PLoS ONE: neuropilin-2 medieret β-Catenin Signaling og overlevelse i Human Gastro-Intestinal Cancer Cell Lines

Abstrakt

NRP-2 er en høj affinitet kinase-mangelfuld receptor for ligander, der tilhører klasse 3 semaphorin og vaskulær endotelvækstfaktor familier. NRP-2 er blevet opdaget på overfladen af ​​flere typer af humane kræftceller, men dens udtryk og funktion i gastrointestinale (GI) kræftceller er endnu ikke fastslået. Vi har forsøgt at bestemme funktionen af ​​NRP-2 i mediering downstream signaler regulerer vækst og overlevelse af humane gastrointestinale cancerceller. I humane mavekræft prøver blev NRP-2-ekspression detekteres i tumorvæv, men ikke i det tilstødende normale slimhinde. I CNDT 2,5 celler, shRNA medieret knockdown NRP-2-ekspression førte til nedsat migration og invasion in vitro (p 0,01). Fokuseret gen-array analyse viste, at tab af NRP-2 reducerede udtryk for en kritisk metastase mediator gen, S100A4. Steady-state niveauer og funktion af β-catenin, en kendt regulator af S100A4, blev også faldet i de shNRP-2-kloner. Desuden knockdown af NRP-2 sensibiliserede CNDT 2,5 celler

in vitro

til 5FU toksicitet. Denne virkning blev associeret med aktivering af caspaser 3 og 7, spaltning af PARP, og nedregulering af Bcl-2.

In vivo

vækst CNDT 2,5 celler i lever fra nøgne mus blev signifikant reduceret i shNRP-2 (p 0,05). Intraperitoneal indgivelse af NRP-2 siRNA-DOPC faldt tumorbyrden hos mus (p = 0,01). Kollektivt, vores resultater viser, at tumor celle-afledt NRP-2 medierer kritisk overlevelse signalering i gastrointestinale kræftceller

Henvisning:. Samuel S, Gaur P, Fan F, Xia L, Gray MJ, Dallas NA, et al . (2011) neuropilin-2 medieret β-Catenin Signaling og overlevelse i Human Gastro-Intestinal kræftceller. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10,1371 /journal.pone.0023208

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Marts den 31., 2011; Accepteret: 12 Jul 2011; Udgivet: 20 okt 2011

Copyright: © 2011 Samuel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. RE ” Bob “Smith fond for Cancer Research (SS); National Institutes of Health tilskud fem T32 CA09599 (ND, PG, og DB); Center for RNA-interferens og ikke-kodende RNA (GL-B, AS), og et program Projektudvikling Grant danne æggestokkene Cancer Research Fund (GL-B, AS); The William C. Liedtke, Jr., formand for Cancer Research (LE); National Institutes of Health tilskud R01 CA112390 (LE). Disse finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Genentech, Inc. betalt for løn og forskningsinfrastruktur for deres medarbejdere GP og AB, men havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, eller forberedelse af manuskriptet. Genentech, Inc. godkendte offentliggørelsen af ​​manuskriptet

Konkurrerende interesser:. LE er en konsulent til Genentech, Inc., som forudsat i NRP-2 antistoffer, og Roche. GP og AB blev betalt medarbejdere i Genentech på tidspunktet for undersøgelsen. En patentansøgning er indgivet vedrørende de anti-NRP antistoffer fra Genentech, der blev brugt i dette manuskript. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

