PLoS ONE: In vitro karakterisering af de farmakologiske egenskaber af Anti-Cancer chelator, Bp4eT, og dens fase I Metabolites

Abstrakt

Kræftceller har et højt krav om jern og mange eksperimentelle undersøgelser, samt klinisk forsøg har vist, at jernchelatorer er potentielle anticancer-midler. Liganden, 2-benzoylpyridine 4-ethyl-3-thiosemicarbazon (Bp4eT), demonstrerer både potente antineoplastiske og anti-retrovirale egenskaber. I denne undersøgelse blev Bp4eT og dens nyligt identificerede amidrazon og semicarbazon metabolitter undersøgt og sammenlignet med hensyn til deres anti-proliferative aktivitet over cancerceller (HL-60 human promyelocytisk leukæmi, MCF-7 human brystadenocarcinom, HCT116 human colon carcinom og A549 humane lunge adenocarcinom), ikke-kræftceller (H9c2 neonatale rotte-afledte cardiomyoblasts og 3T3 mus embryo fibroblaster) og deres interaktion med intracellulære jern puljer. Bp4eT blev påvist at være en yderst potent og selektiv antineoplastisk middel, der inducerer S-fase cellecyklusstop, mitokondriel depolarisering og apoptose i MCF-7-celler. Både semicarbazon og amidrazon metabolitter viste mindst en 300-fold fald i cytotoksisk aktivitet end Bp4eT over for både kræft og normale cellelinier. Metabolitterne mistede også evnen til at:

(1)

fremme redox cykling af jern;

(2)

binde og mobilisere jern fra labile intracellulære puljer; og

(3)

forhindre

59Fe optagelse fra

59Fe-mærket transferrin af MCF-7 celler. Derfor har dette studie viser, at meget aktive ligand, Bp4eT, metaboliseres til ikke-toksiske og farmakologisk inaktive analoger, som sandsynligvis bidrager til sin gunstige farmakologiske profil. Disse resultater er vigtige for den videre udvikling af denne lægemiddelkandidat og bidrage til forståelsen af ​​struktur og aktivitet af disse midler

Henvisning:. Potůčková E, Roh J, Macháček M, Sahni S, Stariat J, Sestak V, et al. (2015)

In vitro

Karakterisering af de farmakologiske egenskaber af Anti-Cancer chelator, Bp4eT, og dens fase I metabolitter. PLoS ONE 10 (10): e0139929. doi: 10,1371 /journal.pone.0139929

Redaktør: Ashley I. Bush, University of Melbourne, AUSTRALIEN

Modtaget: Juni 1, 2015; Accepteret: September 19, 2015; Udgivet: 13. oktober 2015

Copyright: © 2015 Potůčková et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af den tjekkiske Science Foundation (tilskud 13-15008S; www.gacr.cz).. D.R.R. tak National Health og Medical Research Council of Australia til en Senior Principal Research Fellowship og projektstøtte. DSK værdsat en NHMRC RD Wright Training Fellowship og en Project Grant (www.nhmrc.gov.au)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Jern er en essentiel cofaktor for aktiviteten af ​​mange enzymer afgørende for cellulær proliferation, herunder ribonukleotid reduktase, som katalyserer det hastighedsbegrænsende trin i DNA-syntese [1]. Da cancerceller generelt er mere metabolisk aktive end deres normale modparter, de kræver større mængder af jern [2]. Derfor målrettet jern i kræftceller ved hjælp af specifikke chelatorer er en lovende strategi for udvikling af nye anti-cancer midler [3]. Den thiosemicarbazon klasse af jernkelatorer har vist høj antineoplastisk effektivitet i både

in vitro

in vivo

undersøgelser og nogle agenter er også i fase I og II kliniske forsøg [4,5, 6,7].

ligand, 2-benzoylpyridine 4-ethyl-3-thiosemicarbazon (Bp4eT, figur 1), blev oprindeligt syntetiseret og karakteriseret ved West

et al

. [8]. Det blev senere vist at være en jern-chelator, der besad en lav, positiv Fe

3 + /2 + redoxpotentiale [9], hvilket resulterede i dannelsen af ​​toksiske reaktive oxygenarter (ROS) både i opløsning [9] og i cancer celler [10]. Faktisk viste Bp4eT høj antiproliferativ aktivitet mod humane SK-N-MC neuroepithelioma celler med lav toksicitet over for normale humane MRC-5-fibroblaster [10]. Bortset fra dens anticanceraktivitet, viste Bp4eT potent inhibering af HIV-1-transkription med virkningsfuldhed sammenlignes med en klinisk anvendte anti-retroviral agent, roscovitin og udviste lav cytotoksicitet i humane T-celle-lymfoblast-lignende cellelinie, CCRF- . CEM [11]

Bp4eT, 2-benzoylpyridine 4-ethyl-3-thiosemicarbazon; Bp4eA;

N

3

ethyl

N

1

– [phenyl (pyridin-2-yl) methylen] formamidrazone; Bp4eS, 2-benzoylpyridine 4-ethylsemicarbazone.

