PLoS ONE: Ekspression af Foxp3 i kolorektal cancer, men ikke i Treg Celler korrelerer med Disease Progression i patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Regulatory T-celler (Treg), der udtrykker transskription faktor forkhead-box-protein P3 (Foxp3) er blevet identificeret til at modvirke anti-tumor immunrespons under tumorprogression. Desuden, Foxp3 præsentation ved cancerceller selv kan også tillade dem at unddrage sig fra effektor T-celle-reaktioner, hvilket resulterer i en forøget overlevelse af tumoren. For kolorektal cancer (CRC) den kliniske relevans af Foxp3 ikke er blevet evalueret i detaljer. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at undersøge dens virkning i kolorektal cancer (CRC).

Metoder og Resultater

Gene og protein analyse af tumorvæv fra patienter med CRC blev udført for at kvantificere udtryk af Foxp3 i tumorinfiltrerende Treg og coloncancerceller. Resultaterne blev korreleret med klinisk-patologiske parametre og patienter samlet overlevelse. Seriel morfologisk analyse viste Foxp3 at blive udtrykt i cancerceller. Høj Foxp3 ekspression af kræftcellerne var associeret med dårlig prognose sammenlignet med patienter med lav Foxp3 ekspression. I modsætning hertil lav og høj Foxp3 niveau i tumor infiltrerer Treg-celler viste ingen signifikante forskelle i den samlede patient overlevelse.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at Foxp3 udtryk medieret af kræftceller end af treg celler bidrager til sygdomsprogression

Henvisning:. Kim M, Grimmig T, Grimm M, Lazariotou M, Meier E, Rosenwald A, et al. (2013) Ekspression af Foxp3 i kolorektal cancer, men ikke i Treg Celler korrelerer med Disease Progression i patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10,1371 /journal.pone.0053630

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: November 7, 2011; Accepteret: December 3, 2012; Udgivet: januar 30, 2013 |

Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

identifikation af CD4 + CD25 + T regulerende celler ( treg) har vist sig at spille en afgørende rolle i opretholdelsen immunologisk tolerance. Transskriptionsfaktoren forkhead kasse protein P3 (Foxp3) er blevet identificeret som en central aktør i treg funktion og er en obligat markør af CD4 + CD25 + treg [1]. Nogle underklasser af Treg udøver deres suppressive påvirkning via ekspressionen af ​​immunosuppressive cytokiner, såsom interleukin (IL) -10 og transformerende vækstfaktor (TGF) -β [2], [3]. En høj tæthed af tumor infiltrerer Foxp3 + treg i tumor enhed er forbundet med dårlig resultat i forskellige solide tumorer, herunder ovariecancer [4], pancreas [5], og hepatocellulært carcinom [6]. Disse resultater tyder på en afgørende rolle for treg i forskellige tumor enheder. Således målrettet treg kan have en betydelig indvirkning på immunterapeutiske strategier anti-cancer og det kliniske resultat af kræftpatienter [7].

treg mistænkes for at reducere T-celle aktivitet, men det vides ikke, om tilstedeværelsen af ​​treg kan have en indvirkning på det kliniske forløb og på tumor relateret overlevelse af patienter med CRC. Den prognostiske betydning af treg opdagelse hos patienter med begrænset og avanceret sygdom er fortsat stadig kontroversielt. Til dato har kun få studier analyseret infiltrerende treg i CRC hjælp Foxp3 + farvning. En nylig undersøgelse viste, at Treg tæthed var højere i lokalt begrænset end i metastatisk sygdom, men var ikke forbundet med overlevelse CRC patienter [8]. I modsætning til de observerede i de fleste andre menneskelige karcinomer fund, blev ingen signifikant sammenhæng mellem det absolutte antal Foxp3 + infiltrerende T-celler og prognose observeret i flere undersøgelser med CRC patienter. Desuden nogle andre undersøgelser tyder på, at en høj frekvens af tumor infiltrerer Foxp3 + treg er forbundet med gunstige prognose i CRC [9].