neuropilin-2 (NRP-2) er et transmembrant glycoprotein, der oprindeligt blev beskrevet som en receptor for de Axon vejledning mediatorer, de semaphorins [1]. Efterfølgende blev det sig at blive udtrykt af venøse og lymfatiske endotelceller og identificeret som en co-receptor for medlemmer af den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) [2], hvilket antyder en rolle i angiogenese og lymfangiogenese [3]. NRP-2-ekspression er blevet rapporteret på tumorceller i lungekræft [4], [5], neuroblastom [6], pancreascancer [7], osteosarkom [8], og blærekræft [9]. Imidlertid er funktionen af ​​NRP-2 på tumoren cellemembranen i humane cancere, herunder gastrointestinal (GI) neuroendokrine og gastrisk oprindelse, stort set udefineret. Vi har tidligere vist, at NRP-2 udtrykkes i tyktarms- og bugspytkirtelkræftceller og at dens ekspression er involveret i at fremme tumorvækst [10], [11]. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at bestemme funktionen af ​​NRP-2 i mediering downstream signaler regulerer vækst og overlevelse af humane gastrointestinale cancerceller. Vi fandt, at NRP-2 blev overudtrykt i humane gastriske cancer prøver og gastriske og carcinoide celler in vitro. Vi belyst rollen som NRP-2 i cellelinierne med den højeste NRP-2-ekspression. Vi fandt, at tabet af NRP-2 reducerede steady state niveauer og funktion af β-catenin i disse celler. NRP-2 knockdown førte til fald i ekspressionen af ​​S100A4 og nedsat migration og invasion af celler in vitro. Endvidere knockdown af NRP-2 sensibiliserede CNDT 2,5 celler in vitro til 5FU toksicitet. Disse resultater viser, at NRP-2 medierer kritiske onkogene funktioner i GI cancerceller og at inhibering af dets ekspression og aktivitet kunne udnyttes til terapeutisk fordel hos patienter med metastatisk sygdom.

Resultater Salg

Ekspression af NRP-2 i humane gastrisk kræft væv og cellelinjer

Vi vurderede først udtryk for NRP-2 protein i paraffinindlejrede væv af human mavekræft og tilstødende normal slimhinde ved immunperoxidasefarvning. I repræsentative mavekræft prøver blev NRP-2 protein udtrykt i gastrisk cancer epitel, men ikke i normalt mucosalt epitel (figur 1A). NRP-2-protein (~130 kD) blev heterogent udtrykt tværs fem af de seks gastrointestinale cancercellelinjer analyseret ved Western blotting: AGS, CNDT 2.5, MKN74, NCI-N87 og KKLS (figur 1B). CNDT2.5 (et menneske carcinoid cellelinje [12], [13]) og NCI-N87 udtrykte de højeste niveauer af NRP-2 og blev derfor anvendt til efterfølgende Knockdown undersøgelser. Som en kontrol, præinkubation af NRP-2-antistof med det immuniserende peptid bekræftede specificitet af antistoffet.

(A) Immunohistokemisk farvning for NRP-2-ekspression i repræsentative vævssnit (20X) af normal human gastrisk mucosa og gastrisk cancer prøver (B) Immunblotanalyse af NRP-2 ekspression i seks humane GI cancercellelinjer. Vinculin tjente som en intern loading kontrol. (C) Generation af stabile CNDT 2,5 cellelinjer med NRP-2 knockdown. Immunoblotanalyse af NRP-1 og -2 udtryk i CNDT 2,5 celler transficeret med shcntr eller shNRP-2 plasmider (shNRP-2 kloner, C6 og C10). Vinculin tjente som en belastning kontrol. (D) MTT analyseresultater. Vækstraterne var ikke anderledes mellem kontrol- celler og NRP-2 Knockdown kloner. Søjler angiver SEM. (E) Top: Mean antal celler, som vandrede i en Boyden kammer assay. Nederst: Repræsentative billeder (10X) af migration assays. (F) Top: Mean antal celler, der invaderede i BioCoat Matrigel invasion kammer assay. Nederst: Repræsentative billeder (10X) af invasion analyser

Effekt af NRP-2-ekspression på celleproliferation in vitro

For at forstå funktionen af ​​NRP-2 i gastrointestinal cancer, vi. først undersøgt virkningerne af NRP-2 lyddæmpning på væksten af ​​CNDT 2,5 celler in vitro. Vi valgte disse celler, fordi de udtrykker høje endogene niveauer af NRP-2. CDNT 2,5 celler blev stabilt transficeret med en shRNA kontrol (shcntr) eller shNRP-2 (shNRP-2) plasmid, og to shNRP-2 transficerede kloner med et markant fald i NRP-2-protein-ekspression (C6 og C10, figur 1C) var valgt. shNRP-2 transfektion påvirkede ikke udtryk for NRP-1 i disse celler, kontrollere specificiteten af ​​NRP-2 shRNA. Vi anvendte derefter et MTT-assay til bestemmelse af virkningen af ​​NRP-2 knockdown på vækstrater for de celler in vitro. Kloner stabilt transficeret med shNRP-2 viste ingen ændring i opformeringsrater forhold til den for shcntr-transficerede celler (Figur 1D).

