PLoS ONE: proteomiske Analyse af kræft i æggestokkene proksimal Væsker: Validering af Elevated Peroxiredoxin 1 i Patient Peripheral Circulation

Abstrakt

Baggrund

epitelovariecancer (EOC) er den mest dødelige gynækologisk malignitet i Forenede Stater. Desværre en valideret protein biomarkør-screening test til påvisning sygdommens tidlige stadium fra perifert blod endnu ikke blevet udviklet. Denne undersøgelse vurderer evne til at identificere tumor relevante proteiner fra ovariecancer proksimale væsker, herunder væv interstitiel væske (TIF) og tilsvarende ascites, fra patienter med papillær serøs EOC og oversætter disse resultater til målrettede blod-baserede immunoassays.

Metodologi /vigtigste resultater Salg

Forbundne TIF og ascites indsamlet fra fire papillære serøse EOC patienter på tidspunktet for kirurgi gennemgik immunodepletion, opløsning af 1D gelelektroforese og in-gel digestion til analyse ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri, hvilket resulterede i en samlet identifikation af 569 og 171 proteiner fra TIF og ascites, henholdsvis. Af disse peroxiredoxin I (PRDX1) blev udvalgt til validering i serum ved ELISA og påvist at være til stede og signifikant forhøjet (p = 0,0188) i 20 EOC patienter med gennemsnitshøjden af ​​26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) sammenlignet med 4.19 ng /mL (± 2,58 SEM) fra 16 patienter med normal /benign ovarie patologi.

konklusioner /betydning

Vi har udnyttet et workflow til høstning EOC-relevant proksimale kropsvæsker, herunder TIF og ascites, til proteomanalyse. Blandt de differentielt rigelige proteiner identificeret fra disse proximale fluider, blev PRDX1 påvist at være til stede i serum og vist ved ELISA at være forhøjet med næsten 6 gange i papillære serøse EOC patienterne i forhold til normale /benigne patienter. Vores resultater viser den facile evnen til at opdage potentielle EOC-relevante proteiner i proksimale væsker og bekræfte deres tilstedeværelse i perifert blod serum. Desuden er vores fund af forhøjede niveauer af PRDX1 i serum af EOC patienter versus normale /godartede patienter garanterer yderligere evaluering som en tumor specifik biomarkør for EOC

Henvisning:. Hoskins ER, Hood BL, Sun M, Krivak TC, Edwards RP, Conrads TP (2011) proteomiske Analyse af kræft i æggestokkene proksimal Væsker: Validering af Elevated Peroxiredoxin 1 i Patient perifer cirkulation. PLoS ONE 6 (9): e25056. doi: 10,1371 /journal.pone.0025056

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juni 12, 2011; Accepteret: August 23, 2011; Udgivet den 30. september, 2011

Copyright: © 2011 Hoskins et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev leveret af The Scaife Foundation Pilot Project Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ca. 22.220 kvinder er diagnosticeret årligt med epitelial ovariecancer (EOC) og over 13.000 bukke under for denne sygdom [1]. Kvinder med EOC har en 5-års overlevelse på 18-34%, hvor dårlig prognose skyldes primært det faktum, at de fleste patienter til stede med fremskreden sygdom [2]. Påvisning af tidligt stadium sygdom med en optimal screeningstest ville have en positiv indvirkning på den samlede overlevelse; men der er ingen ledige biomarkører, der er tilstrækkeligt følsomme eller specifik til indsættelse af en egnet test for at være af nytte til screening den almindelige befolkning. Mucin 16, også kendt som cancer antigen (CA) -125, blev opdaget af antistofproduktion af tumorxenografter [3] og let påvises i serum. En FDA-godkendt CA-125 immunoassay er i brug for at overvåge sygdomme reaktion på kemoterapeutiske behandling og tilbagefald; Men måling af CA-125 er ineffektiv til screening (en off-label brug) til EOC i den almindelige befolkning [4]. Mens immunodetektering af tumor-associerede antigener har bidraget til viden om den naturlige historie af sygdommen, deres foranstaltninger har endnu ikke konsekvent identificere tidligt tidspunkt EOC.

