PLoS ONE: A Novel High Content Imaging-baseret skærm Identificerer Anti-helminthiske niclosamid som en hæmmer af lysosomer Anterograd menneskehandel og prostatakræft Cell Invasion

Abstrakt

lysosomet menneskehandel spiller en væsentlig rolle i tumor invasion, en vigtig begivenhed for udviklingen af ​​metastaser. Tidligere undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at anterograd (udadgående) bevægelse af lysosomer til celleoverfladen som respons på visse tumor mikromiljø stimulus, såsom hepatocytvækstfaktor (HGF) eller sur ekstracellulære pH (Phe), øger cathepsin B sekretion og tumor celleinvasion. Anterograd lysosomer handel afhænger af natrium-proton veksler aktivitet og kan vendes ved at blokere disse ion pumper med Troglitazon eller EIPA. Da disse lægemidler ikke kan fremføres i klinikken på grund af toksicitet, har vi designet en højinformativ assay at opdage lægemidler, der blokerer perifer lysosomer handel med det mål at identificere hidtil ukendte lægemidler, der hæmmer tumorcelleinvasion. En automatiseret højinformativ billeddannende system (Cellomics) blev anvendt til at måle positionen af ​​lysosomer i forhold til kernen. Blandt i alt 2210 repurposed og naturlig produkt narkotika screenet, blev identificeret 18 “hits”. En af forbindelserne identificeret som en anterograd lysosom trafficking inhibitor var niclosamid, et markedsført humant anti-indvoldsorm lægemiddel. Yderligere undersøgelser afslørede, at niclosamid blokeret sure Phe, HGF, og epidermal vækstfaktor (EGF) -induceret anterograd lysosom omfordeling, protease sekretion, motilitet, og invasion af DU145 kastrere resistente prostatacancerceller ved klinisk relevante koncentrationer. I et forsøg på at identificere den mekanisme, ved hvilken niclosamid forhindret anterograd lysosom bevægelse, fandt vi, at dette stof udviste ingen signifikant effekt på niveauet af ATP, mikrotubuli eller actinfilamenter, og havde minimal virkning på PI3K og MAPK pathways. Niclosamid kollapsede intralysosomal pH uden afbrydelse af lysosomet membranen, mens bafilomycin, et middel, der forringer lysosom forsuring, viste sig også at inducere JLA i vores model. Taget sammen antyder disse data at niclosamid fremmer juxtanuclear lysosom aggregering (JLA) via modulering af involverede veje i lysosom forsuring. Afslutningsvis har vi designet en valideret reproducerbar højt indhold assay til at screene for lægemidler, der hæmmer lysosom handel og reducere tumor invasion og vi opsummere virkningen af ​​et af disse stoffer

Henvisning:. Kredsløb; ML, Dykes SS, Carroll J, Kelly K, Galiano F, Greer A, et al. (2016) A Novel High Content Imaging-baseret skærm Identificerer Anti-helminthiske niclosamid som en hæmmer af lysosomer Anterograd menneskehandel og prostatakræft Cell Invasion. PLoS ONE 11 (1): e0146931. doi: 10,1371 /journal.pone.0146931

Redaktør: Sidney Yu, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juli 20, 2015; Accepteret: December 23, 2015; Udgivet: Januar 19, 2016

Copyright: © 2016 kredsløb; et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. Denne forskning blev finansieret dels ved tilskud fra Pfizer, og midler fra Feist-Weiller Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt

Forkortelser: ( EGF), epidermal vækstfaktor; (HGF), hepatocytvækstfaktor; (Phe), ekstracellulær pH; (JLA), Juxtanuclear lysosomer sammenlægning; (LMP), lysosom membranpermeabilisering; (ECM), ekstracellulær matrix; (RILP), Rab interagerende lysosomalt protein; (Tro), Troglitazon; (EIPA), 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -amiloride; (LAMP1), lysosomer associeret membranprotein-1; (MAPK), mitogenaktiveret proteinkinase

Introduktion

Lysosomer er multifunktionelle intracellulære organeller der indeholder hydrolytiske enzymer, der nedbryder makromolekyler og cellulære komponenter [1]. Lysosomer blev klassisk tænkt til kun at fungere i cellulære husholdning, men nye oplysninger tyder på, at disse organeller også bidrage til patologi mange klinisk relevante sygdomme, herunder maligniteter. Lysosomer er involveret i tumorigenese gennem mange forskellige mekanismer, herunder dysreguleret autophagy, afvigende lysosomale menneskehandel og exocytose, og øget lysosomer membranpermeabilisering (LMP) [2,3]. På grund af den brede vifte af lysosomer-medierede funktioner, som spiller en rolle i tumor overlevelse, er lysosomer nylig vundet opmærksomhed som et attraktivt mål for kræftmedicin.