Med hensyn til sine farmakokinetik blev Bp4eT vist for nemt gennemtrænge sammenflydende monolag af Caco-2 celler, med permeabilitet egenskaber svarende til fælles oralt administrerede lægemidler, hvilket indikerer biotilgængelighed gennem denne terapeutiske rute [12,13]. Merlot

et al

. afslørede, at cellulær optagelse af

14C-Bp4eT i SK-N-MC neuroepithelioma celler blev medieret ved passiv diffusion og at Fe-Bp4eT kompleks blev sekvestreret i celler i et større omfang end det frie Bp4eT ligand [14,15 ]. Yderligere undersøgelser afslørede, at

14C-mærket Bp4eT blev udskilt hurtigt fra mus

via

urin og blev udskilt langsommere

via

afføringen, med de vigtigste steder af

14C Bp4eT aflejring er de organer, der er forbundet med udskillelse

e

.

g

., galdeblære, tyndtarmen og tyktarmen [15].

metabolisme og farmakokinetik af Bp4eT blev yderligere undersøgt i rotter under anvendelse af en følsom LC-MS-metoden [16,17,18]. Først blev det påvist, at Bp4eT eksisterede som en blanding af to interconvertible

E

Z

isomerer i både vandige medier og plasma, mens

Z

formular var fremherskende i den faste tilstand [16,17,18]. For det andet blev Bp4eT vist at undergå metabolisme

via

oxidation af sin thiocarbonyl delen både in vitro

in vivo

, hvilket resulterer i frembringelsen af ​​semicarbazon analog (2- benzoylpyridine 4-ethylsemicarbazone, Bp4eS, figur 1) og amidrazon derivat (

N

3

-ethyl-

N

1

-[phenyl(pyridin-2-yl)methylene]formamidrazone; Bp4eA, figur 1) [17]. Den amidrazon metabolit blev yderligere hydroxyleret

in vivo

, men den konkrete lokalisering af hydroxylgruppen på phenylringen kunne ikke identificeres [17].

Bp4eS metabolit blev detekteret som to

E-service /

Z

isomerer, der var, i modsætning til den oprindelige forbindelse, ikke-interconvertible [18]. Farmakokinetiske undersøgelser afslørede, at efter intravenøs administration af Bp4eT, eksponering af rotter for metabolitten, Bp4eS, var kun mindre i forhold til Bp4eT [18]. Tværtimod den metaboliske omdannelse af indgivet Bp4eT til Bp4eA metabolit syntes at være en vigtig biotransformation, som dens eksponering var 20% af den af ​​den oprindelige forbindelse [18].

Undersøgelse af biologiske egenskaber af narkotika metabolitter er et vigtigt skridt i farmaceutisk udvikling, da metabolitterne væsentligt kan bidrage til de farmakologiske egenskaber af det oprindelige lægemiddel [19,20], og kan også være af interesse for yderligere lægemiddelforskning. Derfor, for bedre at karakterisere Bp4eT som en lovende lægemiddelkandidat, vi vurderede

in vitro

cytotoksiske aktiviteter Bp4eT sig selv og sine to store metabolitter, Bp4eA og Bp4eS, på fire menneskelige kræftceller og to ikke-kræft celle linjer. Da jern kelation er et centralt element i virkningsmekanismen for Bp4eT, vi undersøgte evne Bp4eT og dets metabolitter til:

(i)

binde jern fra labile jern pool (LIP) af kræftceller;

(ii)

at mobilisere cellulære

59Fe; og

(iii)

forhindre cellulære optagelse af

59Fe fra

59Fe

2-transferrin. Evnen af ​​jernkomplekser af Bp4eT og dets metabolitter til at fremme ROS-dannelse blev også undersøgt under anvendelse af ascorbat oxidation assay. Desuden blev cellecyklus progression og den tilstand af celledød efter deres eksponering for Bp4eT og dets metabolitter også bestemt.