High throughput genekspression analyse af normalt ovarievæv forhold til EOC har afslørede unikke gen signaturer udtrykt i EOC. Selv om disse underskrifter har givet yderligere indsigt i molekylærbiologi EOC, er genekspression ikke konsekvent korrelere med protein overflod [5], især i perifert blod, som repræsenterer den mest klinisk relevante prøve kilde til rutinemæssig assay udvikling og måling [6]. Mens proteomisk profilering af serum repræsenterer en attraktiv fremgangsmåde for biomarkører, denne strategi er analytisk udfordring på grund af den høje dynamikområde af proteinkoncentration i denne prøve, hvilket vanskeliggør opdagelsen af ​​lavere forekomst, tumorrelaterede proteiner. Som følge af de iboende analytiske udfordringer i forbindelse med serum proteomics, har proksimale væsker fået stigende opmærksomhed for at gennemføre kandidat protein biomarkør opdagelse [7]. I tilfælde af EOC, ascites repræsenterer en attraktiv prøve kilde til kandidat opdagelse, da det bader ikke-adhærente cancerceller og tilstødende mesotelceller og indeholder rigelige oplysninger, herunder vækst, overlevelse og metastase signalering faktorer [8]. Mens ascites er en vigtig medium for udførelse protein biomarkører undersøgelser, ligesom serum, indeholder også proteiner, der findes på tværs af en high dynamic range koncentration kræver forskellige fraktioneringsteknikker til for at identificere lavere rigelige proteiner [9].

tissue interstitiel væske (TIF) er en anden prøve, som har fået stigende opmærksomhed som et substrat, hvorfra der kan udføres kandidat protein biomarkør opdagelse fra tumorvæv. Tissue interstitiel væske er en proteinrig prøve kilde, antages at indeholde udskilles, skur og /eller effluxed proteiner fra tumor og omkringliggende stroma. Celis et al. var de første til at undersøge proteiner fra brystkræft og normal TIF [10], hvor det blev påvist, at proteiner identificeret ved MS-baserede proteomics kunne eksternt valideret i et væv microarray indeholder over 70 brystcarcinoma vævsprøver [11]. I en nyere undersøgelse, en MS-baseret proteomics arbejdsgang for at identificere forskelligt rigelige proteiner i renalcellecarcinom (RCC) viste forhøjede niveauer af enolase 2 (ENO2) og thrombospondin-1 (TSP1) i tumor TIF. Disse blev også bekræftet som nuværende og ved forhøjet overflod i RCC patient serumprøver i forhold til at styre serum [12]. Denne undersøgelse viste, at proteiner opdaget i TIF besidder en høj tilbøjelighed til oversættelse til serum-assays.

I den aktuelle undersøgelse, vi udnyttet en MS-baseret proteomics workflow til at identificere tumor specifikke proteiner fra TIF og ascites fra EOC patienter. Blandt de differentielt rigelige proteiner identificeret fra disse proximale fluider, peroxiredoxin 1 (PRDX1) blev påvist at være til stede i serum og vist ved ELISA at være forhøjet med næsten 6 gange i papillære serøse EOC patienterne i forhold til normale /benigne patienter. Vores undersøgelse tilføjer yderligere støtte til den hypotese, at TIF repræsenterer et attraktivt proksimal biovæske for udførelse kandidat biomarkør opdagelse for den endelige tidlig påvisning af EOC.

Resultater

Proteinindholdet inddrives fra TIF og ascites blev visualiseret ved beslutning om en 1D-PAGE-gel (figur 1). En betydelig mængde humant serumalbumin (HSA) var til stede i begge prøver, dog på lavere niveauer i TIF end ascites. Denne større niveau af HSA i ascites er væsentlig, idet den effektivt øger den samlede dynamiske område for proteinkoncentration mellem den højeste (fx HSA) og lavest rigelige proteiner i denne prøvetype. En større repræsentation af proteom fremgår i TIF prøve på grund af det lavere samlede bidrag af HSA til det samlede proteinindhold. Givet de forskellige bidrag af HSA i disse to prøver, vores undersøgelse udnyttede en affinitet-baserede immunodepletion protokol for at fjerne de klassiske høj hyppighed serumproteiner til stede i hver prøve. Denne metode resulterede i en effektiv fjernelse af en række meget rigelige proteiner som vist for en TIF prøve (figur 1), der giver mulighed for en mere fuldstændig sammenligning af proteomik indhold af ascites og TIF følgende LC-MS /MS-analyse.