Dannelse af metastatiske kolonier som følge af en invasiv primær tumor er hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald. Desværre er der ingen tilgængelige lægemidler, der hæmmer denne proces. Derfor er et presserende behov øget forståelse af invasion med henblik på at udvikle effektive behandlingsformer til at forhindre tumor progression. Vores tidligere undersøgelser viser, at lysosom handel spiller en vigtig rolle i reguleringen cancercelleinvasion, hvorved tumorceller med lysosomer ligger tæt på plasmamembranen udskille mere proteaser og er mere invasiv end celler med lysosomer grupperet i perinukleære region [4-7]. Især har vi vist, at flere fælles træk ved den faste tumor mikromiljø, hepatisk (HGF), og sure ekstracellulære (Phe) trigger lysosomer udadgående bevægelse, ledsaget af øget cathepsin B sekretion og tumorceller invasion.

faktisk cathepsin B er en lysosomal cysteinprotease, der spiller en rolle i protein turnover inden lysosomer [8]. I maligne celler, ekspression af cathepsin B er stærkt op reguleret i forhold til normalt væv, og enzymet kan findes inden actin rige invasive fremspring betegnet invadopodia [9,10]. Beviser støtter den opfattelse, at lysosomale proteaser, herunder cathepsin B, secerneres i det ekstracellulære miljø, hvor disse proteaser deltager i nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix (ECM), en nødvendig begivenhed i cancercelleinvasion [9,10].

Lysosomer flytte langs mikrotubuli og actinfilamenter via association med molekylære motor proteiner, herunder dyneins, kinesin og myosin [11-13]. Desuden flere GTPaser herunder RhoA, Rab7, og Rab27 rekruttere motoriske proteiner til lysosomer, hvilket giver en streng regulering af lysosom motilitet hele cellen [14-16]. Især minus-ende-rettet bevægelse af lysosomer langs mikrotubuli er afhængig Rab7 og Rab interagerende lysosomalt protein (RILP), som rekrutterer dynein motorer til lysosomer og fremmer retrograd transport [12]. I denne henseende inhibering anterograd lysosom handel ved overekspression af RILP resulterer i reducerede niveauer af secerneret cathepsin B og tumorcelleinvasion [4]. Interessant Troglitazon (Tro) og 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -amiloride (EIPA), natrium proton veksler inhibitorer, fremme retrograd handel med perifere lysosomer i prostatacancerceller, hvilket resulterer i reduceret protease sekretion og tumorcelleinvasion [ ,,,0],4]. EIPA og Tro-medieret juxtanuclear lysosomer sammenlægning (JLA) er Rab7 /RILP afhængige.

En anden faktor, der kan bidrage til lysosom menneskehandel er vacuolær typen proton-ATPase pumpen (V-ATPase). Dette store enzymatisk kompleks omdanner energien af ​​ATP-hydrolyse ind i bevægelsen af ​​protoner tværs lysosomale membran. Ud over at generere lysosomal syrning, er V-ATPase også impliceret i andre cellulære funktioner, herunder vesikulær handel. Faktisk har c-underenheden blevet vist at interagere med Arf6, en lille GTPase, der dirigerer membran handel og cytoskeletale dynamik [17]. I osteoklaster, ATP6AP1 (en underenhed af V-ATPase også kendt som Ac45) vekselvirker med lille GTPase Rab7, som regulerer vesikulær handel [18]. A-subunit isoformen menes også at være afgørende i vesikulær menneskehandel [19].

Som tidligere karakteriserede hæmmere af anterograd lysosomer menneskehandel, såsom Tro og EIPA ikke kan fremføres i den kliniske arena [20], vi søgt at identificere yderligere nye repurposed og naturprodukt forbindelser hvoraf mange allerede er i klinisk brug til ikke-cancer indikationer. Vores mål var at identificere nye inhibitorer af anterograd lysosomer handel med en god sikkerhedsprofil. Dette repræsenterer en ny tilgang i translationel kræftforskning, der potentielt kan opdage ny effektiv anti-invasion og anti-metastatiske lægemidler.