Materialer og metoder

Kemi

Bp4eT blev syntetiseret i henhold til Kalinowski

et al

. [9] og dets metabolitter blev syntetiseret som beskrevet af Stariat

et al

. [17,18]. Bestanddele til forskellige buffere og andre kemikalier (

e

.

g

., Diverse jernsalte) blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) eller Penta (Prag, Tjekkiet Republik) og var af højeste farmaceutiske eller analytisk kvalitet til rådighed

Cell kultur

den menneskelige MCF-7 bryst adenocarcinom cellelinje blev købt fra European Collection of Cell Cultures (ECACC,. Salisbury, UK). Humane HL-60 promyelocytiske leukæmiceller, humane HCT116 colorektale carcinomaceller, humane A549 lungeadenocarcinom celler, blev den H9c2 cellelinie, afledt af embryonisk rotte hjertevæv, og 3T3 muse fibroblaster opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). MCF-7, HCT116, A549, 3T3 og H9c2 celletyper blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Lonza, Basel, Schweiz). I tilfælde af MCF-7-celler, blev DMEM anvendt uden phenolrødt. DMEM suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS, Lonza), 1% penicillin /streptomycin-opløsning (Lonza) og 10 mM HEPES-buffer (pH 7,0-7,6; Sigma-Aldrich). HL-60 cellelinien blev opretholdt i RPMI-medium (Sigma-Aldrich) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 1% penicillin /streptomycin-opløsning. Alle cellelinier blev dyrket i 75 cm

2 vævskulturkolber (TPP, Trasadingen, Schweiz) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Sub-sammenflydende vedhæftende celler eller ophævelse af HL-60 celler, blev sub-dyrket hver 3-4 dage.

Cytotoksicitetsstudier

For cytotoksicitet eksperimenter, cancerceller blev podet ved en tæthed 5.000 (MCF-7), 10.000 (HL-60) eller 2.000 celler /brønd (HCT116 og A549) i plader med 96 brønde (TPP) i 24 timer /37 ° C før tilsætningen af ​​undersøgte midler. De ikke-cancerceller, 3T3 og H9c2 celler, blev dyrket i 24 timer /37 ° C i plader med 96 brønde ved en densitet på 10.000 celler /brønd, blev mediet derefter ændret til serum- og pyruvat-fri DMEM (Sigma- Aldrich) og inkuberet med cellerne i yderligere 24 h /37 ° C. De cytotoksiske virkninger af Bp4eT og dets metabolitter blev undersøgt ved forskellige koncentrationer efter en 72 h /37 ° C inkubation. For at fremme opløsningen af ​​de lipofile ligander, 0,1% dimethylsulfoxid (vol /vol) (DMSO; Sigma-Aldrich) var til stede i dyrkningsmediet fra alle grupper. Ved denne koncentration DMSO havde ingen virkning på cellulær proliferation eller levedygtighed.

Cellernes levedygtighed blev bestemt under anvendelse af et MTT-assay (Sigma-Aldrich) ifølge tidligere etablerede fremgangsmåder [21,22]. Den optiske densitet af opløseligt MTT blev målt ved λ = 570 nm, subtrahere λ = 690 nm baggrund under anvendelse af en Tecan Infinite 200M pladelæser (Tecan Group, Männedorf, Schweiz). Levedygtighed eller proliferation af forsøgsgrupper blev udtrykt i procent af de ubehandlede kontroller (100%).

Calcein-AM assay til vurdering af hastigheden af ​​cellemembranen gennemtrængning og adgang til den labile jern pool

Disse forsøg blev udført ifølge Glickstein

et al

. [23] med små modifikationer. MCF-7-celler blev podet i 96-brønds plader (10.000 celler /brønd) og fik lov til at klæbe i 24 timer /37 ° C. Celler blev fyldt med jern ved hjælp af cellulære jern donor, ferriammoniumcitrat (530 ug /ml) [24], 24 timer før forsøget, og derefter vasket. For at undgå potentielle forstyrrelser, især med hensyn til forskellige sporstoffer, blev mediet erstattet med ADS buffer (fremstillet under anvendelse af Millipore vand suppleret med 116 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1 mM CaCl