Effekt af NRP-2-ekspression om migration og invasion

Effekten af NRP-2 RNAi på motiliteten af ​​CNDT 2,5 celler blev undersøgt under anvendelse Boyden kammer assays. Antallet af celler, som migrerede til bundkammeret var signifikant lavere i shNRP-2 transficerede celler (37 ± 5 pr felt) end i shcntr transficerede celler (140 ± 12 per felt) (p 0,001; Figur 1E, top). Omvendt, når celler med lav endogen ekspression af NRP-2 (KKLS) blev transient transficeret med et NRP-2-cDNA ekspressionskonstruktionen for at overudtrykke proteinet, blev cellemigration signifikant forøget (data ikke vist).

celleinvasion blev vurderet ved anvendelse af den modificerede Boyden kammer assay med membraner coatet med Matrigel. NRP-2 RNAi hæmmede signifikant invasionen af ​​CNDT 2,5 celler (64,4%; p 0,001; Figur 1F, top). Men fordi invasion af celler i dette assay er også en funktion af den vandrende potentiale af cellerne, er det vanskeligt at drille de individuelle bidrag. Som sådan, da forskellene mellem de to grupper er ens i begge analyserne, vi kan ikke udelukke den tanke, at det reducerede antal invaderende celler blot kan afspejle faldt migration af shNRP2 kloner.

Effekt af NRP- 2 knockdown på ekspression af kendte metastatiske gener

Da invasion og migration er forbundet med den metastatiske fænotype, udførte vi et gen array analyse under anvendelse af en fokuseret human tumormetastase microarray, der repræsenterer 113 gener vides at være involveret i metastase. Undertrykkelse af NRP-2 forårsagede en reduktion i ekspressionsniveauet af flere metastatiske gener (figur 2A). Mange af de nedreguleret gener, der var reagerer på NRP-2 knockdown vides at være forbundet med nedbrydning af den ekstracellulære matrix og er stærkt udtrykt under metastase. Mest bemærkelsesværdigt, observerede vi, at nedregulering af NRP-2 forårsagede en signifikant reduktion ( 95%) i ekspressionen af ​​S100A4 (figur 2A). Fordi S100A4 var meget lydhøre over for NRP-2 knockdown, fokuserede vi på dette gen for yderligere undersøgelser. Western blot-analyse bekræftede, at S100A4 protein ekspression blev signifikant reduceret efter NRP-2 knockdown (figur 2B).

(

A

) Autoradiografisk billede af array membran viser differentiel ekspression af metastatiske gener i shcntr (

venstre

) og shNRP-2 (

rigtige

) celler. Kredsede pletter indikerer positionen af ​​S100A4 genet. (B) Validering af S100A4 protein ekspressionsniveauet i celler ved immunoblotanalyse. Actin tjente som en belastning kontrol. (C) Reduktion af steady-state niveau af β-catenin af NRP-2 knockdown. β-catenin ekspression i shcntr og shNRP-2-celler blev bestemt ved immunblotting. Vinculin tjente som en belastning kontrol. (D) Verifikation af reduceret β-catenin ekspression i shNRP-2-celler ved immunfluorescensfarvning. shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler, der vokser i kammerskiver blev fikseret og immunfarvet med anti-β-catenin antistof (rød). Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). (E) Validering af β-catenin reduktion i en anden NRP-2 knockdown gastrisk cancercellelinie. NCI-N87 mavekræft celler blev inficeret med lentivirus indeholder shcntr eller shNRP-2-konstruktioner. Immunoblotanalyse viste reduktion i β-catenin ekspression i NCI-N87 NRP-2 knockdown-celler. Actin tjente som en belastning kontrol. (F) β-catenin niveau i cytoplasmatiske (Cyto) og nukleare (Nuc) fraktioner af shcntr og shNRP-2 celler. HSP90 (cytoplasmatisk) og LaminB (nuklear) tjente som fraktionering kontroller.

