PLoS ONE: Anti-Cancer potentiale MAPK Pathway Hæmning i paragangliomer-Effekt af forskellige Statiner på Mouse fæokromocytom Cells

Abstrakt

Til dato, maligne fæokromocytom og paragangliomer (PHEOs /PGLs) kan ikke effektivt helbredes, og dermed der er et presserende behov for nye behandlingsstrategier. Lovastatin er blevet vist effektivt at inducere apoptose i muse Pheo celler (MPC) og de mere aggressive musetumor vævsafledte celler (MTT), som blev ledsaget af reduceret phosphorylering af mitogenaktiveret kinase (MAPK) pathway spillere. Den MAPK pathway spiller en rolle i mange aggressive tumorer og har været forbundet med en undergruppe af PHEOs /PGLs, herunder

K-RAS-

,

Retsinformation

, og

NF1

-mutated tumorer. Vores mål var at fastslå, om MAPK signalering også kan spille en rolle i aggressive, succinat dehydrogenase (SDH) B mutation-afledte PHEOs /PGLs. Expression profilering og western blot analyse viste, at specifikke aspekter af MAPK-signalering er aktive i SDHB PHEOs /PGLs, tyder på, at hæmning af statin behandling kunne være gavnligt. Desuden har vi til formål at vurdere, om den anti-proliferative effekt af lovastatin på MPC og MTT adskilte sig fra, der udøves af fluvastatin, simvastatin, atorvastatin, pravastatin eller rosuvastatin. Simvastatin og fluvastatin faldt celleproliferation mest effektivt og mere aggressive MTT-celler forekom mere følsomme i denne henseende. Inhibering af MAPK1 og 3 phosphorylering efter behandling med fluvastatin, simvastatin, lovastatin og blev bekræftet ved Western blot. Øgede niveauer af CASP-3 og PARP spaltning bekræftede induktion af apoptose efter behandlingen. Ved en koncentration tilstrækkelig lav til ikke at påvirke celleproliferation, spontan migration af MPC og MTT blev inhiberet signifikant inden for 24 timers behandling. Afslutningsvis kan lipofile statiner præsentere en lovende behandlingsmulighed for behandling af aggressive menneskelige paragangliomer ved at inducere apoptose og hæmning tumor spredning

Henvisning:. Fliedner SMJ, Engel T, Lendvai NK, Shankavaram U, Nolting S, Wesley R et al. (2014) Anti-Cancer potentiale MAPK Pathway Hæmning i paragangliomer-effekten af ​​forskellige Statiner på Mouse fæokromocytom Cells. PLoS ONE 9 (5): e97712. doi: 10,1371 /journal.pone.0097712

Redaktør: Benjamin Edward Rich, Dana-Farber Cancer Institute, USA

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret den 22. april 2014 Udgivet: 20 maj 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af de Intramural forskningsprogrammer Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development og National Human Genome Research Institute , National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA og 1. Institut for Medicin, University Medical center Schleswig-Holstein, Lübeck, Tyskland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nylig, lovastatin er blevet foreslået som lovende potentiel terapeutisk mulighed for at behandle RET, NF1, og TMEM127 mutation-afledt catecholamin producerer adrenale og extra-adrenale chromaffinceller celletumorer (fæokromocytom (PHEOs) og paragangliomer (PGLs), henholdsvis ) [1]. Men risikoen for metastatisk sygdom i disse tumorer er forholdsvis lav og tumorresektion er således næsten altid helbredende. I modsætning hertil risikoen for maligne PHEOs /PGLs er særlig høj i tilfælde af succinatdehydrogenase B (SDHB) genmutationer [2], [3], og er et presserende behov hidtil ukendte behandlingsstrategier for denne tilstand.