2, 1,2 mM magnesiumsulfat

4 , 1,13 mM NaH

2PO

4, 5 mM D-glucose og 20 mM HEPES, pH 7,4). Celler blev derefter fyldt med 2 pM af cellen-permeable calcein grøn acetoxymethylester (calcein-AM, Molecular Probes, Oregon, USA) i 30 min /37 ° C og vasket. Cellulære esteraser spalter acetoxymethyl grupper til dannelse cellemembranen-uigennemtrængelig forbindelse, calcein green [23]. Fluorescensen af ​​calcein green standses ved binding jern [23]. Den intracellulære fluorescens (λ

ex = 488 nm; λ

EM = 530 nm) af calcein green blev derefter fulgt som en funktion af tid (10 min efter tilsætning af 10 uM Bp4eT eller dets metabolitter) ved 37 ° C TECAN Infinite 200M pladelæser. Jern kelation effekt af metabolitterne i cellerne blev udtrykt som en procentdel af effekten af ​​den forælder chelator, Bp4eT (100%).

Udarbejdelse af

59Fe

2-transferrin

Menneskelig transferrin (Sigma) blev mærket med

56Fe eller

59Fe (PerkinElmer, Massachusetts, USA) for at producere

56Fe

2-transferrin eller

59Fe

2-transferrin (

59Fe

2-Tf), henholdsvis med en endelig specifik aktivitet på 500 pCi /pmol Fe, som beskrevet tidligere [24,25]. Ubundet

59Fe blev fjernet ved udtømmende vakuum dialyse mod et stort overskud af 0,15 M NaCl pufret til pH 7,4 med 1,4% NaHCO

3 ved standardmetoder [24,25].

Virkningen af ​​Bp4eT og metabolitter på at mobilisere cellulære

59Fe.

for at undersøge muligheden af ​​undersøgte forbindelser til at mobilisere cellulære

59Fe fra MCF-7 celler, blev udført jern efflux eksperimenter ved anvendelse af etablerede teknikker [21,22] . Kort fortalt, efter forudgående mærkning sammenflydende MCF-7-celler på plader med 6 brønde med 0,75 uM

59Fe

2-Tf i 3 timer /37 ° C blev cellerne vasket fire gange med iskold PBS og derpå efterfølgende inkuberet med 25 uM Bp4eT eller dets metabolitter i 3 timer /37 ° C. Den overliggende medium indeholdende frigivet

59Fe blev derefter dekanteret fra cellerne. Radioaktivitet blev målt i både cellerne og supernatanten ved hjælp af en γ-scintillationstæller (Wallac Wizard 3, Turku, Finland).

Effekt af de undersøgte agenter på at forebygge cellulære

59Fe optagelse fra

59Fe

2-transferrin.

evne til chelatorer at forhindre cellulære

59Fe optagelse fra

59Fe

2-transferrin blev undersøgt ved hjælp af standard teknikker [26,27]. Kort fortalt blev sammenflydende MCF-7-celler i 6-brønds plader inkuberet med 0,75 uM

59Fe

2-Tf i 3 timer /37 ° C i nærvær af Bp4eT eller dets metabolitter (25 uM). Cellerne blev derefter vasket fire gange med iskoldt PBS og niveauet af internaliserede

59Fe blev bestemt ved at inkubere cellemonolaget i 30 min /4 ° C med den generelle protease, pronase (1 mg /ml; Sigma-Aldrich ). Cellerne blev derefter fjernet fra monolaget med en plastik spatel på is og centrifugeret i 1 min /12.000 x

g

/4 ° C. Supernatanten repræsenterer membranbundne, Pronase-følsomme

59Fe, der blev frigivet af protease, mens Pronase-ufølsomme fraktion repræsenterer internaliseret

59Fe [21,26,27]. Mængden af ​​internaliseret

59Fe blev udtrykt som en procentdel af

59Fe internaliseret af kontrol (ubehandlede) celler.

ascorbat oxidation assay

ascorbat oxidation assay blev anvendt til at vurdere redox aktivitet af jernkomplekser af chelatorer under anvendelse af en etableret protokol [26,28]. Kort fortalt blev 100 uM ascorbinsyre fremstilles umiddelbart før forsøget og inkuberet enten alene eller i nærvær af 10 uM FeCl

3 i en 50 gange molært overskud (500 uM) af citrat og chelatorer. Chelatorer blev analyseret ved jernbindende ækvivalenter (IBE) på 0,1 (overskud af jern), 1 (fuldt koordinerede jern-chelator-komplekser) og 3 (overskud af fri chelator). Faldet i absorbans ved λ = 265 nm blev målt efter en 10 og 40 min inkubation ved stuetemperatur under anvendelse af Tecan Infinite 200M pladelæser. Faldet i absorbans mellem de to tidspunkter blev beregnet og udtrykt som en procentdel af kontrol uden chelator.