Effekt af NRP-2 knockdown på udtryk og lokalisering af β-catenin

Fordi S100A4 er en direkte transkriptionel mål af β-catenin, undersøgte vi ekspressionen af ​​β-catenin i NRP-2 knockdown-celler. Total β-catenin-proteinekspression var signifikant lavere i de CNDT 2.5 shNRP-2-celler end i shcntr celler (figur 2C). For yderligere bekræftelse, shcntr og shNRP-2-kloner blev fikseret og immunfarvet med anti-β-cateninantistof (rød fluorescens). I overensstemmelse med Western blot data, blev de samlede β-catenin-niveauer betydeligt reduceret i NRP-2 Knockdown celler (Figur 2D). For yderligere validering i en anden gastrisk cancer cellelinje blev NRP-2 slået ned i NCI-N87 celler, som udtrykker en høj endogen niveau af NRP-2, ved lentivirus-medieret stabil shNRP-2 inkorporering. Efter kontrol af NRP-2 knockdown (figur 2E, midterste panel) i disse celler, blev β-catenin niveau vurderes ved Western blotting. Det samlede β-catenin niveau var signifikant reduceret i disse NRP-2 Knockdown celler (figur 2E, Top panel).

For at bestemme hvorvidt NRP-2-medieret β-catenin-ekspression var ligandafhængig eller ligand uafhængige, β-catenin status blev evalueret ved Western blot-analyse i CNDT 2,5 celler efter behandling med blokerende antistoffer mod NRP-2 (anti-NRP-2

B, som blokerer VEGF-C-binding, og pan-anti-NRP, som blokerer Sema binding til både NRP-1 og NRP-2 og blokerer også VEGF-binding gennem sterisk hindring); anti-NRP1 antistof tjente som kontrol (alle fra Genentech, San Francisco, CA). Sammenlignet med kontrollen, var der ingen forskel i ekspressionen af ​​β-catenin i celler behandlet med blokerende antistoffer, hvilket antyder, at NRP-2-medieret signalering i disse celler er ligand uafhængig (data ikke vist).

β-catenin er kendt for at udøve sin funktion ved at translokere fra cytoplasmaet ind i kernen, hvor det binder til transkriptionsfaktorer, såsom T-celle faktor (TCF) /lymfoid enhancer-bindende faktor og derved stimulerer transskriptionen af ​​målgener. Vi analyserede derfor den relative overflod af β-catenin-protein i den cytosoliske og nukleare rum i CNDT2.5 shNRP-2 og shcntr celler efter celle fraktionering. Som vist i figur 2F, NRP-2 knockdown ført til en betydelig reduktion i steady-state niveau af β-catenin-protein i både cytosoliske og nukleare fraktioner af cellerne.

Virkning af NRP-2 knockdown på funktion af β-catenin

for at bestemme om NRP-2 knockdown også påvirket signalering aktivitet af β-catenin, vi transficeret CNDT 2,5 shcntr og shNRP-2 celler med TCF reporter plasmidet TOPflash eller kontrol plasmidet FOPflash. TOPflash indeholder en luciferase reporter under kontrol af tre kopier af vildtype TCF-bindende element opstrøms for thymidinkinase minimale promotor og er specifikt reguleret af β-catenin signalering. I FOPflash er TCF-bindende element muteret. Luciferase assay viste, at reporter-aktivitet blev reduceret 2-fold i shNRP-2-celler sammenlignet med aktivitet i shcntr celler (figur 3A).

(A) Vurdering af TCF reporter aktivitet under anvendelse af β-catenin- lydhør TOPflash eller mutant FOPflash journalister. Luciferaseaktiviteter blev målt efter transient transfektion af reporter plasmider i shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler (B) Øget proteasom-medieret nedbrydning af β-catenin i shNRP-2-celler. shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5-celler blev behandlet med 30 pM MG132 eller tilsvarende volumen af ​​DMSO (et opløsningsmiddel for MG132) i 2 timer. Cellelysater blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af anti-β-catenin antistof ( ‘φ’, ingen behandling; ‘Ub’, ubiquitinerede β-catenin). (C) Immunoblotanalyse viser genoprettelse af β-catenin niveau i de cytoplasmatiske og nukleare fraktioner efter behandling med 30 pM MG132 i 2 timer. (D) Nedsat niveau af phosphoryleret GSK3p i NRP-2 Knockdown celler. Immunoblotanalyse af phosphoryleret GSK3p (ved Ser-9) og GSK3p. (E) Genoprettelse af β-catenin niveau efter blokering GSK3p aktivitet i NRP-2 Knockdown celler. shcntr eller shNRP-2 CNDT 2,5 knockdown celler blev behandlet med stigende koncentrationer af LiCI i 24 timer og høstet til immunoblotanalyse at detektere β-catenin.