I dette manuskript, vi præsentere resultaterne af en skærm på 4 biblioteker af forbindelser, hvoraf nogle er allerede markedsføres til ikke-kræftindikationer, udnytte en ny højt indhold tilgang, der kombinerer fluorescens mikroskopi og multi-parameter billedanalyse. Vi identificerede en række lægemidler, der hæmmer anterograd lysosomer menneskehandel, herunder niclosamid. Niclosamid (C13H8Cl2N2O4, MW 327) er en FDA-godkendt oral anti-helminthiske agent, bredt tilgængelige uden for USA til behandling af intestinale bændelorm. Det er billigt, generelt veltolereret og forbundet med få bivirkninger [21]. Niclosamid udøver sin toksiske virkning mod indvoldsorm ved frakobling oxidativ phosphorylering [22,23], og er sidst blevet vist at besidde en lovende virkning mod cancer. I denne rapport, undersøgte vi niclosamid virkningsmekanisme og effekt på lysosomer protease sekretion, cancer celle motilitet, og invasion.

Materiale og metoder

cellelinjer og kultur

human cellelinie prostatacancer DU145 og human glioma cellelinie A172 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). DU145 celler blev holdt i RPMI-1640 (Mediatech, Corning, NY) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. A172 gliomcellelinier blev opretholdt i Dulbeco Modified Eagles Medium (DMEM) (Mediatech) suppleret med 10% FBS. Begge cellelinier blev opretholdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og blev passeret ved opnåelse mere end 75% konfluens. Buffered RPMI-1640 blev fremstillet af RPMI-1640 pulver suppleret med 10 mM NaHCO

3 og 20 mM NaCl og justeret til Phe 6.4.

Højt indhold skærm for inhibitorer af perifer lysosomer handel

DU145 celler blev podet i 96-brønds plader ved 4.500 celler pr. RPMI bufret medier titreret ved pH på 6,4-6,8 blev sat til kolonne 12, når mediet blev fjernet, og tjener som negativ kontrol. Forbindelser, der skal screenes blev tilsat til kolonne 2-11 efter fortynding i lav pH pufret medium ved en slutkoncentration på 5um. De 4 sammensatte biblioteker indgår i den aktuelle skærm omfatter NIH Clinical Collection (450 stoffer), Prestwick (1200 narkotika), fytokemiske (320 narkotika) og GreenPharma (240 stoffer). 25 uM EIPA tjente som en positiv kontrol. Efter en 16 timers inkubation blev cellerne fikseret med 4% koldt paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 20 minutter. Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter lysosomer blev farvet ved inkubation med H4A3 LAMP-1 antistof fortyndet til 1: 200 i 0,25% BSA og 0,1% saponin i PBS (BSP) i 1 time. Celler blev derefter vasket med PBS 3 gange og inkuberet i 1 time med Dylight Donkey anti-mus fortyndet ved 1: 200 i BSP. Celler blev derefter vasket med PBS 3 gange og inkuberet i 20 minutter med DAPI (Sigma-Aldrich) fortyndet ved 1: 1000 i PBS. DAPI blev vasket af med PBS og celler blev holdt i PBS for varigheden af ​​screeningsprocessen. Plader blev monteret og læse i en Cellomics Arrayscan (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) automatiseret fluorescens imager (Fig 1A). Celler blev fotograferet under anvendelse af 20X objektiv i 2 fluorescerende kanaler. I alt 15 forskellige felter i hver brønd, og maksimalt 300 celler blev afbildet per brønd. Den biocompartmental analyse algoritme blev anvendt til at identificere hver celle ved sin kerne og at anvende en cytoplasmatisk maske (ring) og beregne antallet af lysosomer inde i ringen. Ringen var af 12 pixels bredde, og dens indre rand var 6 pixels væk fra kernen. Det gennemsnitlige antal lysosomer inde i udpegede ring regionen blev erhvervet som “betyder ring spot tæller kanal 3”, som repræsenterer fordelingen af ​​lysosomer i forhold til kernen. Når lysosomer bevæge sig væk fra kernen og for at sprede hele cytoplasmaet, antallet af pletter repræsenterer lysosomer inde i cytoplasmiske maske stiger. Derimod lysosomer klynge nær kernen numrene på stedet inde de cytoplasmatiske ring falder (fig 1B). Z “faktor af assayet blev bestemt ud fra EIPA (positiv kontrol) og lav pH (negativ kontrol) [24]. Eksperimenter blev udført i dobbeltbestemmelse. Kun plader med positiv Z ‘faktor blev anvendt til analyse.