En nylig New England Journal of Medicine artikel rapporterede nedsat kræft dødelighed hos patienter, som blev ordineret statiner tidligere til diagnose [4]. Efter aftale med dette, talrige

in vitro

in vivo

studier viste anti-cancer effekter af lovastatin og andre statiner alene eller som del af en kombineret regime til aggressive tumorer behandling (gennemgået i [ ,,,0],5] – [7]). Ved højere koncentrationer, end der kræves til reduktion af cholesterolniveauer, er statiner blevet vist at inhibere mevalonat-vejen alvorligt nok til at inhibere syntesen af ​​isoprenoider, der virker som nødvendige membranankre for korrekt funktion af visse proteiner [8]. De anti-cancer effekter af statiner har hovedsageligt været forbundet med hæmning af Ras-prenylering (dvs. farnesylering eller geranylgeranylering), som blandt andre virkninger forstyrrer aktivering af downstream forsvarsspillere MAPK pathway [9], [10]. Overaktivering af mevalonat bane, herunder MAPK-signalering har vist sig at være tilstrækkeligt til celletransformation [11]. Overdreven MAPK signalering understøtter apoptose hæmning, proliferation og migration og er en vigtig egenskab ved mange cancertyper (sammenfattet i [12], [13]). I tilfælde af PHEOs /PGLs, forhøjet MAPK pathway aktivitet er tydelig i

H-RAS

,

K-RAS

,

TMEM127

,

RET

,

NF1

, og muligvis

MAX

mutation-relaterede tumorer [14] – [22]

Så vidt vi ved, i øjeblikket ingen beviser for øget MAPK signalering i SDHB-afledte. PGLs er blevet præsenteret. I celler fra patienter med Cowden-lignende syndrom og SDHB eller D genvarianter dog forhøjede niveauer af MAPK 1 og er blevet observeret 3 phosphorylering [23]. I nærvær af en aktiv MAPK vej, kan statiner give en lovende behandling eller co-behandlingsmulighed for øjeblikket fatale maligne PGLs.

Omfanget af de anti-cancer effekter har vist sig at variere afhængigt af model og type af statin brugte [24] – [30]. Således har vi vurderet, hvilke af de syv tiden tilgængelige statiner kan være mest effektive for Pheo /PGL behandling.

Materialer og metoder

Fluvastatin, pravastatin, lovastatin og simvastatin blev alle opnået fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI); atorvastatin og rosuvastatin blev opnået fra Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY).

Cell kultur

Mus tumorvæv-afledt (MTT) celler er for nylig blevet udviklet i vores laboratorium [31 ]. Alle undersøgelser, der er nødvendige for udvikling og karakterisering af MTT celler dyr blev udført i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er skitseret i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr, og godkendt af

Eunice Kennedy Shriver

National Institut for Child Health and human Development Animal Care og brug Udvalg (protokol nummer ASP # 06-028). MTT celler er ejendom NIH. Mus pheochromocytomceller celler (MPC 4 /30PRR) var en generøs gave fra Dr. Tischler, Tufts, Boston. Celler blev holdt i DMEM (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY), suppleret med 10% varmeinaktiveret hesteserum (Hyclone Logan, UT), 5% føtalt bovint serum (Gibco), HEPES (Gibco), og penicillin ( 10.000 enheder /ml) /streptomycin (100.000 ug /ml) (Gibco) i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Mediet blev skiftet hver anden dag, og celler blev passeret når 80-90% konfluens var nået. Alle statiner blev sammenlignet med den passende koncentration af vehikel (DMSO). Når statiner blev kombineret for at vurdere de potentielle additive virkninger, 25 pM af 2 forskellige statiner blev sammenlignet med 50 pM af hver af de enkelte statiner.