(A) Repræsentative ascites og TIF prøver illustrerer tilstedeværelsen af ​​rigelige proteinarter i begge prøver såvel som kompleksiteten af ​​den høstede TIF prøven. (B) En repræsentant TIF prøve før og efter immunodepletion med Agilent MARS Hu-14 immunaffinitetssøjle den.

Forbundne ascites og TIF blev høstet fra fire patienter (tabel 1), immundepleteret og tilsvarende protein mængder af hver opløst ved 1D-PAGE. Hver gel bane blev skåret i fem tilsvarende skiver, i-gel fordøjet og peptidet fordøjer analyseret ved LC-MS /MS i to eksemplarer, hvilket resulterer i 10.274 proteiner identificeret i alle prøver, herunder dem identificeret med et enkelt peptid. Vi valgte at indføre en udelukkelse kriterium, således at kun de proteiner, repræsenteret af to spektrale tæller eller mere på tværs af alle fire patientprøver fra enten TIF eller ascites blev godkendt til den sammenlignende proteomiske dataanalyse, hvilket resulterede i et datasæt bestående af 569 og 171 proteiner identificeret i alle fire TIF og ascites patientprøver, henholdsvis (tabel S1, de rå LC-MS /MS datafiler er tilgængelige til download fra Tranche data Repository på https://proteomecommons.org/tranche/). Ingenuity Pathway Analyse annotation af den cellulære lokalisering af proteiner identificeret afslørede en stor berigelse i cytoplasmic- og nukleare afledte proteiner TIF forhold til ascites (figur 2). Ikke overraskende en høj andel af ekstracellulære proteiner var til stede i ascites i forhold til TIF. Ekstracellulære proteiner domineret de fælles proteiner identificeret, med det store flertal afledt af ascites. Subcellulære proteiner generelt stammer fra TIF; disse proteiner var i højere koncentration i TIF med mindskede niveauer i ascites. Dette kontrasterende forskel i oprindelsen af ​​cellulære lokalisering antyder, at TIF indeholder proteiner meget reflekterende af den cellulære sammensætning af vævet mikromiljø.

Tissue interstitiel væske og ascites proteiner, som blev identificeret ved to eller flere spektrale tæller i hvert biovæske, respektfuldt, blev analyseret for cellulær opdeling med Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Næsten 85% af TIF-proteiner stammer fra cytoplasmaet og /eller kernen. Ascites havde en serum-lignende protein profil med 66% af proteiner bliver ekstracellulær oprindelse.

Blandt disse proteiner identificeret, peroxiredoxin 1 (PRDX1) blev identificeret i større overflod (et gennemsnit på 13 fold større spektral count) i TIF prøver sammenlignet med ascites. Vi bekræftede tilstedeværelsen og differentieret overflod af PRDX1 i begge biospecimens ved Western blot (figur 3). Mens PDRX1 rutinemæssigt identificeres og undersøgt i væv, søgte vi at bestemme, om den overflod af PRDX1 var forhøjet i serum fra en naiv kohorte (f.eks ikke vort oprindelige opdagelse sæt) af 20 patienter med stadium II eller højere EOC (tabel 2) sammenlignet med patienter med en godartet ovarie patologi (tabel 3). Gennemsnitshøjden af ​​PRDX1 fra disse 20 EOC patienter blev bestemt til at være 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) og 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) fra 16 kontrol /benigne æggestokkene populationer som målt ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt PDRX1 ELISA. Dette omtrentlige 6 gange blev fundet større overflod af PDRX1 i serum af EOC patienter til at være statistisk signifikant (figur 4, p = 0,0188).

Peroxiredoxin 1 verificering via Western blot-analyse i ascites (A) og TIF ( B) rekapitulerer resultaterne opnået ved den spektrale count (SC) værdier målt fra væskekromatografi-tandem-massespektrometri-analyse af disse prøver.