Nyere kliniske data fra lunge [10], bryst [11], [12] , pancreas [13], hepatocellulært [14], og urinblære kræft [15] samt melanom [16], forudsat første beviser for en Foxp3 udtryk også i tumorceller. Men den biologiske betydning af Foxp3 ekspression i cancerceller fra patienter med CRC er fortsat ukendt. Navnlig har bidraget fra Foxp3 Udtryk med relation til tumorceller i sammenligning med ekspressionen relateret til Treg i klinisk CRC ikke evalueret hidtil. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at evaluere Foxp3 ekspression mellem tumorinfiltrerende Treg og cancerceller hos patienter med CRC på forskellige stadier af sygdommen samt at diskriminere sin prognostisk betydning på lang sigt.

Resultater

Påvisning af CD4, CD25, Foxp3 og immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-beta gener ved RT-qPCR og immunhistokemisk analyse

for at analysere, om CD4, CD25, Foxp3, IL-10, og TGF-β-ekspression i CRC kan være forbundet med klinisk tumorprogression undersøgte vi tumorer i begrænset sygdom (UICC i /II) og fremskreden sygdom (UICC III /IV). RT-qPCR analyse viste signifikant forøget genekspression af CD4 og CD25 i begrænsede sygdomstilstande tumorer (UICC I /II) sammenlignet med tumorer af fremskreden sygdom (UICC III /IV). I overensstemmelse med dette fund blev genekspression af Foxp3 og immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-β faldt betydeligt i begrænsede sygdomstilstande tumorer (UICC I /II) sammenlignet med dem af fremskreden sygdom (UICC III /IV) (

Figur

1A

).

(A) Markant øget genekspression af CD4 og CD25 på scenen UICC i /II i forhold til tumorer på stadium UICC III /IV. Genekspression af Foxp3, IL-10, og TGF-β blev signifikant nedsat ved trin I /II i forhold til dem på UICC III /IV. Normaliseringen blev udført med normalt væv. Den relative kvantificering værdi, fold forskel udtrykkes 2

-ΔΔCt. * P 0,001. (B) Foxp3 +, IL-10 +, og TGF-β + udtrykkende cancerceller steg fra UICC I /II til UICC III /IV forhold til normalt væv. Resultatet af farvningen blev udtrykt i procent (%) positivitet. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD; alle parvise tests (Tukey) resultere i p 0,001 med undtagelse af kontrol vs. UICC I /II i Foxp3

+ (p 0,050).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​Foxp3 og immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-β i cancerceller. Som vist i

Figur

1B

, Foxp3 +, IL-10 +, og TGF-β + udtrykke kræftceller steg fra tidligt til sene stadier af sygdommen sammenlignet med normalt væv. Foxp3

+ udtrykkende cancerceller blev fundet i 60 ud af 65 tumor tilfælde (n = 60/65, 92,3%). Desuden har vi farves 36 af de samlede 65 tilfælde med en anden anti-Foxp3 antistof (klon 2481) og bekræftede resultaterne (data ikke vist).

Immunohistokemisk analyse af CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, og immunosuppressive cytokiner IL -10+ og TGF-β + i Treg

Vi undersøgte dernæst Treg og cancerceller for en detaljeret ekspressionsanalyse af Foxp3, IL-10, og TGF-β ved immunhistokemi. Først undersøgte vi ekspressionen af ​​CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, og immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-beta i treg. Som vist i

Figur

2A

, øget CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, IL-10 +, og TGF-β + ekspression blev observeret i begrænsede sygdomstilstande tumorer (UICC I /II) sammenlignet til avancerede sygdom tumorer (UICC III /IV) og normalt væv. Samlet set blev Foxp3 + udtrykkende Treg i forskellige mængder fundet i 61 ud af 65 tumorer i patienter (n = 61/65, 93,8%). Immunofluorescens dobbelt farvning viste, at Foxp3 + treg var af en CD4 + T-celle fænotype (

Figur

2B

). Kun en meget lille del af mindre end 5% af cellerne viste sig at repræsentere en CD8 + T-celle subpopulation udtrykker Foxp3 (data

ikke vist

).