Virkning af NRP-2 knockdown på stabiliteten af ​​β- catenin

Intracellulær β-catenin-protein niveauer vedligeholdes af en multiproteinkompleks “ødelæggelse kompleks”, der indeholder APC, Axin, og GSK3p. I et aktivt kompleks, GSK3p phosphorylerer β-catenin, tagging det for anerkendelse af β-trCP, polyubiquitinylation, og efterfølgende nedbrydning af proteasomet kompleks. Vi udførte inhibitor undersøgelser for at vurdere stabiliteten af ​​β-catenin i NRP-2 Knockdown celler. Behandling med MG132, en proteasominhibitor, førte til restaurering af den samlede β-catenin protein niveau i NRP-2 Knockdown celler til niveauet i shcntr celler (figur 3B). Endvidere behandling med MG132 også restaureret den totale β-catenin proteinniveau i både cytosoliske og nukleare rum i NRP-2 Knockdown celler (figur 3C).

posttranslationelle modifikationer er kendt for at spille en kritisk rolle i regulering af β-catenin omsætning, og β-catenin sekventielt phosphoryleres med GSK3p. For at undersøge om GSK3p aktivering blev involveret i nedregulering af β-catenin, undersøgte vi phosphorylering status GSK3p ved anvendelse af et antistof mod Ser-9 phosphorylerede form af GSK3p. Ser-9 phosphorylering er blevet rapporteret at gøre GSK3p inaktiv. Som vist i figur 3D, blev Ser-9 phosphorylering af GSK3p faldt betydeligt i shNRP-2-celler, hvilket indikerer, at i disse celler blev der forøgede niveauer af aktiv GSK3p-protein, der fremmer β-catenin-nedbrydning. For yderligere at bekræfte involveringen af ​​GSK3p-aktivering i reguleringen af ​​β-catenin, virkningen af ​​lithiumchlorid (LiCl)

, en kendt inhibitor af GSK3p aktivitet, blev analyseret. LiCI er blevet rapporteret at inducere den inhibitoriske Ser-9 phosphorylering af GSK3p samtidig have nogen virkning på andre proteinkinaser. Som vist i figur 3E, behandling med LiCl stabiliseret β-catenin protein i shNRP-2 celler på en dosis-afhængig måde.

Virkning af NRP-2 knockdown på kemosensitivitet af gastrointestinale cancerceller in vitro

i betragtning af den kendte rolle af β-catenin i mediering celleoverlevelse vi den hypotese, at en reduceret β-catenin niveau i NRP-2 knockdown celler ville resultere i en øget kemosensitivitet af disse celler. For at teste denne hypotese, vi først udført et in vitro kemosensitivitet assay med 5-fluorouracil (5FU), der anvendes som standardbehandling for gastrointestinale cancere. I overensstemmelse med vores hypotese, ved hjælp af annexin V-farvning, CNDT 2,5 shNRP-2-celler behandlet med en klinisk relevant dosis 5FU demonstrerede en signifikant højere procentdel af apoptotiske celler end gjorde shcntr celler (25,5% versus 12,5%, henholdsvis; p 0,05;. figur 4A)

(A) Annexin V assay på shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler efter behandling uden eller med 5FU i 48 timer. (B) Western blot-analyse af apoptotiske markører i celleekstrakter fra shcntr og shNRP-2 CNDT 2,5 celler behandlet med eller uden 5FU. Vinculin og actin tjente som lastning kontrol.

For at bekræfte den mekanisme af 5FU-induceret celledød, sammenlignede vi aktiveringen af ​​apoptotiske mæglere i CNDT 2,5 shcntr og shNRP-2-celler behandlet med 5FU. Aktiveringen af ​​caspase-3 og -7, effektor-caspaser i den apoptotiske kaskade, og spaltning af caspase substrat PARP, som udøver proapoptotiske aktivitet, blev vurderet ved immunoblotting under anvendelse af antistoffer, som specifikt genkender deres spaltede produkter. I overensstemmelse med den øgede apoptose i 5FU-behandlede NRP-2 Knockdown celler observerede vi en markant stigning i niveauerne af aktiv caspase-3 og -7 i disse celler, men ikke i de shcntr celler (figur 4B). Endvidere observerede vi PARP-spaltning i 5FU-behandlede shNRP-2-celler, men ikke i 5FU-behandlede shcntr celler (figur 4B). Derudover observerede vi signifikant udtryk for antiapoptotisk protein Bcl2 i CNDT 2,5 shcntr celler; Bcl2 udtryk var fraværende i shNRP-2 celler.

