PLoS ONE: FGFR3, HRAS, KRAS, nationale tilsynsmyndigheder og PIK3CA Mutationer i blærekræft og deres potentiale som biomarkører for tilsyns- og Terapi

Abstrakt

Baggrund

Halvtreds procent af patienter med muskel-invasiv blærekræft (MI-BC) dør af deres sygdom og nuværende kemoterapi kun marginalt øger overlevelsen. Nye behandlingsformer rettet mod receptortyrosinkinaser eller aktiverede onkogener kan forbedre resultatet. Derfor er det nødvendigt at stratificere patienterne baseret på mutationer i relevante onkogener. Patienter med ikke-muskel-invasiv blærekræft (NMI-BC) har fremragende overlevelse, men to tredjedele udvikler gentagelser. Tumor specifikke mutationer kan anvendes til at påvise gentagelser i urinanalyser, præsentere en mere patientvenlig diagnostiske procedure end cystoskopi.

Metode /vigtigste resultater

For at løse disse problemer, har vi udviklet en mutation assay til samtidig påvisning af 19 mulige mutationer i

HRAS

,

KRAS

, og

NTM

gener. Med denne analyse og mutation assays til

FGFR3

PIK3CA

onkogener, vi screenede primære blæretumorer af 257 patienter og 184 gentagelser fra 54 patienter. Derudover er der i primære tumorer p53-ekspression blev opnået ved immunohistokemi. Af primære tumorer 64% var mutant for

FGFR3

, 11% for

RAS

, 24% for

PIK3CA

, og 26% for p53.

FGFR3

mutationer var gensidigt udelukkende med

RAS

mutationer (p = 0,001) og co-opstod med

PIK3CA

mutationer (p

=

0,016). P53 overekspression var gensidigt udelukkende med

PIK3CA

FGFR3

mutationer (p≤0.029). Mutationer i

RAS

PIK3CA

gener var ikke prædiktorer for tilbagefald-fri, progressionsfri og sygdomsspecifikke overlevelse. I patienter med NMI-BC grad 3 og MI-BC, 33 og 36% af de primære tumorer var mutant. Hos patienter med lav-grade NMI-BC, 88% af de primære tumorer bar en mutation og 88% af tilbagefald var mutant.

Konklusioner /Betydning

mutation analyser præsentere en ledsager diagnostisk at definere patienterne for målrettede behandlinger. Desuden assayene er en potentiel biomarkør for at detektere gentagelser under overvågning. Vi viste, at 88% af patienter med lav kvalitet NMI-BC er berettiget til en sådan opfølgning. Dette kan bidrage til en reduktion i antallet af cystoscopical undersøgelser

Henvisning:. Kompier LC, Lurkin I, van der Aa MNM, van Rhijn BWG, van der Kwast TH, Zwarthoff EF (2010)

FGFR3

,

HRAS

,

KRAS

,

NTM

og

PIK3CA

Mutationer i blærekræft og deres potentiale som biomarkører for Surveillance og terapi. PLoS ONE 5 (11): e13821. doi: 10,1371 /journal.pone.0013821

Redaktør: Venugopalan Cheriyath, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: Juli 18, 2010; Accepteret: 13. oktober 2010; Udgivet: November 3, 2010