(A) Øget CD4 +, CD25 +, Foxp3 + IL-10 +, og TGF-β + udtryk på scenen UICC i /II i forhold til dem på UICC III /IV. Resultatet af farvningen blev udtrykt i procent (%) positivitet. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD. Alle parvise test resulterer i p 0,001 med tre undtagelser: Foxp3

+, kontrol vs. UICC III /IV, p = 0,091; IL-10

+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,021; TGF-ß

+, UICC I /II vs. UICC III /IV, p = 0,020. (B) repræsentativt eksempel på en immunfluorescens dobbelt farvning af Foxp3 + og CD4 + i Treg. Foxp3 udtryk blev hovedsageligt observeret på CD4 + treg (pil) (× 400 forstørrelse). FITC, grøn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin rød, og DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Nuklear kontrastfarvning

Gen og protein analyse af Foxp3 ekspression i cancerceller fra patienter med CRC og i humane colon cancer cellelinier ved RT-qPCR, immunfluorescens dobbelt farvning og flowcytometri

først demonstrerede vi Foxp3 udtryk i kræftceller fra patienter med CRC hjælp immunofluorescens dobbelt farvning (

Figur

3

). For at bekræfte Foxp3 udtryk i tumorceller udførte vi RT-qPCR, FACS-analyse og immunofluorescens dobbelt farvning analyser i forskellige humane coloncancer-cellelinjer (SW480, SW620, og HCT-116). Som det fremgår af FACS 3,8% til 6,1% af kræftcellerne faktisk udtrykte Foxp3 (

Figur

4A og B

).

G

ene analyse af RT-qPCR bekræftede sit udtryk (relativ udtryk i cellelinjer lå mellem 1,76 og 2,08,

Tabel

1

).

repræsentativt eksempel på en immunfluorescens dobbelt farvning, som viser Foxp3 ekspression og EPCAM costaining i cancerceller fra patienter med CRC (× 100 forstørrelse ovenfor; × 400 forstørrelse nedenfor). FITC, grøn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3, indocarbocyanin rød og DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid blå -. Nuklear kontrastfarvning

(A) flowcytometriassayet af Foxp3 ekspression i SW480, SW620, og HCT-116 colon cancer cellelinjer sammenlignet med isotypekontrol. 3,8% til 6,1% af tyktarmskræft celler udtrykker Foxp3; PE: phycoerythrin; FS: forward scatter lineær. (B) Repræsentative eksempler på immunofluorescens dobbelt farvning af Foxp3 + ekspression i SW480, SW620, og HCT-116 cancerceller. Cy3, indocarbocyanin rød og DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2 phenylindoldihydrochlorid blå -. Nukleare kontrastfarvning (× 400 forstørrelse)

Korrelation af Foxp3 + cancerceller med ekspressionen af ​​immunosuppressive cytokiner IL -10 og TGF-β

for at undersøge, om forekomsten af ​​de immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-β svarede med Foxp3 + udtrykker kræftceller vi stratificeret i to forskellige grupper efter de procentsatser udtryksformer i immunhistokemiske analyse. I betragtning Foxp3 + udtryk i kræftceller som en kontinuerlig variabel viste regressionsanalyse at Foxp3 + kræftcelle udtryk havde en svag, men signifikant direkte sammenhæng med forekomsten af ​​de immunosuppressive cytokiner IL-10 (R

2 = 0,23, p 0,001, n = 65; r = 0,48) og TGF-β (R

2 = 0,33, p 0,001, n = 65; r = 0,57) (

Figur

5A og B

) .