Effekt af NRP-2 knockdown på in vivo-væksten af ​​gastrointestinale kræftceller

For at undersøge effekten af ​​NRP-2 knockdown på væksten af gastrointestinale kræftceller in vivo, vi injicerede CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2-kloner i leverne (et fælles site for gastrointestinal cancer metastaser) af mus (10 dyr pr gruppe) og vurderet tumorforekomst og tumor volumen. Alle mus var omtrent den samme vægt, når aflivet. Tumor forekomst var signifikant lavere i mus injiceret med shNRP-2 kloner end i mus injiceret med shcntr celler (30% for shNRP-2 C6 og 10% for shNRP-2 C10 vs. 80% for shcntr; p 0,05, Fishers Exact Test, figur 5A). Desuden tumorer produceret af CNDT 2,5 shNRP-2 celler var signifikant mindre (Mean levertumor volumen på 38 ± 24 mm

3 og 14 ± 10 mm

3 for de to kloner, henholdsvis) end var tumorer produceret af kontrol celler (Mean levertumor volumen på 1.797 ± 880 mm

3; p 0,05, figur 5B). Den plottede data omfatter alle de 10 mus i hver gruppe, herunder dem, der udviklede ikke nogen tumor (dvs. 7/10 og 9/10 i henholdsvis de to shNRP2 grupper Vs 2/10 i kontrolgruppen). Repræsentativt billede af hele leveren med tumor fra hver gruppe er vist i det nederste panel. Den knockdown af NRP2 i tumorerne blev bekræftet ved immunoblotanalyse af NRP-2 i leveren tumorvæv fra mus injiceret med CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2 C6 celler (Figur 5C).

(A) Nedsat tumorincidensen og betyde tumorvolumen efter NRP-2 knockdown. Tumorincidens (10 mus) efter liver injektion med CNDT 2,5 shcntr celler eller en af ​​to shNRP-2 kloner. (B) Top: Afsluttende lever tumorvolumener hos mus injiceret med shcntr og shNRP-2-kloner. Nederst: Repræsentative billeder af tumorer. (C) Immunoblotanalyse af NRP-2 i tumorer fra mus injiceret med CNDT 2,5 shcntr eller shNRP-2 C6 celler [ »T1«; Tumor # 1; »T2«; Tumor # 2]. β-Actin tjente som en belastning kontrol.

Effekt af in vivo målretning af NRP-2 på vækst af gastrointestinale kræftceller

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​in vivo-administration af NRP-2 målrettede siRNA hjælp 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (NRP-2 siRNA-DOPC) neutrale nanoliposomes [10], [14] på væksten af ​​gastrointestinale kræft implanteret i mus. CNDT 2,5 celler blev dyrket som subkutan xenotransplantater og NRP-2 siRNA-DOPC behandling blev påbegyndt på dag 7 i mus med synlige tumorer (15 ± 1,5 mm

3). Behandlingen bestod af to gange om ugen intraperitoneal injektion med 5 ug CNTR siRNA-DOPC eller NRP-2 siRNA-DOPC. Den gennemsnitlige mængde af tumorer i mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC var mindre end for mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (264,4 ± 19,4 mm

3 vs. 751.3 ± 150,6 mm

3, henholdsvis; p = 0,01, figur 6A). Endvidere mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC udviste en signifikant reduktion i tumormasse sammenlignet med tumormasse i mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (160 ± 18 mg vs. 459 ± 102 mg, henholdsvis; p 0,05; fig 6B). Immunhistokemisk farvning af tumorvæv bekræftede, at NRP-2-ekspression blev reduceret i tumorerne fra mus behandlet med NRP-2 siRNA-DOPC sekvenser sammenlignet med tumorer fra mus behandlet med Cntr siRNA-DOPC sekvenser (figur 6C).