Copyright: © 2010 Kompier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af et Erasmus MC Breedtestrategie Grant (2002-2006) og Holland Organisation for Sundhedsforskning og Udvikling (ZON-MW, 945-02-046). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den femte mest almindelige kræftform i den vestlige verden [1]. Af de blæretumorer 15-20% præsenterer som muskel-invasiv sygdom (MI-BC), den resterende gruppe som ikke-muskel-invasive tumorer (NMI-BC). MI-BC er en ødelæggende sygdom siden over 50% af patienterne vil dø af metastatisk sygdom. For nylig har nye udviklinger i målrettede behandlinger ved hjælp af receptor tyrosinkinaseinhibitorer i andre typer kræft inspireret den mulige behandling af patienter med MI-BC med lignende adjuverende agenser [2]. For muskel-invasiv blæretumorer FGFR3 målrettet terapi overvejes [3], [4], [5], [6] og for nylig et fase II studie er begyndt at undersøge effekten af ​​TKI258, en FGFR3 hæmmer, hos patienter med fremskreden urotelial cancer (www.ClinicalTrials.gov NCT00790426). Ligeledes er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) ofte overudtrykt i blærecancer og kan derfor være et vigtigt terapeutisk mål for MI-BC [7], [8], [9]. I øjeblikket er EGFR målrettet behandling som undersøges for blærekræft i flere kliniske forsøg (CALBG-90102, NCT00088946, NCT00380029). Imidlertid er det for nylig blevet klart, at behandlinger rettet mod receptortyrosinkinaser måske ikke være effektiv, når tumorer havnen mutationer i RAS-MAPK eller PIK3CA-AKT veje nedstrøms for receptorerne [10], [11], [12], [13] , [14]. Alligevel stoffer som hæmmer mål nedstrøms i disse veje er i kliniske forsøg. Dette antyder, at screening blæretumorer for mutationer i gener, som

FGFR3

,

RAS

PIK3CA

kan være af betydning for fremtidige beslutninger terapi. En nem test, der kan implementeres i klinikken vil derfor være ønskeligt.

For ikke-muskel-invasiv blærekræft (NMI-BC), det største problem er, at efter indledende transuretral resektion af blæren (TURB) , 50-70% af patienterne udvikler flere gentagelser, med en chance på 10-20%, at de vil udvikle sig til MI-BC [15], [16], [17]. Den tilbagefald risiko og risikoen for progression kræver en livslang opfølgning cystoskopi. Den nuværende standard er at udføre en cystoskopi sammen med urin cytologi hver 3-4 måned i de første 2 år og to gange om året derefter [18]. Vi har for nylig vist, at i de nederlandske patienter med NMI-BC undergår i gennemsnit 20 cystoscopies i de første 9 års opfølgning [17], med en gentagelse påvist i kun én af syv af disse opfølgende øjeblikke. For USA og Europa med populationer af 300 og 450 millioner, vil dette beløbe sig til 1 og 1,5 millioner cystoscopies årligt. Reduktion af antallet af cystoscopies ved for eksempel en urin-baseret test er et vigtigt mål for at forbedre kvaliteten-of-life [19], [20], [21]. Desuden kunne det føre til omkostningsreduktion. Øjeblikket, blærecancer er den dyreste cancer type til behandling per patient [22], [23]. Men cytologi og mange af de for tiden udviklede urin biomarkører har begrænset følsomhed til påvisning af lave scene og lønklasse tumorer, der danner den største gruppe, der går igen (revideret i [24], [25], [26], [27], [28 ]). Derfor er der behov for mere følsomme urin biomarkører, der kan gennemføres i molekylær diagnostiske laboratorier.

NMI-BC og MI-BC er genetisk forskellige [29], [30]. NMI-BC tumorer er kendetegnet ved en høj frekvens af mutationer i

FGFR3

onkogen [31], [32] fører til konstitutiv aktivering af ras-MAPK-vejen [33], [34], [35] , [36], [37]. I MI-BC, mutationer i

TP53

gen forrang. Mutationer i

FGFR3

TP53

stort set udelukker hinanden tyder på, at NMI-BC og MI-BC udvikle sig forskellige onkogenese veje [38], [39]. Men i fase pT1 tumorer der invaderer bindevæv lag ligger til grund for urothelium, de ofte optræder sammen [32], [38], [39]. For nylig, somatiske mutationer i

PIK3CA

onkogen, som koder den katalytiske underenhed p110α af klasse-IA PI3-kinase blev beskrevet i 13-27% af blæretumorer [40], [41]. Disse mutationer ofte faldt sammen med

FGFR3

mutationer. Mutationer i

RAS

onkogener (

HRAS

,

KRAS

,

De nationale tilsynsmyndigheder

) er også blevet fundet i 13% af blæretumorer og forekom i alle etaper og kvaliteter [41], [42]. De var gensidigt udelukkende med

FGFR3

mutationer. Der findes imidlertid ingen data vedrørende prognostisk værdi, i form af gentagelse-fri, progressionsfri og sygdomsspecifikke overlevelse, af