Serum fra 20 patienter diagnosticeret med Stage IIC eller højere ovariecancer ( tilfælde) og serum fra 20 patienter med benigne ovarie patologi (kontroller) blev evalueret for PDRX1 tilstedeværelse og mængde ved ELISA. Der var en statistisk signifikant forskel mellem de gennemsnitlige PDRX1 niveauer (p = 0,0188) i de to grupper. Vejviser

Diskussion

Præsentation med oppustethed, tidlig mæthed , et bækken masse og ascites er typisk for kvinder med EOC, desværre dog disse symptomer ofte til stede, når sygdommen er fremskreden i scenen. En screening test til påvisning tidligt stadie ovariecancer, når den 5-års overlevelsen er næsten 70-90% [13], har endnu ikke udviklet. Den lave forekomst af tidligt stadium EOC udelukker omfattende undersøgelse af sygdommens patogenese, og dermed mest forskning sker i sent stadium sygdom. Vi identificerede kvinder med fremskreden EOC og indsamlet parrede ascites og TIF fra æggestokkene kræftsvulster fra hver patient for proteomisk analyse. Ascites og TIF blev immundepleteret af stærkt rigelige proteiner før LC-MS /MS-analyse. Vores data viser, at ascites og TIF havnen meget forskellige protein profiler. Ascites besidder proteom egenskaber svarende til den for serum, der er sammensat hovedsagelig af proteiner fra den ekstracellulære rum. Omvendt TIF består af proteiner mere repræsentative for et væv mikromiljø, med mange stammer fra forskellige rum fra celler.

I vores analyse blev 569 proteiner identificeret i fælles mellem alle patient TIF prøver, sammenlignet med 171 proteiner almindeligt identificeret i tilsvarende ascitesvæske. Blandt disse blev PRDX1 identificeret i større overflod i TIF prøver sammenlignet med ascites. TIF antages at indeholde en højere relativ koncentration af proteiner gennem passiv /enzymatisk udgydelse, sekretion, udstrømning og apoptose. På en tilsvarende måde, de samme processer sandsynligvis resultere i “udsivning” af nogle eller alle af disse samme proteiner i vaskulaturen og perifere cirkulation. Den observerede større grad af PRDX1 i TIF forhold til ascites er ikke uventet for manifold biologically- og analytisk-relaterede årsager. Ud fra et biologisk synspunkt, er TIF vid udstrækning stammer fra tumormikromiljøet og således sandsynligvis indeholder højere relative koncentrationer af tumor /stroma-afledte proteiner i forhold til andre perifere kropsvæsker, såsom ascites og serum. Konsekvensen af ​​denne forskel i dynamiske område proteinkoncentration mellem disse kropsvæsker effektivt sænker det dynamiske område for proteinkoncentration i ascites og /eller serum sammenlignet med TIF. Af disse grunde medtagelse af proximale fluider såsom TIF i proteom-baserede biomarkører undersøgelser repræsenterer en ny strategi til høst skur og udskilte proteiner proksimalt for tumorvævet mikromiljø hvis tilstedeværelse vil sandsynligvis blive reflekteret i serum fra de samme patienter.

PRDX1 er en allestedsnærværende vævsafledt protein med kendt funktion som en antioxidant. PRDX1 beskytter primært celler fra DNA skader og potentiel mutagenese ved at danne alkoholer følgende enzymatiske reaktion med reaktive oxygenarter (ROS), såsom hydrogenperoxid og hydroxylradikaler [14]. PRDX1 er af særlig interesse på grund af dets kendte forhøjet niveau af genekspression i talrige cancere [15], [16]. PRDX1 tilstedeværelse i karcinomer er forbundet med hæmning af apoptose, hvilket svarer til øget tumor overlevelse [16], [17], [18]. Mens der er begrænsede data med hensyn til PRDX1 og dens virkninger på EOC patogenese og kliniske resultater, Chung et al. har foreslået, at PRDX1 ekspression i EOC er en prognostisk indikator for nedsat overlevelse [19]. Desuden er flere andre peroxiredoxin familiemedlemmer (PRDX2-6) menes at være knyttet til æggestokkene carcinogenese, hvor disse er blevet rapporteret at være forhøjet i grænsetilfælde ovarietumorer forhold til benigne æggestokkene læsioner [20]. Maxwell et al. for nylig gennemført en storstilet proteomisk analyse af laser mikrodissekeres endometriecancer væv og bemærkede, at selv fase I livmoderkræft havde forhøjede niveauer af proteiner involveret i oxidativt stress og inflammation i forhold til normal endometrium. PRDX1 var blandt de oxidativ stress proteiner, der blev valideret at være signifikant forhøjede i trin I endometriecancer væv [21]. I den foreliggende undersøgelse blev tilstedeværelsen af ​​PRDX1 i TIF og ascites fra patienter med ovariecancer verificeret ved Western blot at være forhøjet i overflod i TIF sammenlignet med ascites. Baseret på den hypotese, at en delmængde af TIF-proteiner repræsenterer stald /secernerede proteiner fra mikromiljøet og dermed kan være udskiftelig og dermed opdages, i perifert blod, forsøgte vi at bestemme indholdet af PRDX1 i blodserum ved anvendelse af en stærkt valideret, kommercielt tilgængelig ELISA. Disse resultater viste, at patienter med fremskreden EOC havde en 6-fold forhøjet niveau af PRDX1 i deres serum sammenlignet med patienter med normale /godartet ovarier (p = 0,0188).