(A) Metoden af ​​Cellomics-baserede højt indhold screening tilgang. (B) DAPI-farvning anvendes af Cellomics billeddannende platformen til at identificere individuelle celler. En virtuel maske trækkes af maskinen (forelagt af en grøn ring) med en forudbestemt bredde og afstand fra kernen. Antallet af lysosomer inde i masken beregnes ved maskinen (ved den lilla plet inde i ringen). Ved at behandle celler med sure Phe, lysosomer flytte ud, og antallet af pletter inde i ringen øges. Ved at hæmme lysosomer bevægelse, antallet af pletter omkring nucleus stiger mens antallet af pletter inde aftager ring maske. Denne egenskab blev anvendt til at beregne relativ lysosom distribution. (C) Den funktionelle virkning for hver forbindelse i forhold til kontrol blev beregnet ved hjælp af “normaliseret procent inhibering” (NPI). Statistisk signifikans mellem forbindelser og den negative kontrol blev målt ved Z-score. En scatter plot repræsenterer NPI (X-aksen) og Z-score (Y-aksen) af hver forbindelse er trukket. De lægemidler, der giver en NPI score på mere end 50% og en Z-score på mindre end -4 (højre nedre kvadrant som vist med den røde pil) blev udpeget som “hit” forbindelser.

Reagenser og antistoffer

LY294002, U0126, bafilomycin A og nocodazol blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA) og blev anvendt ved 10 uM, 10 uM, 100 nM og 10 uM. Phalloidin 1: 200 blev indkøbt fra Life Technologies (Grand Island, NY). Den α-tubulin antistof, 1: 1000, blev købt fra NeoMarkers (Fremont, CA). LAMP1 antistof (H4A3), 1: 200, blev købt fra Developmental Studies Hybridoma bank ved University of Iowa. DyLight 594 eller FITC, æsel-anti-muse eller anti-kanin blev købt hos Jackson Immunoresearch (West Grove, PA). Pakt og pMet blev anvendt ved 1/1000 og købt fra Cell Signaling (Beverly, MA). EIPA (25 uM), cytochalasin D (1 uM), Rab7 antistof (1: 1000), og chloroquin (50 uM) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Sekundær HRP-konjugeret anti-kanin og anti-muse blev indkøbt fra GE Healthcare (Pittsburgh, PA).

Immunofluorescens

Celler blev podet ved 50-70% konfluens på dækglas. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter. Celler blev derefter vasket med PBS og inkuberet med primært antistof (1: 200 fortyndet i BSP) i en time. Celler blev derefter vasket igen med PBS før inkubation med fluorescens-konjugeret sekundært antistof (1: 200 fortyndet i BSP) i en time. For actin-farvning blev celler inkuberet med phalloidin fortyndet ved 1: 200 i BSP i 20 minutter. Slides blev monteret ved hjælp Slowfade Anti-Fade Guld reagens med DAPI (Life Technologies, Grand Island, NY). Billeder er erhvervet ved hjælp af et Olympus UPlanFL 40X /0,75 objektiv og et Olympus BX50 mikroskop med MetaMorph software. Billeder blev fusioneret ved hjælp ImageJ software. For konfokal billeder blev en HCX Plan Apo 63X /1,4-0,6 olie målsætning om Leica TCS SP5 mikroskop og Leica LAS AF software, der anvendes.

Acridin Orange farvning

Celler dyrket på glas dækglas blev fyldt med 10 ug /ml acridinorange (Sigma Aldrich) i 20 minutter ved 37 ° C, derefter vasket med PBS. Efter en inkubation natten over med forskellige forbindelser, blev celler fikseret med kold 4% PFA i 20 minutter og derefter objektglas blev monteret med Slowfade Anti-Fade Gold Reagens med DAPI, før visualisering ved immunofluorescens-mikroskopi.

Proliferationsassay

celler blev podet i 96-brønds plade ved 4.500 celler per brønd og dyrket i 16 timer. bestemtes antallet af levedygtige celler i tredobbelte brønde efter CellTiter-Blå

® (Promega, Madison, WI) reagens blev tilsat til hver brønd ved 1/5 volumenforhold, ifølge producentens protokol. Pladen blev inkuberet ved 37 grader i 1 time, og derefter monteret på fluorescerende læser, hvor fluorescens på bestemte tidspunkt registreres ved 560 excitation /590 emission.