RAS

PIK3CA

mutationer i blærekræft enten alene eller i kombination med andre rettelser. I nogle kræft typer

PIK3CA

mutationer er blevet associeret med invasionsevne og en dårligere prognose [11], [43], [44], [45], [46]. På den anden side er der eksempler på somatiske mutationer i godartede hudlæsioner der ikke sker fremskridt [47], [48]. Vedrørende ændringer i RAS og prognose, i de seneste undersøgelser er blevet udført på den prognostiske værdi af ekspression af RAS p21-protein, men resultaterne ikke var overensstemmende [49], [50], [51]. En nylig undersøgelse af ekspressionen af ​​

HRAS

i 48 PTA blæretumorer viste en omvendt korrelation udtryk værdi med recidiv og progression [52]. Men der er ingen oplysninger om den prognostiske værdi af mutationer i tre

RAS

gener i blærekræft.

Vi har for nylig vist, at med

FGFR3

mutation analyse på urin prøver fra patienter blærekræft det var muligt at påvise tilbagevendende tumorer [53], [54]. Den tekniske udførelse af

FGFR3

mutation assay i disse studier var fremragende. Sixty-tre procent af patienter med NMI-BC er mutant for

FGFR3

. Et yderligere mål med den foreliggende undersøgelse var at undersøge, om tilføjelse af

RAS

PIK3CA

mutation analyse til

FGFR3

mutation afsløring potentielt kunne øge andelen af ​​patienter, der kan være overvåget ved anvendelse urin-assays for disse mutationer. Desuden kunne disse assays være til nytte i klinikken til at definere patienter, som kan have gavn af målrettede behandlinger. Derfor har vi udviklet en multiplex mutation assay til påvisning af de hyppigst forekommende

HRAS

,

KRAS

, og

NTM

mutationer i blærekræft. Dette assay er baseret på analyser, som vi tidligere udviklet [53], [55], [56]. Det er vores erfaring, disse assays er følsomme, let at udføre og fortolke, og kræver kun nogle få nanogram DNA. Analyserne er også en succes på DNA fra formalin-fikseret paraffin indstøbt (FFPE) væv eller urin [53], [54], [56].

Vi efterfølgende undersøgt mutationen spektrum af

FGFR3

,

HRAS

,

KRAS

,

NTM

og

PIK3CA

i en stor serie af primære tumorer i 257 patienter med NMI-BC og MI- BC. Mutation status blev også sammenlignet med p53-ekspression. Fordelingen af ​​ændringer i disse seks gener sammen er ikke undersøgt i blæretumorer før. Vi screenede yderligere 184 gentagelser af 54 patienter at afgøre, om mutation status er konsekvent i gentagelser med det formål at undersøge, om det er nyttigt at starte en langsgående undersøgelse af overvågning med disse mutation assays til påvisning af tilbagevendende blærekræft i annulleret urinprøver fra patienter . Hyppigheden af ​​mutationer i

RAS

PIK3CA

i en langsgående indstilling indeholder multiple gentagelser af den samme patient har heller ikke endnu blevet undersøgt før.

Vi konkluderer, at mutationen analyser præsentere en følgesvend diagnostisk at stratificere patienter med MI-BC for målrettede behandlinger. Eftersom 88% af de primære tumorer i patienter med lav kvalitet NMI-BC gennemført en mutation i

FGFR3

,

RAS

, og /eller

PIK3CA

gener og 88% af de tilbagefald var mutant, assayene er et potentielt værktøj til påvisning af gentagelser i DNA opnået fra urinprøver under overvågning, som kan bidrage til en reduktion i antallet af cystoscopical undersøgelser og er værd at undersøge.