(A) Tumor mængder efter indgivelse af sicntr og siNRP-2 liposomer. Nøgne mus (7 per gruppe) blev subkutant injiceret med 1 × 10

6 CNDT 2,5 celler. Mus med synlige tumorer blev stratificeret og behandlet med 5 ug af liposom-konjugeret siRNA (i.p. injektion) to gange ugentligt. NRP-2-siRNA DOPC-behandling førte til et betydeligt fald i tumor vækst i forhold til CNTR siRNA DOPC-behandling (264,4 mm

3 vs. 751.3 mm

3, henholdsvis; *

s

= 0,01). (B) Top: Ved afslutningen af ​​forsøget, s.c. tumorer blev udskåret og vejet. Tumorvægt var signifikant lavere i NRP-2-siRNA-DOPC behandlede mus (gennemsnit, 160 mg) sammenlignet med Cntr siRNA DOPC-behandlede mus (gennemsnit, 459 mg; *

s

= 0,01). Nederst: Repræsentative billeder af tumorer (C) Immunoblotanalyse af NRP-2 i tumorer fra mus behandlet med CNTR-siRNA DOPC eller NRP-2-siRNA DOPC

Diskussion

neuropilin. -2 (NRP-2) er traditionelt kendt for at virke som en nonsignaling co-receptor for klasse 3 semaphorins og medlemmer af VEGF-familien [1], [2]. Selvom ekspressionen af ​​NRP-2 oprindeligt blev anset for at være begrænset til neuroner, har undersøgelser vist, at NRP-2 udtrykkes på VSMC, endothelceller og tumorceller. NRP-2 er rapporteret at interagere med VEGFR2 og VEGFR3 og øge overlevelsen og migrering af vaskulære og lymfatiske endotelceller [15]. Nylige funktionelle undersøgelser af slottet kører og kolleger har vist, at blokering NRP-2 i et præklinisk lunge metastase forhindrede tumormetastase ved at blokere dannelsen af ​​tumorassocierede lymfekar [16].

Ekspressionen af ​​NRP-2 er blevet detekteret på tumorceller af patientprøver, mange tumortyper, herunder glioblastom, neuroblastom, og melanom. Vores laboratorium og andre har vist, at tumorcelle-afledt NRP-2 spiller en rolle i tumorvækst [10], [11]. Vi gik ud på at belyse den funktionelle rolle af NRP-2 og de signaleringsmekanismer, der medierer funktionen af ​​NRP-2 i GI cancerceller, herunder gastriske og carcinoid celler. Vi demonstrerer i denne undersøgelse, at NRP-2 er stærkt udtrykt af tumorceller i gastrisk carcinom væv og ved gastrointestinale cancercellelinier, men det er ikke detekterbar ved immunhistokemi i normal gastrisk mucosa. De mekanismer, som NRP-2 niveauer opreguleret i gastrointestinale kræftformer er fortsat uklare. Interessant Tsukamoto og kolleger [17] fandt, at 40% af mavecancerpatienter analyseret havde en forstærkning ved 2q33 (regionen, NRP-2-genet er placeret) ved opstilling komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse, hvilket tyder kopiantal aberration ( CNA) i denne region.

Vi udnyttet en shRNA-medieret RNA-interferens tilgang til at undertrykke NRP-2 ekspression i gastriske cancerceller til at undersøge de resulterende fænotypiske ændringer, herunder proliferativ, vandrende, og invasive aktiviteter. Knockdown af NRP-2 påvirkede ikke udbredelsen af ​​de CNDT 2,5 celler in vitro; Men tabet af NRP-2 reducerede væksten af ​​tumorxenoplantater

in vivo

. Forskellen mellem

in vitro

in vivo

væksthæmning kan skyldes NRP-2-medierede reaktioner fra celler i tumor mikromiljø ved tumorstedet

in vivo

der ikke er mærkbar i en

in vitro

system.

In vitro

studier yderligere vist, at der var en markant hæmning af både migration og invasion af cellerne. Brug metastase-associerede gener i en cDNA microarray analyse, identificerede vi S100A4, en central metastase mediator gen, at være signifikant nedreguleret efter NRP-2 lyddæmpning. S100A4 har tidligere været forbundet med metastase i flere eksperimentelle systemer [18], [19]. Nylige undersøgelser har vist, at S100A4 også kan bidrage til udviklingen af ​​kræft ved at forbedre celleoverlevelse funktioner. Mahon og kolleger [20] har vist, at S100A4 knockdown sensibiliserer bugspytkirtelkræftceller til gemcitabin behandling, ud over at aktiverende caspaser og PARP, hvilket resulterer i øget apoptose og cellecyklusstandsning. Vi observerede, nedregulering af NRP-2 i gastriske cancerceller chemosensitized cellerne til 5FU-behandling. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om NRP-2 medierer prosurvival funktioner i mavens celler kræft via S100A4.