ATP assay

Celler blev udsået i 96-brønds plade ved 4.500 celler per brønd og dyrket i 16 timer. CellTiter-Glo

® reagens (Promega, Madison, WI) blev tilsat til hver brønd ifølge producentens protokol og pladen monteret på luminescens-læser. Mængden af ​​luminescens i hver brønd er proportional med mængden af ​​ATP.

Western Blot

Helcellelysater blev opsamlet i kogende Laemmli-puffer (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,13 mM bromphenolblåt, 1 M saccharose) blandet med beta-mercaptoethanol (i et forhold 50: 1). Lysater blev kørt på en 10% polyacrylamidgel, overført til PVDF (Millipore, Billerica, MA), blokeret i 10% mælk i TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) og probet med passende antistoffer i 16 timer. Membraner blev derefter inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1: 5000) i en time, før de udviklede anvendelse af ECL-plus (Pierce, Waltham, MA). Kodak BioMax XAR-film blev anvendt til kemiluminescensdetektion.

Cathepsin B-assay

Dette assay blev udført som tidligere beskrevet [7]. Kort beskrevet blev celler udpladet ved 80% konfluens, på hvilket tidspunkt fuldstændig medium blev erstattet med serumfri medier og de angivne betingelser. Efter inkubation blev mediet fjernet og cellerester blev opsamlet ved kort centrifugering. Medier blev derefter koncentreret via Amicon filtrering koncentration indretninger 10.000 Dalton (Millipore). Prøver blev derefter titreret til pH 5,0-5,5 og aktiv cathepsin B blev derefter detekteret via et fluorogent cathepsin B-aktivitet assay (Calbiochem, San Diego, CA) ifølge producentens protokol. Samtidig blev cellelysater ekstraheret med RIPA-buffer ved 4 °. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse kolorimetrisk Pierce BCA assay (Thermo Fisher Scientific). Cathepsin B-aktivitet blev normaliseret til totalt cellulært protein niveau ved at beregne forholdet cathepsin B-aktivitet i løbet af proteinniveauet i hver tilstand.

Lentiviral levering af shRNA

shRNA rettet mod Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCT GACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) blev leveret i DU145 prostatacancer celle under anvendelse Mission

™ Lentivirale Transduction Partikler (Sigma-Aldrich) ifølge fabrikantens protokol og som beskrevet tidligere [6,7]. shRNA ekspression blev holdt under puromycin (1,8 ug /ml) selektion. Ikke Target (NT) shRNA målrettet ingen kendte pattedyrgener blev brugt som en negativ kontrol (Sigma-Aldrich, shc202V).

Transfektionsresultater celler med plasmider, der koder LC3-GFP-mCherry

retroviral- baseret pBABE-mCherry-EGFP-LC3B plasmidet (plasmid # 22418) blev købt hos Addgene (Cambridge, MA). Viruset var pseudotype hjælp af pPAM3 emballage vektor efter co-transfektion ind HEK293T celler og virale supernatanter blev filtreret (0,2 mikrometer), alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. Transfektionsforsøg blev udført under anvendelse af Lipofectamine transfektionsreagens (Life Technologies) ifølge producentens protokol.

motilitet og invasion assays (IncuCyte)

96 brønd ImageLock Microplate (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) blev overtrukket med type-I-collagen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Celler blev udpladet og dyrket til 90% konfluens. Identiske sår blev foretaget i hver brønd med 96 godt sår healer (Essen Bioscience). Celler blev vasket til fjernelse af flydende celler og debris. 20% Matrigel (Corning) blev anbragt i brønde, der er udpeget til invasion studier. Behandlingsbetingelser blev anvendt i hver brønd. Pladerne blev monteret på IncuCyte Zoom imaging platform (Essen Bioscience), som holdes ved 37 grader med 5% CO2 og erhverver realtid billeder til samme region i hver brønd hver 4. time. En maske blev skabt for at bestemme sårheling for hver brønd. Relativ Wound Densitet (RWD) blev anvendt til at kvantificere tumorcelleinvasion og motilitet.