Metoder

Patient karakteristika og etik erklæring

Formalin-fikseret paraffinindlejret (FFPE) prøver af primære tumorer i en umarkeret gruppe på 257 patienter blev opnået fra Erasmus MC og St. Franciscus Gasthuis, Rotterdam, Holland. Tumorprøverne repræsenterer en undergruppe af 286 prøver, som vi tidligere beskrevet [32]. Ingen væv var tilgængelig længere for de 29 manglende prøver. Gennemsnitsalderen for denne gruppe patienter ved diagnose var 65,7 år og mænd /kvinder forholdet var 3/1. Tumorer blev iscenesat i henhold til Tumor Knude Metastase klassificering af 1997 [57] og kvaliteter blev klassificeret i henhold til World Health Organization kriterier for 1973 [58]. Blandt de primære tumorer, der var 166 PTA, 57 PT1, og 34 pT2-4 tumorer. Fordelingen klasse var 84 klasse 1, 117 grad 2 og 56 klasse 3 tumorer. Af 54 patienter, der blev behandlet på Erasmus MC og havde udviklet en eller flere gentagelser, blev formalin-fikseret paraffinindlejret væv indsamlet fra 184 på hinanden følgende gentagelser. Kliniske data for tumorerne blev opnået fra patientens sygehistorie. Data blev analyseret anonymt. FFPE prøver blev anvendt i overensstemmelse med de standarder, der præsenteres i “The Code for korrekt sekundær anvendelse af humane væv i Holland” (https://www.federa.org/). Informeret samtykke blev derfor ikke nødvendigt at opnås. Dette blev godkendt af vores Institutional Review Board. En gentagelse blev defineret som en tumor fjernet ved transuretral resektion, der senere blev bekræftet at være tumorvæv af en patolog. Tumorer fjernet inden for tre måneder efter transuretral resektion ikke blev betragtet som en gentagelse. Progression blev defineret som progression i scenen og /eller til lønklasse 3. Sygdom-specifik overlevelse blev defineret som tiden fra diagnose til død blærekræft. Opfølgning periode blev regnet fra tidspunktet for diagnosen. Censurering af patienterne fandt sted på deres sidste kliniske besøg eller når en patient døde. Generelt blev patienterne fulgt og behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne i den europæiske sammenslutning af Urology [18]. Den medicinske komité af Erasmus University og University Hospital Rotterdam godkendt undersøgelsen (METC 168,922 /1998/55).

DNA isolation og mutationsanalyse

Haematoxylin-eosin farvede objektglas blev brugt til histologisk diagnose og tjente som skabeloner til manuel mikro dissektion fra de respektive vævsblokke. De dissekerede tumorprøver indeholdt mindst 70% af tumorcellerne. Tumorprøver blev ekstraheret fra Formalin-fikseret paraffinindlejret tumorvæv ved de-voksning med xylen og ethanol. DNA blev isoleret under anvendelse DNeasy Tissue kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), i overensstemmelse med protokollen. P53, MIB-1 og p27

Kip1 immunfarvning blev opnået fra van Rhijn

et al.

[32].

primere for multiplex RAS-BC-assay blev udformet på en sådan måde at de enkelte strenge af PCR-produkterne indeholdt så lidt potentiel sekundær struktur som muligt for at lette en effektiv annealing af mutationen detektionsprober. Primer design blev yderligere til formål at opnå identiske annealingstemperaturer at tillade samtidig forstærkning af de relevante exons af de tre

RAS

gener i en PCR-reaktion. Desuden at regionerne amplificeres blev inspiceret for tilstedeværelsen af ​​polymorfismer i databasen af ​​National Center for Biotechnology Information. Ingen polymorfier i disse regioner blev observeret. Mutationsdetektion prober til multiplex detektering af

HRAS

,

KRAS

NTM

mutationer blev designet til at anneale til enten den fremadrettede eller den reverse streng støder direkte op til den potentielle mutationssite . Med assayet, 19 mulige mutationer i 10 kodoner i de 3

RAS

kan detekteres gener. Sammen tegner de sig for 96% af alle somatiske

HRAS

,

KRAS

NTM

mutationer findes i urothelial celle carcinomer ved Sanger Institute (www.sanger.ac.uk /genetik /CGP /kosmisk). At gøre det muligt at skelne proberne efter størrelse, blev poly (dT) haler med forskellige længder tilsat. Alle prober blev designet til at have lignende annealingstemperaturer og blev udvalgt for fravær af sekundære strukturer og baseparring med andre prober. Primer og probe sekvenser og koncentrationer for de tre multiplex mutation analyser for

FGFR3, nationale tilsynsmyndigheder, HRAS, KRAS

PIK3CA

er afbildet i figur 1 og 2.