Yderligere undersøgelse af NRP-2-medieret S100A4 regulering viste, at steady state niveauer og funktion af β-catenin, en direkte transkriptionel regulator af S100A4 blev kompromitteret i NRP-2 knockdown celler. En stor mængde data understøtter bidraget fra aktivering af β-catenin-signalvejen i udviklingen og progressionen af ​​cancere. Aktiveringen af ​​Wnt /β-catenin signalering er fundet i ca. 30% af gastriske cancere [21]. I en nylig undersøgelse, har Wang og kolleger [22] foreslået stabilisering β-catenin som en form for handling for ATDC-medieret onkogen funktion i kræft i bugspytkirtlen. Ved hjælp af en transgen musemodel, Oshima og kolleger [23] har vist, at samarbejdet mellem Wnt signalering og prostaglandin E

2 (PGE

2) vej forårsager mavekræft udvikling. Den vedvarende β-catenin-aktivering observeret i NCI-N87 celler skal være uafhængig af mutationer i APC og β-catenin-gener, fordi denne cellelinie ikke nære nogen iboende mutationer i hvert af disse gener. Den mekanisme, ved hvilken NRP-2 nedregulering påvirker denne vej er stadig uklar.

En mulig begrænsning af vores undersøgelse er, at vi analyserede væksten af ​​NRP-2 knockdown gastriske cancerceller som primære tumorer, men ikke vurdere metastase af tumorer. I betragtning af vores observation, at disse celler er faldet migration og invasion efter NRP-2 knockdown,

in vivo

metastatisk potentiale i disse celler behov udforskes i fremtiden. Yderligere undersøgelser er også klart behov for at belyse den potentielle mekanisme, der ligger dæmpningen af ​​β-catenin pathway af NRP-2 nedregulering. Dette er fortsat en stor uløst problem og er genstand for en igangværende undersøgelse i vores laboratorium.

NRP-2 er ved at opstå som en ny terapeutisk mål. I betragtning af den rolle NRP-2 i tumorceller migration og invasion, målretning NRP-2 tilbyder en potentiel hidtil ukendt tilgang til at inhibere væksten og overlevelsen af ​​cancerceller hos patienter med metastatisk sygdom. Også, fordi NRP-2 synes at have roller, der adskiller sig fra VEGF-familien af ​​receptorer, rettet NRP-2 forventes ikke at få det samme resultat som målrettet VEGF. Vi har fundet, at behandling af gastrointestinale cancerceller med bevacizumab har ingen effekt på β-catenin-ekspression (data ikke vist). Målretning NRP-2 kan derfor supplere og udvide de antitumor virkninger af terapier, der målretter VEGF, såsom bevacizumab.

Vi fandt, at NRP-2-medieret β-catenin-ekspression observeret i denne undersøgelse er ligand uafhængige. Denne ligand-uafhængig NRP2 signalering er roman dog; mekanismen (er) der medierer dette fænomen endnu ikke forstås. På nuværende tidspunkt kan vi kun spekulere på mekanismen (er) er involveret, baseret på dem dokumenteret for andre membranreceptorer. (I) Det er tænkeligt, at i tumorceller forøget ekspression af NRP2 på celleoverfladen resulterer i ligand-uafhængig aktivering af NRP2 medieret signalering gennem spontan NRP2 binding til VEGFR /plexin. (Ii) Alternativt ligand-uafhængig NRP2 signalering kunne også aktiveres via homo-dimerisering (eller heterodimerisering med NRP1) som i tilfældet med mange andre membranreceptorer. NRP er kendt for at danne homo- eller hetero-multimerer, selv i fravær af ligand gennem membranen-proximale c domæne. (Iii) En tredje mulighed påberåber aktivering via stien krydstale med andre membranreceptorer, men dette rejser spørgsmålet om, hvordan de postulerede receptorer aktiveres. I alle tilfælde, proteiner som associerer med NRP2, herunder neuropilin interagerende protein (NIP) /synectin, sandsynligvis vil være nøglen til ligand-uafhængig signalering.