Proliferationsassay

Celler blev podet i collagen coatede 96- brønds plader (BD Biosciences, San Jose, CA) ved 10.000 celler per brønd, og fik lov til at fæstne i 24 timer. Derefter medium blev udskiftet med koncentrationer på 6,25, 12,5, 25, og 50 uM af de forskellige statiner, opløst i supplerede medier. Efter 0, 24, 48 og 72 timers behandling blev celleproliferation vurderet med celleproliferation Kit II (XTT) (Roche anvendt videnskab, Indianapolis, IN) i overensstemmelse med produktets manual. Efter fire timers inkubation blev pladerne målt ved 490 nm med 650 nm reference bølgelængde i en mikropladelæser (Victor

3 1420 multilabel counter, Perkin Elmer, Waltham, MA). Alle eksperimenter blev udført i fire eksemplarer og gentaget mindst to gange.

Spontane assays cellemigration

Celler blev podet ved 60.000 celler per brønd for vurdering spontan migration i en xCELLigence DP-enhed (Roche Diagnostics, Mannheim , Tyskland) som tidligere rapporteret [32]. Den spontane migrering blev registreret i 24 timer i nærvær af 5 pM fluvastatin, lovastatin og simvastatin alene, eller i kombination med 100 uM trans, trans farnesol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA).

MAPK pathway gen-berigelse i SDHB PGLs

Expression data blev udtrukket fra tidligere præsenteret microarray data på 45 prøver af pseudohypoxic PHEOs /PGLs, herunder 18 SDHB, 8 SDHD hoved og hals (HN), 6 SDHD abdominal og thorax (aT), og 13 VHL prøver sammenlignet med normale adrenale medulla [33]. Som rapporteret, forudsigelse analyse af microarray identificeret 6937 gener som karakteristisk for en af ​​de forskellige undergrupper af pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Disse blev sat op over en liste over 254 MAPK pathway-gener (Kyoto Encyclopedia of Genes og Genome vejen). Fremherskende overekspression i SDHB prøver sammenlignet med normal medulla blev bekræftet af ANOVA og intervaller var baseret på Studentized rækkevidde statistik, Tukey metode “Ærlige Betydelig forskel”.

Etik Statement

Tissue samling var godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for

Eunice Kennedy Shriver

National Institutes of Child Health and human Development. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

Menneskelig tumorvæv

Pheo /PGL væv blev straks nedfrosset efter resektion. Patient og tumor information for hver prøve er vist i tabel 1. Frosne prøver blev homogeniseret på is i vævsprotein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Lafayette, CO, USA) med 0,1% phosphatase inhibitor (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , MA, USA) og en proteasehæmmer Complete Mini tablet pr 10 ml opløsning (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Homogenater blev centrifugeret ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev anvendt som proteinekstrakt.

Cell høst

Celler blev podet i collagen plader [34] på 600.000 celler /ml og fik lov at vedhæfte i mindst 18 timer før mediet blev ændret til 25 um statin opløsninger eller DMSO-kontrol. Behandling løsninger blev fornyet efter 24 timer. Efter 48 timers behandling blev cellerne opsamlet med en gummispartel og vasket 3 gange i iskold PBS ved centrifugering ved 500 x g. Celler blev opsamlet ved 1500 x g, opløst i 0,1% cholamidopropyldimethylammoniopropanesulfate indeholdende ét proteasehæmmer Complete Mini tablet pr 7 ml opløsning (Roche Applied Science) og 0,5% Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 (Sigma-Aldrich Co.). Prøver blev sonikeret i 2 minutter på is og derefter centrifugeret ved 10.000 x g i 10 min, 4 ° C. Supernatanten blev anvendt som proteinekstrakt.