Selvom PRDX1 ikke er blevet rapporteret tidligere at være til stede i serum, baseret på den hypotese, at nogle (hvis ikke alle) TIF proteiner er udskiftelige med perifer cirkulation, vi udnyttet en målrettet ELISA tilgang til først verificere denne hypotese og sekundært at stille spørgsmålet om, hvorvidt dette protein er forskelligt rigeligt i serum fra patienter med EOC sammenlignet med personer med godartede sygdomme i ovariet. Vi begrænset denne eksterne validering af PRDX1 til serum fordi forhøjede niveauer af PRDX1 allerede er blevet påvist i ovariecancer væv ved western blot og immunhistokemi [19]. Ideelt set er paneler af udvalgte biomarkører sandsynligvis behov for at udvikle en valideret screening test til tidlig EOC detektion [22], vores eneste fokus var at demonstrere muligheden for at oversætte MS-baserede proteom opdagelser fra TIF til målrettede serum assays, i dette tilfælde PRDX1. Vi anerkender, at vi ikke kan konkludere, at PRDX1 er tilstrækkelig følsom og specifik at blive betragtet som en screening biomarkør for EOC baseret på vores begrænsede validering prøve kohorte dog, at det kan påvises, og forhøjede i æggestokkene kræftpatient serum sammenlignet matchede godartede kontroller giver yderligere støtte bevis for hypotesen om, at protein kandidater opdaget i TIF sandsynligvis vil være til stede i perifere kredsløb.

Materialer og metoder

Patient Selection

Forskning blev udført under University of Pittsburgh Institutional Review Board godkendte protokol # IRB0406147. Alle prøver blev opnået efter gennemgang af skriftligt informeret samtykke og blev de-identificeret ved afhentning og analyseret anonymt. Intra-operativ samling af tumor, ascites og serum var fra patienter med formodet ovariecancer på tidspunktet for deres oprindelige kirurgi og forekom inden for 30 min af kirurgisk fjernelse. Alle patienter var kemoterapi og strålebehandling naive. Patienter med fremskreden EOC (stadie IIC eller større) og patologi-bevist papillær serøs ovariecancer undertype blev udvalgt til stikprøve og analyse. Serum anvendes til validering af PRDX1 stammer fra en intern database af de identificerede patienter klassificeret som havende EOC eller godartet ovarie patologi. Klinisk-patologisk detaljer i disse patienter var begrænset til deres gynækologisk historie.

prøve behandling

For behandlingen af ​​TIF, ca. 0,25-0,50 gram våd vægt af væv opnået ved kirurgi blev straks vasket to gange for 5 min med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Vævene blev derefter inkuberet i 1 ml PBS i 1 time ved 37 ° C. Efter inkubation blev vævet fjernet, og TIF supernatanten blev klaret af cellerester ved centrifugering ved 1000

× g

i 2 minutter og opbevaret ved -80 ° C. Ascites prøver blev aliquotted i mikrocentrifugerør, afklaret ved 1000