Hver multiplex-PCR reaktionen blev udført i et totalt volumen på 15 pi indeholdende 0,17 mM dNTP’er (Roche, Basel, Schweiz), 1,5 mM MgCl2, 5% glycerol (Fluka, Buchs SG, Schweiz), 0,3-1,2 uM den passende primer kombination (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 × PCR-buffer, og 0,5 enheder af Go Taq-DNA-polymerase (Promega, Madison, WI), anvendelse af 5 ng genomisk DNA som template. Termisk cykling bestod af indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cykler af hver 95 ° C i 45 sek, 55 ° C i 45 sekunder og 72 ° C i 45 sek. Det sidste forlængelsestrin var 72 ° C i 10 min. Ikke-inkorporeret primere og deoxynukleotidtrifosfater blev fjernet fra PCR-produkter ved tilsætning af 2 enheder exonuklease I (Exol) og 3 enheder reje alkalisk fosfatase (SAP, USB, Cleveland, Ohio USA).

PCR-produkter blev efterfølgende analyseret for mutationer anvendelse af prober for hver af de mulige mutationssteder og SNaPshot® Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). De mutationsdetektion reaktioner blev udført i et totalt volumen på 10 pi indeholdende 2,5 pi snapshot Multiplex Ready Reaction Mix, 2 pi BigDye sekventering puffer, 1 pi probe mix og 1 pi SAP /Exol behandlede PCR-produkt. Forlængelsesreaktioner bestående af 25 cykler af denaturering ved 96 ° C i 10 sek og annealing /forlængelse ved 58,5 ° C i 40 sek, blev udført i et termisk cykliseringsapparat. Efter forlængelse blev overskuddet af mærkede dideoxynukleotid triphosphater fjernes ved behandling med 1 enhed reje-alkalisk phosphatase ved 37 ° C i 60 min og 72 ° C i 15 min. Ekstenderede primere blev denatureret ved 95 ° C i 5 minutter og separeret ved kapillær elektroforese på en automatisk sekvenator (ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA), og tilstedeværelsen eller fraværet af en mutation blevet identificeret af den fluorescerende mærkat på inkorporeret nukleotid. Nærmere oplysninger om farver af de mutante og vildtype-toppe er angivet i figur 2. Data blev analyseret under anvendelse GeneScan Analysis Software version 3.7 (Applied Biosystems) og GeneMarker Software version 1.7 (SoftGenetics LLC, State College, USA).

statistisk analyse

statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS statistisk pakke (version 15.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, 2003). Forskelle blev betragtet som signifikante, hvis p

0,05. Forholdet mellem mutation status og patologiske og kliniske variabler blev analyseret af t-test, Chi-square test og tosidede Fisher eksakte test. Gentagelse-fri, progressionsfri, og sygdomsspecifik overlevelse ved mutationel status blev analyseret ved anvendelse af Kaplan-Meier-kurver. De to-sidet log-rank test blev udført for at sammenligne kurverne.

Resultater

Blærekræft specifikke RAS-BC mutation assay

Somatiske mutationer i

HRAS

,

KRAS

NTM

gener i blærekræft påvirker codon 12, 13 og 61. for at lette påvisning af

RAS

mutationer har vi udviklet en multiplex RAS-BC mutation assay at skærme for 19 mutationer samtidigt, der repræsenterer 96% af alle mulige kendte mutationer i 3

RAS

gener i blærekræft (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Assayet kræver kun et par nanogram DNA og fungerer godt på DNA fra formalinfikseret væv. Figur 3 viser eksempler på RAS-BC assay med panel A repræsenterer vildtype situation og med specifikke mutationer afbildet i paneler B-D

Panel A:. Vildtype prøve, paneler B-D: prøver med mutationer. Placering af afhørte kodoner, nukleotider og gener er afbildet i bunden.