(A /B) betydelig korrelation af Foxp3 + kræftcelle udtryk med ekspressionen af ​​IL-10 (A) og TGF-β (B). Regressions analyse; R

2, determinationskoefficienten. (C /D) repræsentativt eksempel på en immunfluorescens dobbelt farvning af IL-10 + (C) og TGF-β + (D) i Foxp3 + kræftceller (pile). FITC grøn Fluoresceinisothiocyanate, Cy3 rød og DAPI 4 ‘, 6-diamidino-2 phenylindoldihydrochlorid blå -. Nukleare kontrastfarvning

Immunofluorescens dobbelt farvning indikerede udtryk for de immunosuppressive cytokiner IL-10 og TGF-beta i foxp3 + udtrykke kræftceller (pile) (

Figur

5C og D

).

Korrelation af foxp3 + Treg med foxp3 + cancerceller

for at undersøge, om foxp3 + treg udtryk svarede med Foxp3 + kræftcellen udtryk, vi stratificeret to forskellige grupper efter procenter udtryk for immunhistokemisk analyse. I betragtning af Foxp3 + kræftcellen udtryk som en kontinuerlig variabel viste regressionsanalyse at Foxp3 + kræftcelle udtryk havde en svag, men signifikant omvendt sammenhæng med Foxp3 + treg udtryk (R

2 = 0,17, p = 0,01, n = 65; r = -0,41) (

Figur

6A

). Immunhistokemi viste øget Foxp3 + treg udtryk i Foxp3 negativ cancer stromale væv (pil) (

Figur

6B

). I modsætning hertil var der ingen eller ubetydelig Foxp3 + treg udtryk findes i Foxp3 positiv kræftvæv (pil) (

Figur

6C

).

(A) Signifikant omvendt korrelation af foxp3 + kræftcelle ekspression med foxp3 Treg ekspression. Regressions analyse; R

2, determinationskoefficienten. (B) Øget antal Foxp3 + treg i Foxp3 negative kræftvæv (pil). (C) Kun lejlighedsvis eller ingen Foxp3 + treg i Foxp3 positiv kræftvæv (pil). DAB brun farve, Haemalaun blå farve – nuklear kontrastfarvning. Repræsentativt eksempel demonstrerer område forstørrelser x100 (til venstre) og x200 (til højre).

Samlet overlevelse

Multivariat Cox regressionsanalyse blev udført trinvis herunder alder, køn, primær tumor (colon eller rektum), UICC (i /II eller III /IV), dybde tumorinvasion (T kategori 1/2 eller 3/4), differentiering (1/2 eller 3/4), lymfeknudemetastase (N kategori), Foxp3 (%), treg (%), TGF-ß (%), og IL-10 (%). Den trinvise procedure holdt i modellen N kategori og Foxp3 udtryk i kolon kræftceller som prognostiske parametre (Chi-quadrat statistik, p 0,01,

Tabel

2

).

Univariate resultater ved hjælp af Kaplan-Meier

De identificerede prognostiske faktorer fra Cox regressionsmodellen er præsenteret i figur 7A og C. Den gennemsnitlige værdi af Foxp3 + kræftcelle udtryk ved immunhistokemisk analyse for alle undersøgte vævsprøver af de 65 tumorer blev bestemt ved 16%. Blandt patienter med CRC, dem med høj Foxp3 + kræftcelle udtryk ( 16%) havde en dårligere prognose end dem med lave Foxp3 + udtryk niveauer ( 16%) (p 0,001, Log-Rank test) (

Figur

7A

og

tabel

3

).

(A) Patienter med højt Foxp3 + kræftcelle udtryk ( 16%, som gennemsnit cut-off) havde en dårligere prognose end dem med lave Foxp3 + kræftcelle udtryk profiler ( 16%; betyde cut-off: 16%), (p 0,001, Log-Rank test). (B) Ingen signifikant forskel i den samlede overlevelse sammenligne patienter med lav og høj Foxp3 + Treg udtryk profiler (betyder cut-off: 12%), (p = 0,202, Log-Rank test). (C) Patienter med lymfeknude metastaser havde en dårligere prognose end dem uden lymfeknude metastaser (p 0,001, Log-Rank test). Tiderne for de censurerede data er angivet med korte lodrette linier.