Western blot

For at estimere proteinkoncentrationer den Quant-iT Protein Assay Kit (Invitrogen, Life Technologies Corporation) blev anvendt. Lige protein mængder af tumor ekstrakter i PAGE-gel LDS prøve buffer (Thermo Fisher Scientific) eller celleekstrakter i Lämmli buffer blev påsat 4-20% Kriterium TGX færdigstøbte geler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eller hånd støbt 12 % geler, adskilt af natrium-dodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektroforese og overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Membraner blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk i phosphatpufret saltvand (pH 7,4) med 0,01-0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) i 1 time. Antistoffer blev opløst i 5% bovint serumalbumin eller 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand (pH 7,6) med 0,01-0,05% Tween 20. Membraner blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C eller i 1 time ved stuetemperatur. Primære antistoffer var kanin-anti-spaltet-caspase-3, kanin-anti-p44 /p42 MAPK, kanin-anti-phospho-p44 /p42 MAPK, kanin-anti-PARP, kanin-anti-GAPDH (Cell Signaling, Technology Inc.), muse-anti -β-actin (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer var HRP-koblet æsel-anti-kanin (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA), gede-anti-kanin, og ged anti-mus (både DAKO North America, Inc., Carpinteria, CA). Membraner blev inkuberet i Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrat (Thermo Fisher Scientific) og udsat for High Performance Kemiluminescens film (GE Healthcare) eller inkuberes i Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) og visualiseres i et ChemiDoc-system (Bio-Rad Laboratories). Membraner blev strippet med Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific), inden en ny blokering og inkubation med et andet sekundært antistof.

Statistisk analyse

En to-trins fremgangsmåde blev anvendt til at vurdere antiproliferativ virkning af hvert lægemiddel at falde cellelevedygtighed. I det første trin blev hver af de 6 lægemidler sammenlignet særskilt til køretøj for hvert niveau af behandlingsvarighed, dosis, og celletype. De data, der anvendes til disse analyser var de (replikerede) forhold mellem medikament og værdier divideret med middelværdien af ​​den tilhørende sæt DMSO styreværdier. Disse nøgletal, fra 2 til 4 uafhængige forsøg, blev analyseret ved hjælp af en to-vejs faste effekter ANOVA. De resulterende p-værdier blev Bonferroni-korrigeret ved at multiplicere dem med 24, antallet af konfigurationer af varighed, dosis og celletype for en given lægemiddel. Derefter blev lægemidler, der samlet set markant nedsat proliferation udvalgt og de mest effektive varighed og doser for hvert lægemiddel for hver celle type blev vurderet: ved en initial ANOVA efterfulgt af placering på grundlag af post-ANOVA betyder, efterfulgt af Student-Newman- Keuls (SNK) post hoc tests for at fastslå, hvilket betyder afveg væsentligt. De overordnede præstationer af de 3 bedste resultater lægemidler blev sammenlignet ved hjælp af en 4-vejs ANOVA (faktorer: drug, varighed, dosis, og celletype); igen SNK post hoc test blev udført for at bestemme, hvilke stoffer var generelt signifikant forskellige.

Virkningen af ​​kombinerede statiner sammenlignet med hver enkelt statin blev evalueret på en analog måde. Data er præsenteret som middelværdi og standardafvigelse (baseret på ANOVA og delta-metoden) af mindst to uafhængige forsøg. Statistiske beregninger blev udført i Stata (Release 12, StataCorp., College Station, Texas, USA).

Resultater

Beviser for MAPK-signalering i SDHB PHEOs /PGLs

som tidligere demonstreret, lovastatin udøvede en stærk anti-proliferativ virkning på MPC og MTT-celler, som blev forbundet med nedsat phospho-MAPK 1 og 3 (pMAPK1 /3) niveauer [1]. For at vurdere, om statin behandling kan være til gavn for patienter med metastatisk PGLs, vi vurderet, om pMAPK1 /3 var til stede i de aggressive SDHB-afledte PGLs og andre arvelige PHEOs /PGLs (fig. 1A). Patient og tumor oplysninger for hver prøve er vist i tabel 1. Blandt de menneskelige PHEOs /PGLs de pMAPK1 /3 niveauer var meget varierende. Selvom de gennemsnitlige pMAPK1 /3 niveauer var forholdsvis lav i SDHB tumorer i forhold til andre testede prøver, phosphorylering var tydelig i 4 ud af seks SDHB prøver. Ingen forskel mellem primære SDHB PGLs og SDHB-metastaser var tydelig.