DQ-collagen IV-nedbrydning assay

DU145-celler blev dyrket i 2 dage på dækglas, der blev lagt med 100% matrigel (Corning) og DQ-collagen IV (Invitrogen Life Technologies, fortyndet ved en slutkoncentration på 25 ug /ml). Efter behandling natten over med lægemiddel i tilstedeværelse eller fravær af HGF blev celler fikseret i 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd i 30 minutter. Derefter blev cellerne vasket 2 gange med PBS og inkuberet med Alexa Fluor 635 phalloidin (Life Technologies) fortyndet 1: 200 i BSP i 30 minutter til farvning actincytoskelettet. Celler blev derefter vasket 2 gange med PBS og dækglas monteret. Kolonier og kløvet DQ-kollagen IV blev visualiseret på Leica TCS SP5 Laser konfokalt og billeder blev taget med LAS AF software.

Statistik

GraphPad Prism 5.0 og Microsoft Excel-software blev anvendt til at udføre statistikken. En eller to-halet Students t-test blev anvendt til at analysere statistiske forskelle. Alle grafer viser middelværdien og standardafvigelsen (SD). Forskelle på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. IC

50 af lægemidlerne blev beregnet under anvendelse af ikke-lineær regressionsligning på GraphPad Prism. Drug screening blev udført på 2 gentagelser. Robust Z ‘faktor blev beregnet under anvendelse af median og median absolutte afvigelse af kontrollen positive og negative af hver plade, og kun plader med positiv værdi blev valideret [24-27]. Z ‘faktor = 1 – {3 (SDN + SDP) /(Mn-Mp)} [20], hvor Mp, Mn, SDP, SDN er gennemsnittet og standardafvigelsen af ​​den positive kontrol (EIPA) eller negative kontrol (syre alene) . Størrelse virkning af hver forbindelse blev beregnet ved anvendelse normaliseret procentdel af inhibering (NPI). NPI = (H-xi) /(H-L) tid 100; hvor H = middelværdien af ​​den negative kontrol, og L = gennemsnit af positiv kontrol og XI værdien af ​​den tilsvarende forbindelse. Statistisk forskel af forbindelsens virkning i forhold til den negative kontrol blev beregnet ved anvendelse Z-score, som er værdien af ​​hver forbindelse normaliseret til den negative kontrol. Z-score = (xi-H /SDN, hvor xi er værdien af ​​den tilsvarende forbindelse, H og SDN er middelværdien og standardafvigelsen af ​​den negative kontrol i hver plade henholdsvis. Kun lægemidler viser en Z-score under minus 4 og NPI over 50% var til fornyet overvejelse for fremtidige undersøgelser.

Resultater

En roman imaging-baserede højt indhold screening tilgang identificerer lægemidler, der hæmmer anterograd lysosomer handel

for at identificere klinisk tilgængelige forbindelser, der forhindrer sure phe-medieret anterograd lysosom trafficking, udviklede vi et højt indhold skærmen ved hjælp af Cellomics Array Scan IV imaging platform (fig 1A). DU145 prostatacancerceller blev podet i plader med 96 brønde. lav pH serumfrie medier og EIPA blev anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Forbindelser fra fire uafhængige kemiske biblioteker blev påført ved ca. 5 uM fusions celler behandlet med pH 6,4 serumfrit RPMI natten over. celler blev fikseret og lysosomer blev identificeret med et lysosom associeret membranprotein-1 ( LAMP1) antistof, en etableret lysosomale markør, mens kernerne blev visualiseret med DAPI. Den Cellomics Arrayscan platform blev anvendt til at visualisere immunfluorescens i hver brønd med en 20 x objektiv og en kompartment analyse software kvantificeret lysosom spredning i hver celle. Lysosomer blev bestemt ved at analysere antallet af LAMP-1 positive puncta inden for den udpegede “ring” region (fig 1B).