I betragtning immunhistokemisk analyse af prøverne fra de 65 vævsprøver for Foxp3 + treg udtryk middelværdien blev opgjort til 12%. Der var ingen signifikant forskel i den samlede overlevelse sammenligne patienter med lav og høj Foxp3 + Treg ekspressionsniveauerne ( 12% eller 12%) (p = 0,204, Log-Rank test) (

Figur

7B

og

tabel

3

).

Hos patienter uden lymfeknude metastaser var signifikante forskelle i samlet overlevelse sammenlignet med patienter med lymfeknude metastaser. (p 0,001, Log-Rank test) (

Figur

7C

)

Andre parametre såsom TGF-ß, IL-10, UICC, og T kategori viste desuden betydelige forskelle i den samlede overlevelse for den tilsvarende lavere udtryk og sortering, henholdsvis (p 0,001, log-rank test)

Alder, køn, primær tumor, og histologisk differentiering blev ikke forbundet med. prognose i univariate analyser.

diskussion

den nuværende undersøgelse giver for første gang tegn på en signifikant øget tumor-relaterede udtryk for transskription faktor Foxp3 i kolorektal kræftceller, der er forbundet med negativ prognose . Detaljeret protein og gen-analyse blev anvendt til at undersøge dens udtryk profiler i hver tumor væv af patienterne. Baseret på mere nylig beskrevet kliniske resultater af en Foxp3 udtryk i cancerceller af tumorer som lunge, hepatocellulær og urin blærekræft samt melanom vi foreslog, at forhøjede Foxp3 ekspressionsniveauerne ikke nødvendigvis forbundet til Treg alene, men også til kræftceller [10 ], [14], [15]. Ekspression af Foxp3 af cancerceller, ville de kunne nedregulere effektor T-cellereaktioner mod tumoren. Dette ville give klinisk evidens for en effektiv mekanisme for en direkte tumor-afledt unddragelse fra immunologiske ødelæggelse i CRC. Ved at diskriminere Foxp3 udtryk for kræftceller i at infiltrere Treg og korrelerer med total overlevelse over en langsigtet opfølgning vi give ny indsigt i sin prognostisk betydning.

I overensstemmelse med tidligere undersøgelser i forskellige maligne sygdomme fandt vi signifikant højere antal infiltrerende Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) i alle CRC prøver sammenlignet med normale colonvæv [4] – [6], [17] – [20]. Men sammenslutningen af ​​Foxp3 udtryk i Treg og dens indvirkning på den samlede overlevelse stadig kontroversielt. Tvetydige data antyder, at tumor infiltration med Foxp3 + Treg ikke er altid forbundet med en dårlig prognose, men tværtimod kan være forbundet med en forbedret prognose i nogle cancertyper som i CRC [8], [9], [21], [22]. Desuden blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem det absolutte antal Foxp3 + treg og prognose i CRC [23], [24]. Forbedret overlevelse og potentielt beskyttende rolle Treg kan forklares ved deres evne til at reducere udviklingen af ​​en aggressiv og cytotoksisk, potentielt proliferogenic cytokin miljø, som er grundlaget for en betændelse-drevet fremskridt af maligne sygdomme [25], [26] .

Eksperimentelle undersøgelser af mus viste, at CD4 + CD25 + treg ikke kun spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​immunologisk tolerance men at treg er også kraftige inhibitorer af antitumor immunresponser [27], [28]. Tidligere undersøgelser har undersøgt de undertrykkende kapacitet CD8 + CD25 + Foxp3 + T-celler i kolorektale cancer væv [29]. I CRC prøver det absolutte antal CD8 + CD25 + Foxp3 + T-celler var lave ( 5%). Desuden er disse celler var fraværende i de fleste normale vævsprøver men til stede i de fleste CRC prøver; men deres kliniske relevans er ukendt [29]. Flere grupper observerede Foxp3 udtryk af forskellige cancertyper og dens potentielle rolle på immun overvågning ved at producere immunosuppressive cytokiner såsom IL-10 og TGF-β [30].