A. Western blot af pMAPK1 /3, alt MAPK1 /3, og GAPDH i humane PHEOs /PGLs. Patient og tumor information for hver prøve er vist i tabel 1. Forkortelser: B) SDHB, D) SDHD, N) NF1, M) normale adrenale medulla. B. Heatmap viser ekspression af 21 MAPK pathway-gener i pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Ekspression af disse 21 gener blev signifikant forhøjet i SDHB forhold til normal medulla (p 0,002). Hver prøve blev tildelt et nummer. Den tilsvarende prøve identifikator fra den oprindelige artikel [33] er givet i tabel S1. Patientinformation og link til deponerede data findes i den oprindelige artikel.

Derudover har vi vurderet mRNA udtryk profil MAPK pathway gener i pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Kortlægning af 254 MAPK pathway gener til 6937 tidligere identificerede gener af interesse [33] afslørede en kamp af 85 gener. Hierarkisk gruppering af disse 85 gener afsløret to gen-klynger, hvoraf den ene indeholdt 21 gener, der syntes at være mere stærkt udtrykt i SDHB og SDHD-AT PHEOs /PGLs forhold til normal binyremarven og SDHD-HN og VHL PHEOs /PGLs (fig. 1B). Et nærmere kig på disse 21 gener afslørede generelt forøget ekspression i SDHB prøverne forhold til normal binyremarven (p 0,002) (. Figur 1B) og en ANOVA af de enkelte gener med post-hoc evaluering bekræftede signifikant højere udtryk for MAPK12, CACNB3 , CACNG7, MAP4K2, MAP3K9, og MAPK6 i SDHB PHEOs /PGLs end normalt binyremarven (p≤0.02). Således visse aspekter af MAPK signalering synes at være aktiveret i de mest aggressive SDHB-afledte PHEOs /PGLs, så målrette denne vej kan være en lovende ny behandling tilgang.

Sammenligning af

in vitro

effektiviteter af forskellige statiner

for at bestemme effektiviteten af ​​forskellige statiner på PHEOs /PGLs, vi brugte to musemodeller; MTT og MPC-cellelinier. Der forventes ingen evidens for succinatdehydrogenase dysfunktion eller underenhed mutation i MPC eller MTT celler, men i øjeblikket ingen bedre in vitro model eksisterer for at undersøge effekten af ​​nye terapeutiske muligheder for PHEOs /PGLs. Relativ cellelevedygtighed faldt med stigende behandlingsvarighed og koncentration af de forskellige statiner for MPC og MTT. Varighed på tre dages behandling med den højeste koncentration af 50 uM var mest effektiv for alle statiner (fig. 2) og viste en signifikant højere virkning sammenlignet med den samme dosis og statin på anden behandlingsdag (SNK p≤0.029 for alle statiner undtagen pravastatin, som var ineffektiv).

Procent betydelig resultaterne for alle statiner for alle behandlingsgrupper doser på de forskellige behandlingsmetoder varigheder for MPC (A) og MTT (B). Procentdelen af ​​signifikante resultater blev øget i MTT forhold til MPC efter 48 og 72 timer, hvilket tyder på, at MTT er mere følsomme over for statin behandling.

Forekomsten af ​​faldt betydeligt i forhold levedygtighed i forhold til køretøj steget med dosis og behandlingsvarighed, og disse virkninger var mere udtalt for MTT end MPC, hvilket indikerer en højere følsomhed af den mere aggressive celletype til behandling med statiner (fig. 2).

antiproliferativ virkning af de seks statiner afveg signifikant (p 0,0001). Lovastatin, simvastatin og fluvastatin demonstrerede højeste proliferation inhibering (fig. 3). Direkte sammenligning af deres anti-proliferative effektiviteter afslørede højere styrke af simvastatin og fluvastatin sammenlignet med lovastatin (p = 0,033; simvastatin vs lovastatin SNK p = 0,043, fluvastatin vs. lovastatin SNK p = 0,031).

