine differentieret lungekræft patogenese [22-24]. Der er tegn på, at lav MIR-374a ekspressionsniveau i ikke-småcellet lungecancer er associeret med ringe overlevelse, hvilket tyder det kan have tumor undertrykkende virkning. Vi hypotesen, at MIR-374a op reguleres inden for cancerization, og til gengæld nedregulerer ASCL1 transskriptionsfaktor, som kan repræsentere en reaktion af epitelceller af tilstedeværelsen af ​​tumor i lungen; muligt modvirke og /eller forebyggelse af tumormetastase. Det ville være vigtigt at udforske yderligere den mekanisme, hvormed denne interaktion påvirker tumor invasion.

Kvantitativ RT-PCR for miR-374a og ASCL1 blev udført i den enkeltes perifere luftveje epitelceller (n = 17 kræftpatient og n = 13 smoker kontroller) for at bekræfte miRNA-mRNA negativ korrelation i array’et. Vi bekræfter, at ASCL1 udtryk negativt var korreleret med miRNA-374a udtryk i perifere luftveje epitelceller (Pearsons = -0,56, p = 0,013).

Molekylære Signaturer i Lung Field of Cancerization

for at undersøge, om differentielt udtrykte mRNA og miRNA i kontralaterale perifere luftveje epitelceller kunne bruges til at differentiere vores kræftpatienter fra kræft-fri rygere, vi udviklede molekylære signaturer fra mRNA og miRNA data ved hjælp af support vektormaskine (SVM) efter orloven one-out cross-validering (LOOCV) protokol. Hvornår blev anvendt SVMs til differentielt udtrykt mRNA (FDR 0,15 og