Endelig har vi analyseret den samlede overlevelse af patienter med lav eller høj Foxp3 + treg infiltration i tumoren i sammenligning med overlevelsen af ​​patienter med lavt eller højt Foxp3 ekspression af deres kræftceller. Disse patienter med forhøjet Foxp3 + udtryk profil i kræftceller var forbundet med en dårligere prognose end patienter med lav udtryk profil Foxp3 + i deres kræftceller. Denne korrelation af høj Foxp3 ekspressionsmønster med dårlig prognose blev ikke observeret for infiltrerende Treg i tumoren. Cancerceller ekspression af Foxp3 efterfulgt af sekretion af immunosuppressive cytokiner i mikromiljøet af tumorvævet kan give tumoren et kraftfuldt værktøj til at omgå immunologisk ødelæggelse. Interessant nok blev en omvendt korrelation mellem antallet af Foxp3 + Treg og niveauet af Foxp3 + cancerceller observeret i vore patienter med CRC antyder en anti-proliferativ virkning af TGF-β på Treg.

Som konklusion, selv om at prøvens størrelse i denne kohorte er lille til at drage endelige konklusioner, vores undersøgelse viser for denne første gang, at høj Foxp3 udtryk i kræftceller er associeret med en dystre prognose i CRC. Multivariat Cox regressionsanalyse viste lymfeknude metastaser (N kategori) og Foxp3 udtryk i kolon kræftceller som væsentlige prognostiske parametre for overlevelse i human CRC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Etisk godkendelse til denne forskning blev opnået fra human Research Ethics Committee fra University of Würzburg. Alle patienter, der leverer tumorvæv samt normale kolon vævsprøver underskrevet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjernelse af tarmkræft at give mulighed for denne forskning, der skal gennemføres.

Patienter og kontroller

Sixty- fem patienter med histologisk bekræftet CRC kræft gennemgår kurativ kirurgisk resektion i vores afdeling mellem 01/2001 og 06/2004 blev inkluderet i undersøgelsen. Den histologiske fase af tumor blev bestemt ifølge Union Internationale Contre le Cancer (UICC) -TNM staging-systemet [31]. Tumorer blev bedømt for placering, fase, og differentiering kvalitet. Data vedrørende alder, køn, grad af væggen infiltration, og lymfeknudemetastase blev opsamlet i en database. Regelmæssige lægebesøg af patienter efter kurativ terapi blev udført med intervaller i henhold til de statslige retningslinjer for tumor patienter. Patienter, som gennemgik nogen neoadjuverende behandling eller R1 resektion blev udelukket fra analysen. Tumor vævsprøver såvel som normale colon vævsprøver fra patienter blev frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Normale kolon væv fra raske individer fungerede som kontroller (n = 10). Immunhistokemisk analyse bekræftede, at der ikke analyserede tumor fra patienten kohorte udtrykte hMLH1 og hMSH2 vejledende for mikrosatellit instabilitet (positiv mismatch repair [MMR] status). Den mucinøs fænotype af CRC kan være forbundet med falske positive subcellulære reaktioner fra immunhistokemi og blev derfor udelukket fra vores undersøgelse. Kliniske karakteristika af studiepopulationen er sammenfattet i

Tabel 3

. Alle patienter gennemførte mindst en 60 måneder opfølgning efter resektion.

Cell kultur

menneskelige tyktarmskræft cellelinjer SW620, SW480, og HCT-116 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA ) og celler blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2 anvendelse af RPMI 1640 medium (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad , CA), 1% (v /v) L-glutamin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) og 1% (v /v) penicillin /streptomycin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland).