MPC ( A-F) og MTT (G-K) blev behandlet med ▪ 6,25 uM, ▴ 12.50 uM, ▾ 25,00 uM, og ⧫ 50,00 uM af atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin, og simvastatin i 24, 48 og 72 timer.

Ud over etablering som statin er mest effektive til at hæmme celledeling i MPC og MTT, vi undersøgt, om at kombinere to forskellige statiner kan øge effektiviteten. Interessant, de fire mest effektive kombinationer alle inkluderet simvastatin: simvastatin /lovastatin, simvastatin /fluvastatin, simvastatin /atorvastatin og simvastatin /rosuvastatin. Men ingen af ​​disse kombinationer reduceret relativ levedygtighed mere effektivt end de tre mest effektive statiner, fluvastatin, simvastatin og lovastatin alene (fig. 4).

Relativ levedygtighed MPC (A) og MTT (B) ved de angivne doser og varigheder for de mest effektive kombinerede behandlinger, herunder simvastatin i forhold til simvastatin alene.

Western blot viste, at de tre mest effektive statiner alle hæmmede MAPK fosforylering ved 48 h af behandling med 25 pM (fig . 5A). Desuden fluvastatin, simvastatin, lovastatin og øget spaltningsprodukt niveauer af CASP-3 og PARP, hvilket indikerer øget apoptose (fig. 5B).

A. Western blot viser nedsatte niveauer af pMAPK1 /3 i behandlet vs. ubehandlet MPC og MTT i forhold til alt MAPK1 /3 og GAPDH. B. Western blot viser nedsat niveau af intakt PARP (top bånd) og øgede niveauer af spaltet PARP (nedre bånd) i behandlet vs. ubehandlet MPC og MTT. I overensstemmelse, spaltet CASP-3 var forhøjet i behandlede celler, hvilket indikerer apoptose. Cellerne blev behandlet med 25 pM af den angivne statin i 48 timer.

spredning af hverken MPC eller MTT var påvirket af 6,25 uM nogen testede statin efter 24 eller 48 timer. Imidlertid blev spontan cellemigration af MPC og MTT alvorligt inhiberet ved behandling med 5 pM af fluvastatin, simvastatin, lovastatin og (fig. 6). Vandrende kapacitet blev delvist reddet ved tilsætning af 100 pM trans, trans farnesol.

MPC (A) og MTT (B) blev udpladet i køretøj (CTR), 5 uM fluvastatin (Fluva), 5 uM simvastatin (Simva ), blev 5 uM lovastatin (Lova) med eller uden 100 pM trans, trans farnesol (FOH) og spontan migration registreret for 24.

diskussion

til dato ingen helbredende behandling er blevet etableret for metastatiske PHEOs /PGLs. Imidlertid har flere nye terapeutiske strategier for nylig blevet testet i modelorganismer [35] – [38], herunder lovastatin [1]. Tidligere har statiner blevet rapporteret at nedsætte spredning, overlevelse, cellecyklus progression, og migration i andre celler, herunder aggressive kræftmodeller, blandt andre ved MAPK pathway hæmning [10], [25] – [27], [29], [30 ], [39] – [41]. Men i øjeblikket tegn på, at statin behandling vil være potent i den mest aggressive form for PHEOs /PGLs, dvs. med SDHB mutationer [42], mangler.

Vores data viser, at MAPK1 /3 fosforylering er til stede i nogle SDHB-PGLs, herunder metastaser. Efter aftale en tidligere undersøgelse viste øget MAPK1 /3 fosforylering i udødeliggjort lymphoblastoids fra patienter med Cowden-lignende syndrom og germlinie SDHB eller SDHD genvarianter eller mutationer [23]. Desuden har flere MAPK-vejen gener syntes at være mere stærkt udtrykt i SDHB-PGLs end i normale adrenale medulla. Den nøjagtige funktion og potentielle inddragelse af de identificerede gener i SDHB-mutation medieret tumorigenese mangler at blive evalueret.