Celler med lysosomer viser JLA (EIPA behandlet) havde færre lysosomer i ringen region sammenlignet til celler med lysosomer placeret diffus hele cytoplasmaet. Assays blev valideret ved at beregne Z “faktor, som måler evnen hos test til at skelne mellem positive og negative kontroller [24]. Den funktionelle virkning for hver forbindelse i forhold til kontroller blev beregnet under anvendelse af en “normaliseret procent inhibering” score (NPI). Stærkere hæmning af anterograd lysosomer menneskehandel giver en højere NPI værdi. Statistisk signifikans af “betyder ring spot” mellem forbindelse og negativ kontrol blev målt under anvendelse af en Z-score tilgang (Fig 1C). Forbindelser med en NPI score over 50% og Z-score under -4 blev udvalgt (højre nedre kvadrant som vist med rød pil) og undersøges igen visuelt at eliminere falske positiver. Blandt 2210 testede forbindelser blev atten narkotika identificeret som hits og verificeret af sekundær screening. Mange af disse forbindelser er allerede kendt for at være mikrotubuli forstyrre agenter, og forudsigeligt, at de ville blokere udadgående bevægelse af lysosomer.

niclosamid, et anti-helminthiske middel, blev også udpeget som en af ​​de hits. Siden har niclosamid blevet påvist at have anti-cancer effekter i glioblastoma [28], ikke-småcellet lungekræft [29], colorectal cancer [30], og brystkræft [31], valgte vi at yderligere at undersøge den rolle, niclosamid på lysosom bevægelse i prostata kræftceller.

niclosamid er giftigt ved koncentrationer på 1,0 mikromolær

først testede vi den cellulære toksicitet niclosamid for at identificere det område af koncentrationer, hvor dette stof kunne bruges til eksperimentelle undersøgelser. Niclosamid blev påført DU145 prostatacancerceller ved varierende koncentrationer over tid. Cellelevedygtighed blev målt ved en fluorescens-baseret celleassay (S1A Fig). Niclosamid behandling resulterede i reduceret proliferation ved koncentrationer på 0,6 pM og oven af ​​24 og 48 timer efter behandling. Faldet i cellelevedygtighed blev mere tydelig ved 48 timer og ved en dosis på 1 uM og derover, når vi bemærker et fald i levedygtige celler ved 48 timer versus 24 timer. Den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) blev beregnet som 1,01 um (S2 Fig). Derfor, for den resterende del af forsøgene, vi udførte, valgte vi en koncentration, der ikke oversteg 1 uM og eksperimenter, der ikke overstige 24 timer.

niclosamid hæmmer anterograd lysosomer handel med kræftceller

for yderligere at karakterisere niclosamid som et lysosom trafficking inhibitor, blev DU145 prostatacancerceller behandlet natten over med DMSO eller niclosamid og udsættes for sur pH 6.4 medier, 33 ng /ml HGF eller 100 ng /ml EGF i 16 timer. Celler blev derefter fikseret og farvet med DAPI (blå), LAMP1 (rød), og phalloidin (grøn) (Fig 2A). Celler behandlet med DMSO viste anterograd lysosomer handel som reaktion på sure Phe, HGF og EGF. Men celler behandlet med niclosamid ikke undergår anterograd lysosomer handel som reaktion på sure Phe, HGF eller EGF; i stedet forbliver lysosomer grupperet i perinukleære region. Dette bekræfter resultaterne af lægemidlet skærmen højt indhold, der identificerede niclosamid som en hæmmer af lysosom menneskehandel.

(A) DU145 celler blev behandlet med pHe 6.4, 33 ng /mL HGF eller 100 ng /mL EGF i nærvær eller fravær af 0,5 uM niclosamid. Celler blev fikseret og farvet for DAPI (blå), actin (grøn), og LAMP-1 (rød). I kontrol og i EGF eller HGF-behandlede celler lysosomerne er placeret ved periferien (hvide pile) henviser i niclosamid-behandlede celler lysosomerne er omkring kernen (hvide pilespidser). Scale bars: 10 um. DU145 celler blev behandlet natten over med forskellige koncentrationer af niclosamid fortyndet i (B) lav pH medier (pH 6,4), (C) medier indeholdende 33 ng /mL HGF, eller (d) medier indeholdende 100 ng /ml EGF og relativ lysosomer fordeling var beregnet under anvendelse af Cellomics imager. Kvantificering af lysosom position er vist som gennemsnittet af den beregnede “betyder ring spot count kanal 3”. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. * Angiver statistisk signifikans (p 0,01) versus niclosamid. (E) DU145-celler blev behandlet med 1 uM niclosamid over tid og relative lysosom fordeling blev beregnet ved anvendelse af Cellomics imager. Kvantificering af lysosom position er vist som gennemsnittet af den beregnede “betyder ring spot count kanal 3”. Fejl søjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg.