× g

i 2 min og opbevaret ved -80 ° C. Totalt protein i TIF og ascites prøver blev kvantificeret ved den bicinchoninic (BCA) assay (Pierce, Rockville, IL). Prøver blev koncentreret under anvendelse af Microcon-3 centrifugalfilter enheder (Millipore, Billerica, MA) i overensstemmelse med producentens anvisninger og underkastet immunodepletion af de 14 mest forekommende serumproteiner med flere ganges Affinity Removal System (Hu-14, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) ifølge producentens protokol, med substitution af en 4 × prøvefortyndingspuffer snarere end 1 × buffer for at forhindre potentiel prøvetab grund af omfattende koncentration af TIF og ascites. De udtømte TIF og ascites prøver blev udvekslet i 25 mM ammoniumbicarbonat og protein blev kvantificeret ved BCA assay. Tilsvarende blodprøver blev opsamlet i rød-top vacutainer venøs indsamling rør (Becton, Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ), lov til at koagulere ved stuetemperatur i 45 minutter, centrifugeres ved 2200

× g

i 10 min at indsamle serum og aliquotted og opbevaret ved -80 ° C.

i-gel Digestion Protocol

Ti mikrogram hver af ascites eller TIF blev løst af 1D-PAGE og gel bånd blev synliggjort ved Coomassie blå. Fem gel blev udskåret jævnt over alle prøver og affarvet i 25 mM ammoniumbicarbonat, 50% ACN. Gelskiver blev reduceret med 10 mM DTT ved 56 ° C i 1 time efterfulgt af alkylering med 55 mM iodacetamid i 45 minutter ved omgivelsestemperatur i mørke. Prøver blev spaltet med trypsin natten over og peptider blev ekstraheret fra gelbånd med 70% ACN /5% myresyre. Alle prøver blev lyofiliseret til tørhed og resuspenderet i 0,1% trifluoreddikesyre før analyse ved væskekromatografi (LC) -tandem massespektrometri (MS /MS).

massespektrometri og Bioinformatik Analyser

peptid ekstrakter fra hver prøve gelbånd blev analyseret dobbelt på en Dionex Ultimate 3000 væskekromatografisystem (Dionex, Sunnyvale, CA) koblet online ved elektrospray ionisering til en lineær ion trap (LTQ) MS (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Separationer blev udført med 75 um id × 360 um od × 20 cm lang kvartsglas kapillarkolonner (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) gylle pakket i hus med 5 um, 300 Å porestørrelse C-18 silica-bundet stationære fase (Jupiter, Phenomenex, Torrance, CA). Efter prøve injektion på en C-18 forkolonne (Dionex), blev søjlen vasket i 3 minutter med mobil fase A (2% acetonitril, 0,1% myresyre) ved en strømningshastighed på 30 pl /min. Peptider blev elueret under anvendelse af en lineær gradient af 0,33% mobil fase B (0,1% myresyre i acetonitril) /minut i 130 minutter, derefter til 95% B i yderligere 15 minutter, alle ved en konstant strømningshastighed på 200 nL /min. Kolonne vask blev udført ved 95% B i 15 minutter for alle analyser hvorefter søjlen blev re-ækvilibreret i mobilfase A forud for efterfølgende injektioner. MS blev drevet i et data-afhængig MS /MS-tilstand, hvor hver fulde MS scanning blev efterfulgt af syv MS /MS scanninger i den lineære ion trap (LIT), hvor de molekylære ioner syv mest rigelige peptid blev udvalgt til kollision-induceret dissociation (CID) ved anvendelse af en normaliseret kollisionsenergi på 35%. Data blev indsamlet over et bredt forløber ion valg scanning rækkevidde (

m /z

375-1800) og dynamisk udelukkelse blev aktiveret for at minimere overflødige udvalg af peptider tidligere valgte til CID.