Cell cyklus analyse

For at undersøge effekten af ​​de agenter på cellens cyklus, MCF -7 celler blev podet i 60 mm petriskåle ved en tæthed på 240.000 celler /skål og inkuberet med Bp4eT eller dets metabolitter i 72 timer /37 ° C. Cellerne blev derefter høstet, fikseret med ethanol og farvet med propidiumiodid (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i 30 min /37 ° C, som tidligere [29] beskrevne. Celler blev analyseret ved anvendelse Accuri C6 flowcytometer (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA USA). Propidiumiodid blev ophidset ved λ

ex = 488 nm og fluorescens analyseret på λ

em = 585 nm (FL-2) med i alt 10.000 hændelser indsamlet pr analyse.

Fluorescens mikroskopi vurderinger

markører, der anvendes til at vurdere autofagi /apoptose /nekrose i MCF-7 celler og ændringer i lysosomal og mitokondriel morfologi blev observeret ved anvendelse af en Eclipse Ti inverteret epifluorescensmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan), der var udstyret med en afkølet digital kamera Zyla 5.5 sCMOS (Andor Technology, Belfast, UK), og NIS-Elements C 4.1 software (Laboratory Imaging, Prag, Tjekkiet). MCF-7-celler blev podet i plader med 6 brønde med dækglas på bunden ved en densitet på 150.000 celler /brønd og inkuberet som beskrevet ovenfor i nærvær eller fravær af 10 eller 100 nM Bp4eT.

Sådan vurdere den mekanisme af celledød efter inkubation med Bp4eT, triple farvning med monodansyl cadaverin (MDC, 50 uM; λ

ex = 390 nm; λ

em = 455 nm; Sigma-Aldrich), annexin V-FITC ( 5 pi /ml; λ

ex = 495 nm; λ

em = 519 nm; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og propidiumiodid (5 ug /ml; λ

ex = 560 nm; λ

eM = 630 nm) blev anvendt. MDC er en markør for autophagosomes og lysosomer og resultater i blå fluorescens [30,31]. Som en positiv kontrol for autophagy blev MCF-7-celler inkuberet med 1 nM rapamycin (Sigma-Aldrich) i 30 min /37 ° C, hvilket er en etableret inducer af autofagi [30]. Annexin V har høj affinitet til phosphatidylserin, som omplantes til overfladen af ​​både efterløns- og sen-fase apoptotiske celler [32,33]. Således tjente annexin V-FITC som en markør af apoptose, når de apoptotiske celler havde grønne fluorescerende cytoplasmatiske membraner. Propidiumiodid er en nekrotisk markering, eller en markør for sent stadium apoptose, da den ikke trænge ind i celler med intakte cytoplasmiske membraner [34]. Cellerne blev inkuberet med disse prober for 10 min /37 ° C, vasket med frisk dyrkningsmedium og billederne taget med mikroskop skitseret ovenfor.

For at bestemme virkningen af ​​Bp4eT på mitokondrisk morfologi, cellerne blev inkuberet med MitoTracker

® Green FM (0,25 uM; λ

ex = 490 nm; λ

em = 516 nm; Molecular Probes) i 10 min /37 ° C. Cellerne blev derefter vasket med frisk medium og billederne taget med mikroskopet ovenfor beskrevne.

Western blot-analyse

Etablerede protokoller blev anvendt til fremstilling cellelysater og udfør immunoblotanalyse [35]. Primære antistoffer anvendes, omfatter: kanin LC3 (Cat #: MBPM036; 1:. 2.000) fra Abacus (Brisbane, Australien) og muse β-actin fra Sigma-Aldrich (Cat #:: A1978, 1 10.000.). blev anvendt følgende sekundære antistoffer: peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-kanin (Cat #:. A6154, 1: 1,0000) og anti-muse (. Cat #: A4416, 1: 10.000) antistoffer fra Sigma-Aldrich . For at sikre lige belastning af proteiner blev membraner probet for β-actin.