Mutationer i primære tumorer

Med RAS-BC assay og mutation analyser for

FGFR3

og

PIK3CA

, screenede vi primære blæretumorer af 257 patienter for mutationer (figur 4A). Samlet set 64% (164/257) af tumorerne indeholdt en

FGFR3

mutation, i alt 28 (11%) prøver var mutant for en af ​​de

RAS

gener og 61 (24 %) nærede en

PIK3CA

mutation. Tabel 1 viser typen af ​​de identificerede mutationer. Den hyppigste

RAS

mutationer var

KRAS

G12D og

HRAS

Q61R.

KRAS

HRAS

mutationer forekom med samme frekvens, mens

De nationale tilsynsmyndigheder

mutationer ikke var hyppige i blærekræft. I

PIK3CA

gen, mutationerne opstod primært i de spiralformede domæne codon E545K og E542K. Samlet set 18% (11/62) af det

PIK3CA

mutationer havde fundet sted i kinase-domæner og 82% i de spiralformede domæner. Vi har ikke registrerer ændringen E545A vejledende for en polymorfi i

PIK3CA

pseudogen, hvis funktion er ukendt [59]. I tre primære tumorer, to forskellige

FGFR3

mutationer var til stede (S249C sammen med A393E, G372C eller R248C). En primær tumor indeholdt to forskellige

PIK3CA

mutationer i de spiralformede domæner (E542K og E545K). Der var ingen indlysende samtidig forekomst eller gensidig eksklusivitet mellem de forskellige typer af

RAS

PIK3CA

mutationer.

Frekvenser i alle primære blæretumorer (A) (n = 257) og i specifikke tumor faser:. pTA /T1-G1 /G2 (B) (n = 194), pTA /T1G3 (C) (n = 29) og muskel-invasive tumorer (D) (n = 34)

De primære tumorer blev efterfølgende stratificeret i tre undergrupper baseret på scenen og lønklasse lav kvalitet NMI-BC tumorer (pTaG1-2 og pT1G2), high-grade NMI-BC (pTaG3 og pT1G3) og muskel-invasiv tumorer (≥pT2). I figur 4B-D, fordelingerne af

FGFR3

,

PIK3CA

RAS

mutationer i disse undergrupper er illustreret. I PTA-T1G1-2 gruppe 88% af de primære tumorer huser en mutation i mindst en af ​​de fem undersøgte onkogener. Screening for

PIK3CA

og de tre

RAS

gener øget procentsatserne mutant tumorer med 10% sammenlignet med

FGFR3

alene. I karakteren 3 og muskel-invasiv tumor grupper, den samlede procentdel af mutationer i onkogener er meget lavere med 33% og 36%, hhv. I klasse 3 tumorer, andelen af ​​

RAS

mutationer er relativt stor, mens

PIK3CA

mutationer er mere fremtrædende i musklen-invasive tumorer. Tilføjelsen af ​​

PIK3CA

RAS

assays resulterer i påvisningen af ​​13% yderligere mutant primære tumorer i klasse 3-gruppen og 15% i musklen-invasiv gruppe.

Samtidig forekomst af mutationer

fra 257 primære tumorer, 26% havde overekspression af p53, hvilket angiver missense mutationer. Når vi kombinerer onkogen mutationer med dem i

TP53

tumorsuppressorgen (tabel 2), fremgår det, at kun 27 tumorer (11%) var vildtype for alle undersøgte gener. Der var 9 primære tumorer med en co-forekomst af 3 ændringer. Der var en positiv association af mutant

FGFR3

med

PIK3CA

mutationer (p

=

0,016), med 77% af

PIK3CA

mutationer co- forekommer med

FGFR3

(figur 5).

FGFR3

mutationer var stærkt gensidigt udelukkende med

RAS

mutationer (p

=

0,001). Kun 3,5% af de primære tumorer indeholdt en mutation i begge gener. Interessant, den gensidige eksklusivitet af

FGFR3

RAS

mutationer forblev signifikant i undergruppen af ​​PTA /T1 G1 /2 primære tumorer, mens

PIK3CA

FGFR3

mutationer er væsentligt co-occurrent i grad 3 tumorer. Begge

FGFR3

PIK3CA

mutationer var gensidigt udelukkende med p53 overekspression (p

0.001 og p

=

0,029 henholdsvis).