Som konklusion mindst en undergruppe af patienter med aggressive PGLs som viser MAPK1 /3 fosforylering kan drage fordel af statin behandling. Vores data tyder på, at denne patientgruppe ikke kan begrænses til klynge 2 PGL patienter. Bestemmelse af MAPK1 /3 fosforylering fra sag til sag i metastatiske PGLs kan være nyttige til estimering af en potentiel fordel af statin-behandling.

I en tidligere publiceret microarray baseret undersøgelse, der sammenligner PHEOs /PGLs med forskellige genetiske baggrunde, SDHX-afledte tumorer viste nedsat MAPK pathway genekspression i forhold til RET, NF1, TMEM127, og sporadiske PHEOs /PGLs [21]. Forskellen mellem dette resultat og vores data kan skyldes det faktum, at i forhold til RET, NF1, TMEM127, og visse sporadiske PHEOs /PGLs den opregulering af MAPK signalering gener kan være marginal i SDHB PHEOs /PGLs, og dermed ikke detekterbar i fravær af normal kontrol væv. Vores microarray data viste modsatrettede udtryk mønstre i SDHB og SDHD-HN PGLs med hensyn til MAPK signalering gener; dermed gruppering disse prøver kan tilsløre overekspression af MAPK-relaterede gener i SDHB PHEOs /PGLs forhold til andre PHEOs /PGLs. Her præsenterer vi flere MAPK signalering gener, der opreguleret i forhold til normale adrenale medulla. , Konkluderer således vi, at statin behandling i sig selv eller kombineret med andre terapeutiske regimer kan være til gavn i visse SDHB-afledte PHEOs /PGLs

I øjeblikket syv forskellige statiner er på markedet, -. I tillæg til deres kolesteroltal sænkning karakteristika – har vist sig at interferere med flere kræft relevante pathways [43], [44]. Deres farmakologiske virkninger og virkninger på genekspression har vist sig at afvige [43], [45], [46], og dermed afhængigt af cellerne, der skal behandles, skal bestemmes den mest effektive stof. Her viser vi, at i tilfælde af MPC og MTT, den lipofile statiner fluvastatin, simvastatin, lovastatin og væsentligt reduceret celleproliferation, med simvastatin og fluvastatin viser lidt kraftigere virkninger. Pravastatin har vist sig at være ineffektiv i flere kræftmodeller [47], [48], hvilket kan skyldes dets hydrofile egenskaber og manglen på egnede transportører på tumorcellerne. I andre undersøgelser, der sammenligner effekten af ​​flere statiner, simvastatin eller fluvastatin optrådte mere effektiv end lovastatin [24], [30]. Til yderligere undersøgelser, kan det overvejes, at de farmakokinetiske karakteristika af fluvastatin er blevet rapporteret at være at foretrække til de af simvastatin og lovastatin [45].

Interessant nok mere aggressive MTT-celler viste sig at være mere følsomme over for statin behandling, hvilket indikerer, at mere aggressive celler kan være mere modtagelig for de anti-proliferative effekter af statiner. Forskellen i mekanisme rendering MTT mere modtagelige mangler at blive belyst.

Den maksimale statin koncentration rapporteret i humant blod efter oral administration (12,3 uM) [49] var i området fra vores tredje højeste koncentration (12,5 uM) , hvilket signifikant nedsat celleproliferation i MPC og MTT på 48 eller 72 timers behandling med fluvastatin, lovastatin, simvastatin og. Holstein et al. rapporterede, at op til 415 mg /m

2 oralt hver seks timer over fire dage var godt tolereret af patienter med alvorlige maligniteter [49]. Men blod statin niveauer ikke stige lineært, og dermed oral administration kan ikke være den bedste mulighed for at opnå høje koncentrationer af væv. Optimale administration teknikker til at opnå de målrettede koncentrationer skal bestemmes. Ubetydelige virkninger af statiner på normale celler sammenlignet med cancerceller er blevet rapporteret [24], [50].