Tandem massespektre blev søgt mod UniProt humane protein-database (11/09 release) fra den Europæiske Bioinformatics Institute (https://www.ebi.ac.uk/integr8), ved hjælp af SEQUEST (Bioworks 3.3.1, ThermoFisher Scientific). Søgekriterier blev fastsat som følger: peptider blev ransaget fuldt tryptiske med op til to forpasset spaltningssteder, dynamiske ændringer af methionin oxidation (15,9949 Da) og cystein carboxyamidomethylation (57,0215 Da), forstadium masse tolerance på 1,4 Da og fragment ion tolerance på 0,5 Da . Peptider blev betragtet lovligt identificeret, hvis de mødte specifik afgift tilstand og proteolytiske spaltning-afhængige krydskorrelationsberegninger snesevis af 1,9 til [M + H]

1+, 2,2 for [M + 2H]

2+ og 3.5 for [M + 3H]

3+, og et minimum delta korrelation på 0,08. En falsk peptid opdagelse på mindre end 2% blev bestemt ved at søge den primære tandem MS data ved hjælp af de samme kriterier mod en lokkedue database, hvori proteinsekvenserne er vendt [5]. Resultaterne blev yderligere filtreret ved hjælp af software udviklet internt, og forskelle i protein overflod mellem prøver blev afledt som summen af ​​de samlede CID begivenheder, der resulterede i et positivt identificeret peptid for et givet protein tiltrædelse på tværs af alle prøver (spektral optælling) [23].

Western blot-analyse

Ti ug totalt protein fra hver prøve blev løst ved 1D-PAGE under anvendelse af 4-12% Bis-Tris eller 7% Tris-acetat NuPAGE geler (Invitrogen Carlsbad, CA) og overført til Immobilon-PSQ PVDF-membraner (Millipore) under anvendelse af Invitrogen Xcell II blot-Modul ifølge producentens protokol. Primært antistof var rotte-monoklonalt anti-human PRDX1 (Abcam, Cambridge, MA) og sekundært antistof var peberrodperoxidase-konjugeret æsel-anti-rotte (Abcam Cambridge, MA), præ-absorberet med serum. Membraner blev blokeret med 0,5% tørmælk med TBS med 0,1% Tween-20 (TBST) som fortyndingsmiddel. Primært antistof blev påført ved 1:1000 i TBST og membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Membraner blev vasket med TBST og inkuberet med sekundært antistof (1:75,000 fortynding) i 1 time ved omgivelsernes temperatur. Membraner blev vasket med TBST og inkuberes med Pico Super Signal ECL (ThermoFisher) i 5 min før kemiluminescerende eksponering.

Peroxiredoxin en ELISA

Niveauerne af overflod af PRDX1 i patientens sera blev målt ved hjælp af den peroxiredoxin 1 Humant ELISA-kit (BioVendor, Candler, NC) ifølge producentens instruktioner. Serumprøver fra patienter med ovariecancer og godartet patologi blev fortyndet 1:03 før målingen og blev analyseret samtidigt og i to eksemplarer. Seriefortyndinger af PRDX1 standard blev assayet parallelt med serumprøver. Den optiske densitet blev plottet mod faste PRDX1 koncentrationer for at generere standardkurven ifølge fabrikantens protokol. En ikke-parametrisk Wilcoxon rank-sum test blev anvendt til bestemmelse af signifikans af forskellen mellem den mediane PDRX1 mængder i sera fra patienter med benign ovarie patologi versus patienter med fremskreden EOC. Nulhypotesen var, at data i de to observation grupper er uafhængige stikprøver fra samme kontinuerte fordelinger med lige medianer mod den alternative hypotese, at grupperne ikke har lige medianer. Signifikans blev accepteret ved en tosidet p-værdi. 0,05

Støtte oplysninger

tabel S1. Salg Proteiner identificeret fra fire epitelovariecancer patient- matchede ascites og væv interstitiel væske (TIF). Listen af ​​protein identifikationer (rækker) repræsenterer de summerede spektrale tællinger (værdier) fra analyser af ascites og TIF, som hver især er løst ved denaturerende gelelektroforese, hvorfra fem gelbånd var i gel spaltet og analyseret dobbelt ved væskekromatografi-tandem massespektrometri

doi:. 10,1371 /journal.pone.0025056.s001

(XLS)

tak

forfatterne vil gerne takke Christopher Vanselow, Maria Vandamme og Agilent Technologies for 4 × Buffer En formulering, der anvendes i MARS udtømning protokollen. Forfatterne vil også gerne takke det værdifulde input fra anonyme dommere hele peer review af denne artikel.