En dosis respons undersøgelse blev udført for at bestemme den mindste effektive dosis af niclosamid forpligtet til at indlede JLA. DU145 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af niclosamid i 16 timer i nærvær eller fravær af sure Phe (Fig 2B), HGF (fig 2C), eller EGF (Fig 2D). Celler blev immunfarvet for at detektere LAMP1 og DAPI blev anvendt til at identificere kerner. Den relative lysosom fordeling blev analyseret under anvendelse af Cellomics Imager. Niclosamid blokeret markant omfordeling af lysosomer ved en koncentration så lav som 312 nM efter stimulation med HGF eller EGF, og ved 625 nm efter stimulering med sure pHe.

Næste gennemførte vi et tidsforløb analyse for at identificere den mindste mængde tid, der var påkrævet før niclosamid var effektiv til at fremkalde JLA. DU145 celler blev udsat for niclosamid over tid i nærvær af sure medier (pH 6,4). Fig 2E viser, at lysosom positionering blev ændret ved snart som 2-4 timer efter udsættelse for niclosamid, og JLA steget over tid. Ingen ændring i lysosom positionering blev observeret i vehikel kontrol behandlede celler. Tilsammen indikerer disse data, at niclosamid ændrer positionen af ​​lysosom i en dosis så lav som 312 nM, og så tidligt som 2 timer.

niclosamid-induceret JLA ikke indebærer inhibering af ATP-produktion

tidligere arbejde har impliceret kinesin, en ATPase motor protein, i plus-ende-rettet lysosom bevægelse (udad lysosomale bevægelse) [32-34]. Da niclosamid er kendt for sin evne til at målrette den oxidative phosphorylering af parasitter [22,23], søgte vi at bestemme, om niclosamid-induceret JLA skyldtes ATP depletion, er resultatet af en inhiberet oxidativ phosphorylering, og dermed ændring af aktiviteten af ​​ATP -driven proteiner, såsom kinesin. Følgelig blev DU145 prostatacancerceller behandlet med vehikelkontrol eller niclosamid over en 4 timers periode af tid og intracellulære ATP-niveauer, et surrogat for oxidativ phosphorylering, blev målt ved anvendelse af et luminescens-assay (S1B Fig). Selv observeres virkningen af ​​niclosamid på lysosom positionering så tidligt som 2 timer efter udsættelse for narkotika, blev der ikke observeret nogen signifikant forskel i ATP-niveau mellem cellerne behandlet køretøj kontrol eller niclosamid. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. Cytochalasin D blev anvendt som en kontrol for at depolymerisere actinfilamenter. Celler blev fikseret og farvet for actin (grøn) og DAPI (blå). Pile angiver, at de samme cellulære komponenter (trådformede actin-pilespids, kortikal actin- lukket pil, fokal adhesion- åben pil) er ens mellem kontrol og niclosamid. Scale bars: 20 uM. Nocodazol blev anvendt som kontrol til depolymerisere mikrotubuli. PI3kinase og MAPK er ikke påkrævet for niclosamid at forhindre sure medier inducerede udad lysosom bevægelse.

(A) Celler blev stimuleret med 33 ng /ml HGF i nærværelse eller fravær af 0,5 uM niclosamid over tid. Cellelysater blev opsamlet og Western blot-analyse blev udført for de angivne proteiner. (B) DU145-celler blev forbehandlet med PI3K-inhibitor, LY294002, eller MAPK inhibitor, U0126, før tilsætningen af ​​niclosamid 1 uM i 16 timer. Celler blev fikseret og farvet for LAMP-1 og betyde lysosom fordeling i forhold til kernen blev beregnet ved anvendelse af Cellomics imager. Kvantificering af lysosom fordeling er vist som gennemsnittet af relative position til kernen. * Angiver statistisk signifikans (p 0,05) i forhold til samme behandling i serumfrit. Niclosamid blokke vækstfaktor-induceret motilitet og invasionsevne uafhængigt af Rab7 status. Salg DU145 NT og Rab7 KD celler blev dyrket i plader med 96 brønde og sårede med 96 brønde viklet healer før tilsætning af matrigel i brøndene designet til invasion. Celler lodes (A) migrere eller (B) invadere i nærvær af 33 ng /mL HGF eller 100 ng /ml EGF i nærvær eller fravær af 0,3 uM niclosamid. Motilitet og invasion blev beregnet ved anvendelse IncuCyte platformen og den relative procentdel såret massefylde ved 24 timer efter sårdannelse. Fejlsøjler repræsenterer SD fra mindst 3 uafhængige forsøg.