Ved ikke-toksiske koncentrationer, opnåelige ved oral indgivelse, er statiner blevet rapporteret at udvise en anden anti-cancer virkning , inhibering af cellemigration og invasion [9], [47], [51]. Derfor testede vi konsekvensen af ​​de effektive statiner, lovastatin, simvastatin og fluvastatin på spontan cellemotilitet af MPC og MTT ved 5 uM. Vores proliferationsassays viste ingen reduktion i proliferation ved 6,5 uM inden for 24 timers behandling. Lovastatin, fluvastatin, og simvastatin effektivt inhiberede migration af MPC og MTT inden for 24 timer. Migrationen-inhibering viste sig at være i det mindste delvist afhængig af farnesyl depletion, eftersom tilstedeværelsen af ​​trans, trans farnesol delvist reddet vandrende kapacitet. Imidlertid har selv et relativt høj koncentration på 100 uM trans, trans farnesol ikke helt vende den antimigrationsvirkning virkning af de tre statiner. Således kan farnesylering-uafhængige virkninger af statiner på MPC og MTT ikke udelukkes. I en tidligere undersøgelse, er geranylgeranylpyrophosphat vist sig at være mere effektive til at vende effekten af ​​statiner end farnesylpyrophosphat [24]. Desuden har ikke-mevalonat pathway afhængige statin virkninger på cancerceller også blevet beskrevet [43].

Da oral administration af statiner ikke giver koncentrationer så høje som anvendt her for at opnå de bedste anti-proliferative virkninger i vitro, synes kombinerede administration af andre lægemidler for at være en lovende strategi. Den multikinasehæmmer inhibitorer sunitinib og sorafenib påvirker også MAPK-vejen og er blevet vist at være effektiv i progressive metastatiske PGLs [52], [53]. Sunitinib behandling viste gavnlig klinisk effekt i 8 ud af 17 patienter med progressiv metastatisk PGLs. Interessant, 6 af de respondenter gennemført SDHB-mutationer. Men da de fleste antineoplastiske lægemidler kan bivirkningerne af multikinasehæmmer inhibitorer være alvorlige og ni af de 17 patienter behandlet med sunitinib måtte afbryde behandlingen eller nedsætte dosis vinder.

En synergistisk effekt af fluvastatin og sorafenib er blevet præsenteret med melanomceller in vitro [54]. Dette rummer muligheden faldende multikinasehæmmer inhibitorkoncentrationer, som kan lindre sværhedsgraden af ​​bivirkninger, mens anti-tumor effektivitet opretholdes. Imidlertid er yderligere undersøgelser mandat til at fastslå, om en kombination af multikinasehæmmer hæmmere med statiner kan have additiv virkning med aggressive PGLs. Som tidligere rapporteret, har kombineret hæmning af P 3K /AKT og mTORC1 /2 signalering blevet foreslået som lovende terapeutiske regime for visse PGLs [1].

Som konklusion, kan statiner være til gavn alene eller i kombination med andre terapeutiske regimer i patienter med aggressive PHEOs /PGLs der viser MAPK pathway aktivitet.

Støtte Information

tabel S1. Salg Sample tal fra figur 1A med tilsvarende Chip identifikatorer og prøve identifikatorer fra Shankavaram Fliedner et al. 2013 Neoplasi 15: 435-447. Patientinformation og link til deponerede microarray data findes i den originale artikel

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097712.s001

(XLSX)

Tak

Vi ville gerne takke Dr. Tischler og Dr. Martiniova for at give MPC og MTT celler. Vi er taknemmelige også til Dr. Perwitz, Ms Maushagen, og Ms. Resch til at yde ekspertrådgivning og antistoffer. Desuden vil vi gerne udtrykke vores taknemmelighed over for professor Aherrahrou og Dr. Perwitz, for generøst deler deres udstyr.