caspaseaktivitet vurderinger

For at vurdere virkningen af ​​forbindelserne på caspaseaktivitet, MCF-7-celler blev inkuberet med 100 nM Bp4eT eller dets metabolitter i 3, 24 eller 72 timer /37 ° C i plader med 96 brønde som beskrevet ovenfor. Cellerne blev derefter lyseret ved tilsætning af 100 pi kold lysebuffer (100 mM HEPES, 10 mM CHAPS, 10 mM D-L-dithiothreitol, pH 7,4) til 100 pi medium i hver brønd. Lysater blev straks frosset ved -80 ° C. Optøede lysater blev anvendt til at vurdere caspaseaktivitet hjælp luminescerende kits til caspaser 3/7, 8 og 9 (Promega, Madison, WI, USA). Luminescensen blev målt under anvendelse af Tecan Infinite 200M pladelæser. Caspase aktivitet i de eksperimentelle grupper blev korrigeret i overensstemmelse med den cellulære levedygtighed hver gruppe og udtrykt som en procentdel af aktiviteten af ​​ubehandlede kontrol (100%).

Dataanalyse og statistik

SigmaStat for Windows 3.5 (Systat software, San Jose, CA, USA) statistisk programpakke blev anvendt til at analysere resultaterne. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD af et givet antal forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en en-vejs ANOVA med en Bonferroni

post-hoc

test eller Students

t

-test. Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikant, når

s

0,05. IC

50 værdier blev beregnet under anvendelse CalcuSyn 2.0-software (Biosoft, Cambridge, UK). Cell cyklus analyse blev evalueret ved brug multicycle AV Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA).

Resultater og Diskussion

Bp4eT metaboliseres til forbindelser med mindst 300 gange fald i cytotoksicitet mod både kræft og ikke-kræft celler

Den cytotoksiske aktivitet af Bp4eT blev sammenlignet med Bp4eA (anvendt som en blanding af

E

Z

isomerer) og Bp4eS (i to isomere former:

E-

Bp4eS og

Z-

Bp4eS).

E

Z

isomerer af Bp4eS blev undersøgt hver for sig, da de var begge opdaget

in vivo

i tidligere undersøgelser [18], og dermed er biologisk signifikant. Disse to isomerer er, ikke interconvertible og er separate forbindelser, som kan isoleres og analyseres [18]. I modsætning hertil Bp4eA let interconverts mellem

E

Z

isomere stater [18], og på grund af denne iboende fysisk egenskab, kun blandingen af ​​disse isomerer kan vurderes. I disse undersøgelser blev virkningerne af midlerne på cancerceller undersøgt under anvendelse af human HL-60 promyelocytisk leukæmi, human MCF-7 brystadenocarcinom, human HCT116 colorectal carcinom og humane A549 lungeadenocarcinom cellelinier, samt to ikke-kræft celle- typer, nemlig rotte H9c2 cardiomyoblasts og mus 3T3 fibroblaster.

Efter en 72 timers inkubation, den oprindelige forbindelse, Bp4eT viste meget potente cytotoksiske virkninger mod HL-60, MCF-7 og HCT116 celler, hvor IC

50 værdier varierede fra 3 til 15 nM (tabel 1 og figur 2A). Den anti-cancer aktivitet af Bp4eT over for disse cellelinier var markant større end den af ​​de klinisk anvendte chelateringsmidler, deferoxamin eller deferasirox, som har IC

50 værdier i uM området mod cancerceller [9,36,37,38] . IC

50 værdi på Bp4eT mod A549-celler var moderat (IC

50 = 0,593 ± 0,148 uM) og var sammenlignelig med de cytotoksiske virkninger af Bp4eT mod H9c2 cardiomyoblasts (IC

50 = 0,524 ± 0,157 uM; tabel 1). IC

50 værdi på Bp4eT mod 3T3 fibroblastceller (IC

50 = 1,309 ± 0,337 uM; tabel 1) var to gange større end observeret med H9c2 celler. Faktisk 3T3 fibroblaster var den mest modstandsdygtige af alle celletyper til hver agent undersøgt. Desuden cytotoksicitet Bp4eT mod 3T3 fibroblastceller svarede til observeret tidligere mod human MRC-5 fibroblastceller, med IC

50 værdier spænder fra 0,7 til . 6 uM [9,10,39]

til bestemmelse af anti-proliferativ aktivitet, de cancer cellelinier (

jeg

.

e

., HL-60, MCF-7, HCT116 og A549) og ikke -cancer cellelinjer (

i

.

e

., H9c2 og 3T3) blev inkuberet med midlerne i 72 timer /37 ° C og proliferation derefter vurderet under anvendelse af MTT-assayet. Resultaterne er gennemsnit ± SD (

n

≥ 4 eksperimenter).