Flowcytometri analyse (FACS)

Kræftceller fra det menneskelige kolon cancer cellelinjer SW620, SW480, og HCT-116 blev høstet ved en eksponentiel vækstfase ved hjælp enzym fri celledissocieringsopløsning (Merck Millipore, Billerica, MA) og analyseret for Foxp3 ekspression. Efter vask med dPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) to gange, 5 × 10

5-celler blev behandlet med Foxp3 farvning buffer kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) ifølge producentens instruktioner og inkuberet med PE- konjugeret antistof Foxp3 eller IgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Fluorescensen af ​​Foxp3 blev målt og analyseret med et FACS flowcytometer (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, USA).

Immunohistokemisk og immunfluorescensfarvning

CD4 og CD25 antistoffer blev leveret af Dako (Hamborg, Tyskland). To forskellige Foxp3 antistof-kloner (ab22510 monoklonalt muse og ab2481 ged polyklonale) blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, UK), TGF-β-antistof blev leveret af Serotec (Düsseldorf, Tyskland), og IL-10-antistof med R & D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Tyskland). Isotypekontrolantistoffer blev købt hos eBioscience (San Diego, USA). Sekundære antistoffer anvendt til immunfluorescens dobbelt farvning og immunohistokemi blev leveret af Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Suffolk, England). Sekundær EPCAM og CD4-antistoffer var FITC-konjugeret AffiniPure Donkey anti-gede-IgG og sekundært antistof ifølge Foxp3, IL-10, og TGF-β var Cy3-konjugeret AffiniPure Donkey anti-mus IgG ved en 1:200 fortynding (Jackson ImmunoResearch).

For cytospinpræparater kolorektal carcinom celler fra patienter med CRC blev dyrket i kortsigtede primære kulturer og etablerede humane colon cancer cellelinjer blev høstet ved en eksponentiel vækstfase ved hjælp enzym fri celledissocieringsopløsning (Merck Millipore, Billerica , MA). Efter vask med dPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) to gange blev cellerne justeret til en koncentration på 2 × 10

5 celler /ml. Cytospins blev udført med 50 pi cellesuspension ved 550 rpm i 1 min i en Cytospin4 cytocentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

farvning af CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, og IL- 10 blev udført på serielle frysemikrotomsnit af de 65 snap-frosne CRC prøver i den tidlige fase tumorer (UICC i /II) og sene stadier tumorer (UICC III /IV) med tilstødende normal colon væv og 10 normale colon prøver. Alle tumorer farvet positive for cytokeratin-20 (CK-20) (Dako, Hamburg, Tyskland) og negative for cytokeratin-7 (CK-7) (Dako), en karakteristisk for colon adenocarcinoma [32]. Først vurderede vi H.E. snit fra hver tumor væv for at skelne mellem cancercellelinier områder, stromale områder og infiltrerende immunceller. Vi derefter farvet for CD4, CD25, Foxp3, TGF-β og IL-10 i følgende serielle snit. For Foxp3 udtryk cytoplasmatisk, perinukleær cytoplasmatisk, og nuklear farvningsmønster blev forskelligt bestemt [30]. Serial kryostatsektioner (5 um) blev inkuberet med det primære antistof eller kontrol-antistof og med sekundær FITC-konjugeret (Fluoresceinisothiocyanate) antistof. Derefter blev objektglassene efterfølgende inkuberet med det andet primære antistof efterfulgt af inkubation med sekundært Cy3-konjugeret antistof. Objektglas blev modfarvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) og dækket med polyvinyl-alkohol monteringsmedium (DABCO, Sigma-Aldrich) og analyseret under anvendelse af et Zeiss-kamera (Oberkochen, Tyskland).