RAS

mutationer ikke var gensidigt udelukkende med

PIK3CA

og p53 mutationer i den samlede kohorte, og heller ikke i forskellige undergrupper tumor fase og lønklasse.

Korrelationer af mutationer med stadium, klasse

Vi efterfølgende undersøgt forholdet mellem scenen og kvalitet, og de forskellige mutationer (figur 6). I primære tumorer var der en signifikant korrelation af

FGFR3

med lav scene og lønklasse og med en korrelation af p53 overekspression med høj scene og kvalitet, som tidligere [39] vist. Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem

RAS

mutation status og scene eller lønklasse. Fordelingen efter etape var 10% PTA (16 af 166), 18% PT1 (10 af 57), og 6% muskel-invasive tumorer (2 af 34). Med hensyn til

PIK3CA

, forekomsten af ​​mutationer var højere i lav kvalitet tumorer: 30% grad 1 (25 af 84), 23% grad 2 (27 af 117), og 16% grad 3 (9 af 56 ), men denne forening var ikke statistisk signifikant (p = 0,061). Ingen sammenhæng med stadium blev observeret.

Korrelationen af ​​disse ændringer i de primære blæretumorer af 257 patienter med stadie (A) eller klasse (B) er angivet med p-værdier (χ

2).

prognostiske værdi

Fifty-ni procent (154/257) af patienterne i vores undersøgelse udviklede en eller flere gentagelser, 10% havde progression i scenen og /eller grad 3, 19% døde af sygdommen. Ingen af ​​de undersøgte ændringer i

FGFR3

,

RAS

,

PIK3CA

p53 i den primære tumor var en prædiktor for udvikling af en gentagelse (gentagelse overlevelse p 0,05). Mutation hyppigheden af ​​

PIK3CA

hos patienter med tilbagefald var ens i forhold til patienter uden gentagelser 24% (37/154) versus 23% (24/103). For

RAS

mutationer, disse frekvenser var 12% og 10%. Der var også nogen relation mellem mutationen status

RAS

PIK3CA

og gentagelse sats. Som vi viste tidligere, patienter med en

FGFR3

mutant primær tumor har en lavere risiko for progression og en bedre sygdomsspecifik overlevelse, mens patienter med p53 overekspression har høj risiko for progression og lav sygdomsspecifik overlevelse [32 ], [39]. Men

PIK3CA

eller

RAS

mutationer var ikke signifikant associeret med progression (p

=

0,129, p

=

0,694) eller sygdomsspecifikke overlevelse (p

=

0,205, p

=

0,447) i hele kohorten, heller ikke i forskellige undergrupper tumor fase og lønklasse. Kombinere

RAS

PIK3CA

mutation status forudsat lignende resultater. Desuden tilføjer

RAS

eller

PIK3CA

mutation status til

FGFR3

eller p53 resulterede ikke i en bedre forudsigelse af tilbagefald-fri, progressionsfri eller sygdomsspecifikke overlevelse sammenlignet med

FGFR3

eller p53 alene. Der var heller ingen signifikant korrelation mellem individ

RAS

isoformer og

PIK3CA

mutationer i spiralformede eller kinase domæner med scenen, lønklasse eller recurrence-, progressionsfri, og sygdomsspecifik overlevelse. Endvidere blev ingen signifikant korrelation fundet mellem

RAS

eller

PIK3CA

mutationer og ændret Ki-67 (p = 0,413, p = 0,227) eller p27

Kip1 (p = 0,126 og p = 0.580) udtryk, markører indikative for en dårligere prognose i blærekræft [60], [61].

Frekvensen af ​​mutationer i gentagelser

fra 54 patienter, der blev behandlet på Erasmus MC og havde udviklet en eller flere gentagelser, væv var til rådighed af 184 tilbagefald (herunder multifokale gentagelser). Her ønskede vi at undersøge, om mutation status fortsætter i flere gentagelser af de samme patienter med det formål at undersøge, om det er værdifuldt at starte en fremtidig langsgående undersøgelse om overvågning med mutationsanalyserne ved at analysere urinprøver. Vi har kun undersøgt mutation status for de gener, som vi har udviklet øjebliksbilledet baseret mutation assay (dvs.