Det terapeutiske indeks blev beregnet ved at dividere IC

50 i normale celler, som IC

50 opnået i neoplastiske celler, og dette indeks fungerede som et mål for selektiviteten af ​​midlet i retning cancerceller (tabel 2). Vigtigere, de terapeutiske indeks for Bp4eT mod HL-60, MCF-7 og HCT116 cancerceller var høje (fra 34,9 til 436,3, tabel 2), hvilket indikerer selektiviteten af ​​Bp4eT mod disse cancer-typer. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser demonstrerer potent og selektiv antineoplastisk aktivitet af Bp4eT [9,40]. Som beskrevet ovenfor, selektiviteten af ​​Bp4eT mod A549-celler var lav, hvilket resulterer i terapeutiske indeks for 0,9-2,2 (tabel 2).

Bp4eT metabolitter viste en markant fald i cytotoksicitet mod både kræft og ikke -cancerous cellelinier (Tabel 1 og fig 2) og deres IC

50 værdier var 300 gange højere i forhold til den overordnede middel. Den amidrazon, Bp4eA, der blev identificeret som den vigtigste metabolit af Bp4eT [18], var generelt mere cytotoksisk mod cancerceller (med undtagelse af HCT116 celler) end semicarbazon metabolit, Bp4eS. IC

50 værdier af Bp4eA mod kræftceller varierede fra 52 til 207 uM (tabel 1). Derudover cytotoksicitet Bp4eA mod ikke-ondartede celler var lavere i sammenligning med de kræftceller undersøgte med IC

50 værdier på 416,1 ± 122,1 um og 1027,4 ± 203,9 pM for H9c2 og 3T3-celler, hhv. Dette kom også til udtryk i de terapeutiske indeks for Bp4eA, som lå fra 2,0 til 19,7 (tabel 2). Vigtigt er det, blev de toksiske koncentrationer af Bp4eA mod normale celler ikke nået i plasma under vores tidligere farmakokinetisk undersøgelse hvor den højeste koncentration af Bp4eA nåede var 1 pM efter 300 minutter efter

jeg

.

v

. administration af Bp4eT [18]. Dette viser tydeligt, at Bp4eA niveauer i plasma var på ikke-toksiske koncentrationer.

Både ikke-interconvertible

E

Z

isomerer af Bp4eS metabolit blev tidligere identificeret ved lave koncentrationer ( 0,02 uM) i plasma [18]. Vores resultater viste, at Bp4eS generelt haft dårligere anti-proliferative aktivitet end Bp4eA (tabel 1 og figur 2), med IC

50 værdier på mellem 46 til 536 um i cancerceller og 343 um og 1 mM i ikke-kræft H9c2 og 3T3-celler, hhv. Overraskende viste hver cellelinie forskellen følsomhed over for

E

og

Z

isomerer af Bp4eS. Selvom HL-60 og H9c2 celler var signifikant (

s

0,001) mere følsomme over for

Z

isomer, HCT116 og A549 celler var signifikant (

s

0,01) mere følsomme over for

E

isomer af Bp4eS (tabel 1). I modsætning hertil MCF-7-celler var ca. lige følsomme for både

E

Z Salg isomerer af Bp4eS (tabel 1). I forhold til Bp4eT, de terapeutiske indekser i den

E

Z

isomerer af Bp4eS var generelt lav, især mod H9c2 celler og varierede fra 0,6 til 21,6 (tabel 2). Da

E

Z

isomerer af Bp4eS blev kun påvist i meget lave koncentrationer i plasma [18], og da deres cytotoksiske virkninger kun opstår ved høje koncentrationer, kan det foreslås, at Bp4eS ville vise lav anti-proliferativ aktivitet mod kræftceller og toksicitet for normale celler

in vivo

.

evne Bp4eT metabolitter at chelatere jern fra labile jern pool, mobilisere cellulære