for immunhistokemi, forbehandling (fiksering) dias var den samme som beskrevet for immunfluorescens. Efter inkubation med det primære antistof, anvendte vi en peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret AffiniPure Donkey anti-mus eller et æsel-anti-gede-IgG (Jackson ImmunoResearch). Slides blev efterfølgende inkuberet i DAB (3,3′-diaminobenzidin) (Biogenex, San Ramon, USA), kontrastfarvet med Haemalaun og monteret med Glycergel (Dako, Hamburg, Tyskland). Kvantificeringen af ​​hver immunoenzymatisk farvning af tumorceller ud af 65 individuelle tumorvæv i seks individuelle forstørrede felter (× 400 forstørrelse) for hver farvning prøve blev scoret af celletælling udføres af to uafhængige forskere blindede til den underliggende sygdom. De forstørrede felter var repræsentative for hele tumor sektion. Resultatet af farvningen blev udtrykt i procent (%) positivitet. Alle værdier blev udtrykt som gennemsnit ± SD.

Real-time kvantitativ revers transkription-PCR-analyse

For at analysere genekspression af CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, og IL-10 ved RT-qPCR, vi ekstraheret totalt cellulært RNA under anvendelse af RNeasy Minikit fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Områder af interesse (kun epitel regioner) for hver vævssnit blev manuelt mikrodissekeres ved hjælp af en skalpel. Lige mængder af væv områder blev vurderet (2 × 1,5 cm

2 overfladeareal pr afsnit, tykkelse på 10 um). RNA-ekstraktion af patientprøver og etablerede humane colon-cellelinjer (for Foxp3) blev udført ifølge producentens anvisninger. Primer sæt blev opnået fra Qiagen, 18S RNA primerpar (fremad: TCA AGA ACG AAA GTC GGA GGT TCG, omvendt: TTA TTG CTC AAT CTC GGG TGG CTG) blev designet af Biomers (Ulm, Tyskland). Matchet menneskelige kolon cDNA blev købt fra Pharmingen (Heidelberg, Tyskland) som kontrol og blev standardiseret til baseline. Den husholdningsgener glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), ß-actin, og 18S RNA [33] blev anvendt til relativ kvantificering og cDNA kvalitetskontrol. Alle PCR-reaktioner blev udført med en DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Tyskland). Den relative kvantificering værdi, fold forskel, blev udtrykt som 2

-ΔΔCt. Til analysen i coloncancer-cellelinjer ekspression er indikeret i middelværdien, ACt og relative ekspression (Foxp3 /husholdningsgener).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SAS 9.2. Samlet overlevelse blev defineret som tidsperioden mellem randomisering og død uanset årsag. Patienter, som blev tabt til opfølgning blev censureret på datoen for sidste kontakt. Den samlede overlevelse blev vurderet ved hjælp af PROC PHREG (Cox Proportional Hazards Model). Parametrene for prognostisk potentiale, der er identificeret i en trinvis procedure, er blevet yderligere undersøgt af Kaplan-Meier-metoden (PROC LIFETEST). For univariate analyse betyder cut-off værdi for enten høj eller lav ekspression blev fastsat til 12% for Foxp3 i tumorinfiltrerende Treg og 16% for Foxp3 i cancerceller. Univariate analyse af betydning for Foxp3 ekspression af tumorinfiltrerende Treg og cancer-ekspressionssystemer forskelle i overlevelseskurverne blev evalueret ved log-rank test. På samme måde overlevelseskurver blev sammenlignet for N og T kategorier samt primære tumor.

To uafhængige grupper af patienter blev analyseret under anvendelse af Students t-test (Satterthwaite). Mere end to grupper blev analyseret anvende PROC GLM (analyse af afvigelser) med post-hoc test (Tukey). Frekvens fordelinger blev sammenlignet ved anvendelse KXM tabeller (Chi-quadrat). Pearsons korrelationskoefficient blev brugt til at beskrive og teste bivariate sammenhænge. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Tak

Forfatterne takker Mr. Dipl.-Math. Mathias Brosz for statistisk rådgivning og Mrs. Sabine Müller-Morath, Mrs. Mariola Dragan, Ms Nadine Gutermuth, og Fru Ingrid Strauss for deres tekniske support.