FGFR3

,

PIK3CA

RAS

). P53 overekspression blev ikke bestemt i gentagelser. Hyppigheden af ​​p53-overekspression var også lav (6/54) i de primære tumorer i denne gruppe patienter hovedsageligt bestående af NMI-BC tumorer. En detaljeret oversigt over scenen, kvalitet og mutation status af disse tumorer er præsenteret i figur 7. Hos patienter med en vildtype primær tumor, tilbagefald var for det meste vildtype (49/54 gentagelser), mens 5 nærede en

FGFR3

mutation. Et tilbagevendende tumor indeholdt to forskellige

PIK3CA

mutationer (E542K og E545K). Interessant nok i gentagelser

PIK3CA

mutationer i tillæg til en

FGFR3

mutation var forbundet med højere lønklasse end gentagelser huser en

FGFR3

mutation alene (p = 0,012). Hvis vi stratificere for patienter med en mutant primær tumor, 81% af tilbagefald var også mutant og de enkelte frekvenser var 75% (98/130) for

FGFR3

, 23% (30/130) for

PIK3CA

, og 10% (13/130) for

RAS

. Interessant, var der en 100% konsistens i den type mutation for

RAS

PIK3CA

mellem forskellige tumorer i den samme patient. Vi tidligere observeret, at nogle tilbagefald var vildtype, når den primære tumor var mutant for

FGFR3

[17]. I den foreliggende undersøgelse, var der 20 af 130 gentagelser (15%) i en undergruppe af patienter med en mutant primær tumor, der havde udviklet sig til grad 3, CIS eller muskel-invasiv blærekræft (figur 7). Af disse 90% (18/20) var mutant, og derfor kunne detekteres med mutationsanalyse. De vildtype gentagelser i denne patientgruppe ikke fremskridt oftere end de muterede gentagelser; 8% (2/25) af de vildtype-gentagelser havde udviklet sig til CIS og grad 3 (figur 7), sammenlignet med 17% mutant gentagelser. En af disse vildtype gentagelser co-opstod sammen med to mutant tumorer. Vi yderligere bestemmes den tid punkt, hvor vildtype-tilbagefald forekom under opfølgning. De fleste af de vildtype gentagelser (18 af 25) co-opstået sammen med en mutant recidiv eller blev senere efterfulgt af en mutant gentagelse, mens 7 opstået som vildtype alene i slutningen af ​​opfølgningsperioden, når der ikke yderligere data var tilgængelig

A:. mutant primære tumorer og deres gentagelser; B: vildtype primære tumorer og deres gentagelser. Den første kolonne angiver den primære tumor. De successive felter angiver tidsmæssigt sekventielle gentagelser fjernet i forskellige transurethrale resektioner (angivet med et sekvensnummer på toppen). Multifokale tumorer fjernet ved samme transuretral resektion er placeret under hinanden. Stage og kvalitet af de tumorer, mutation status (indikeret med en farve) og patient-ID af de 54 patienter er angivet.

Et af formålene med denne undersøgelse var at undersøge, om de mutationsanalyserne er en potentiel værktøj til påvisning af gentagelser for at reducere antallet af cystoscopical undersøgelser og om det er nyttigt at indlede en stor langsgående undersøgelse med disse mutation assays til påvisning af recidiverende blæretumorer anvendelse af DNA ekstraheret fra urin celler. Patienter, der er berettiget til en sådan opfølgning er dem, der præsenterer med en mutant pTaG1-2 eller pT1G2 primær tumor. Til denne undergruppe af patienter hyppigheden af ​​mutationer i

FGFR3

,

PIK3CA

RAS

gener når optalt pr recidiv begivenhed (dvs. i tilfælde af flere tumorer fjernes ved transuretral resektion, mutationsdata kombineredes) er illustreret i figur 8. figuren viser, at en mutation i denne gruppe patienter er til stede i 88% af de tilbagefald begivenheder.