59Fe og forhindre cellulær

59Fe optagelse fra

59Fe

2-transferrin er ubetydelig sammenlignet med Bp4eT

evne Bp4eT og dets metabolitter til at chelatere jern fra LIP i MCF-7 celler blev undersøgt i denne undersøgelse ved anvendelse af calcein-AM assay som jernkelations og udtynding menes at spille en rolle i anti-cancer-aktiviteten af ​​thiosemicarbazoner [3,9]. Stamforbindelsen, Bp4eT (10 uM), viste en tidsafhængig stigning i fluorescens, skyldes muligheden for Bp4eT til at chelatere jern fra calcein-AM i MCF-7-celler (Fig 3A). I modsætning hertil tilsætningen af ​​Bp4eT metabolitter havde næsten ingen virkning på calcein-AM fluorescens (fig 3A). Når udtrykt i procent af Bp4eT fluorescens ved

t

= 600 s, metabolitten, Bp4eA, viste kun 5,9% af chelatering effekten af ​​Bp4eT, mens begge isomerer af Bp4eS demonstrerede ≤1.0% af fluorescensen af ​​Bp4eT (fig 3B).

effekten af ​​Bp4eT eller dets metabolitter til at chelatere jern fra LIP af MCF-7-celler blev målt under anvendelse af calcein-AM assay. (A) Fluorescens af frit calcein efter tilsætning af 10 uM Bp4eT eller dets metabolitter i 10 min /37 ° C. (B) Intensitet af fluorescens af frit calcein i nærvær af metabolitterne ved

t

= 600 s blev udtrykt i procent af fluorescensen af ​​frit calcein i nærvær af Bp4eT. Resultaterne af (A) og (B) er gennemsnit ± SD (

n Salg = 6 forsøg). Statistisk signifikans (ANOVA): ***

s

0,001 sammenlignet med Bp4eT. (C) udstrømning af

59Fe medieret af kontrolmedium eller medium indeholdende midlerne (25 uM) efter en 3 h /37 ° C inkubation af MCF-7-celler prelabeled med

59Fe-transferrin. (D) Optagelse af

59Fe fra

59Fe

2-transferrin af MCF-7-celler i nærvær af kontrolmedium eller medium indeholdende midlerne (25 uM) blev bestemt efter en 3 h /37 ° C inkubation. Resultaterne af (C) og (D) er gennemsnit ± SD (

n

≥ 3 eksperimenter). Statistisk signifikans (ANOVA): ***

s

0,001 sammenlignet med kontrol (ubehandlede) gruppe. (E) The ascorbat oxidation assay blev anvendt til at undersøge dannelsen af ​​redoxaktive komplekser. Bp4eT og dets metabolitter blev analyseret ved jern bindende ækvivalenter (IBE) på 0,1 (overskud af jern til chelator); 1 (fuldt komplet koordinering shell); og 3 (overskud af chelator til jern). Chelatorerne, DFO og EDTA, blev anvendt som anti-oxidative eller pro-oxidative kontroller, henholdsvis. Data er udtrykt som en procentdel af kontrolgruppen uden chelator på samme IBE (100%). Resultaterne af (E) er gennemsnit ± SD (

n

≥ 3) eksperimenter. Statistisk signifikans (ANOVA): ***

s

0,001 sammenlignet med kontrolgruppen (jern med ascorbat) i den samme IBE. (F) MCF-7-celler blev inkuberet i 72 timer /37 ° C med 100 nM Bp4eT eller dets metabolitter, Bp4eA og Bp4eS. Cellecyklusanalyse blev behandlet ved flowcytometri under anvendelse af propidiumiodid. Fase kvantificering blev vurderet ved anvendelse multicycle AV Software. Resultaterne af (F) er gennemsnit ± SD (

n

≥ 3 eksperimenter). Statistisk signifikans (ANOVA): *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

0,001 sammenlignet med kontrolgruppen.

Desuden Bp4eT demonstrerede høj

59Fe mobilisering effekt og var i stand til at mægle frigivelse af 46,4% af den samlede cellulære

59Fe (fig 3C). Ingen af ​​Bp4eT metabolitter resulterede i et betydeligt udslip af cellulære

59Fe og var sammenlignelige med den ubehandlede kontrol (3,5% af den samlede

59Fe, Fig 3C).

evne Bp4eT og dets metabolitter at forhindre den cellulære optagelse af

59Fe fra

59Fe

2-transferrin efter en 3 h /37 ° C inkubation blev også undersøgt i MCF-7-celler. Vigtigt er det, den forælder chelator, Bp4eT, viste høj

59Fe kelation effekt og hæmmede internaliseret

59Fe optagelse til 11,5% af kontrollen (Fig 3D). Som observeret i

59Fe efflux assay, både Bp4eA og Bp4eS viste dårlig

59Fe kelation effekt og deres evne til at hæmme

59Fe optagelsen var sammenlignelig med den ubehandlede kontrol (Fig 3D).

*

s

Be the first to comment

Leave a Reply