PLoS ONE: Regulering af kræft Aggressive funktioner i melanomaceller ved MikroRNA’er

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA med regulatoriske roller, der er involveret i et bredt spektrum af fysiologiske og patologiske processer, herunder kræft. En fælles strategi for identifikation af miRNA involveret i celletransformation er at sammenligne maligne celler til normale celler. Her fokuserer vi på identificering af miRNA, der regulerer den aggressive fænotype af melanomceller. For at undgå forskelle skyldes genetiske baggrund blev en sammenlignende high-throughput miRNA profilering udføres på to isogene humane melanom cellelinjer, der viser store forskelle i deres net spredning, invasion og dannelse rør aktiviteter. Denne screening afslørede to store kohorter af differentielt udtrykte miRNA. Vi spekuleret på, at miRNA opreguleret i mere aggressiv cellelinje bidrage onkogene funktioner, mens de ned-regulerede miRNA er tumor undertrykkende. Denne antagelse blev yderligere testet eksperimentelt på fem kandidat tumor undertrykkende miRNA (MIR-31, -34a, -184, -185 og -204) og én kandidat onkogene miRNA (MIR-17-5p), som alle er aldrig blevet rapporteret før i kutant melanom. Bemærkelsesværdigt, alle kandidatlande Smittespredningshæmmende-miRNA hæmmede netto proliferation, invasion eller rør dannelse, mens miR-17-5p forbedret celleproliferation. MIR-34a og MIR-185 blev yderligere vist at hæmme væksten af ​​melanom xenotransplantater når de implanteres i SCID-NOD mus. Endelig blev opdaget alle seks ansøgerlande miRNA i 15 forskellige metastatisk melanom prøver, der attesterer for den fysiologiske relevans af vores resultater. Tilsammen kan disse fund bevise medvirkende til forståelse mekanismer på sygdom, og for udvikling af nye terapeutiske og mellemstationer teknologier til melanom

Henvisning:. Greenberg E, Hershkovitz L, Itzhaki O, Hajdu S, Nemlich Y, Ortenberg R, et al. (2011) Regulering af Cancer Aggressive funktioner i melanomaceller ved MikroRNA’er. PLoS ONE 6 (4): e18936. doi: 10,1371 /journal.pone.0018936

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: December 6, 2010; Accepteret: 13 marts 2011; Udgivet: 25 April, 2011

Copyright: © 2011 Greenberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Gal Markel er støttet af Recanati Foundation for Medical Research (# 6713). Noam Shomron understøttes af Chief Scientist Office, Sundhedsministeriet, Israel (# 3-4876); Den Kurz-Lion Foundation; Den Tel-Aviv University, Lægevidenskabelige Fakultet, Schreiber Foundation; og The Wolfson Family Charitable Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

melanom, en aggressiv malignitet følge af melanocytter, er en af ​​de vigtigste livstruende maligniteter af vor tidsregning. Mens den tegner sig for næsten 4% af alle hudkræft, det forårsager 75% af hudkræft dødsfald på verdensplan og anses for at være den mest almindelige dødelige malignitet af unge voksne [1]. Transformation og udvikling af metastaser kræver trinvis overtagelse af aggressive egenskaber. Disse indbefatter for eksempel ukontrolleret vækst, modstandsdygtighed over for apoptose, motilitet, proteolytisk kapacitet og adhæsion (gennemgået i [2], [3]). Desuden plasticitet melanomceller er tydelig ved deres evne til at danne rørlignende strukturer [4]. Disse funktionelle vaskulære strukturer består af tumorceller [5], og deres tilstedeværelse er forbundet med dårlig prognose [6], [7]. Seneste udvikling af målrettet terapi for modermærkekræft understreger vigtigheden af ​​molekylære afgrænsning af de underliggende mekanismer patogenese [8].

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodning, 19-22 nukleotid lange RNA molekyler, som funktion som specifikke epigenetiske regulatorer af genekspression ved inhibering proteintranslation, hvilket mRNA til nedbrydning eller begge [9], [10]. Når forarbejdet fra deres karakteristiske hårnål udskrifter og indlæses i Argonaute protein lyddæmpning komplekse, til miRNA par med cytoplasmatisk mRNA direkte posttranskriptionel undertrykkelse. Den “frø” region, som findes mellem nukleotider 2 til 8 af den modne miRNA, binder sig til komplementære regioner i 3 ‘un-oversat region (3’-UTR) af target mRNA. Til dato, tæt på 1.000 menneskelige miRNA er blevet identificeret [11], som menes at regulere på mere end 50% af de menneskelige gener [12].

miRNA er involveret i reguleringen af ​​mange biologiske processer, såsom som fosterudvikling, celledifferentiering, cellecyklus, apoptose og angiogenese (gennemgået i [13]). De er også direkte impliceret i cancer udvikling, progression og metastase

in vitro

,

in vivo

rapporteret selv hos patienter [10], [14]. I nogle tilfælde er cancer lettes ved tabet af visse miRNA, såsom miR-15/16 klynge i kronisk lymfatisk leukæmi [15], MIR-34a i uveal melanom [16] og MIR-31 i mesotheliom [17]. Tabet af disse miRNA forbedrer invasivitet, migration og proliferation af cancerceller. I andre tilfælde er cancer lettes ved overekspression af andre miRNA, såsom MIR-17-92 klynge [13], [18], som fremmer migration og invasion i flere maligniteter.

I øjeblikket er vores viden om de roller, miRNA i melanom udvikling og progression er stadig begrænset. For nylig, flere komparative miRNA profilering studier af normale melanocytter og melanom celler afsløret: 1) Grupper af miRNA, der er forbundet med malign transformation, progression og metastatisk potentiale [19]; 2) Specifikke udtryk profiler, der var forbundet med mutationsstatus og overlevelse [20]; 3) Differential miRNA mønstre i melanom af unge voksne og ældre voksne [21]; og 4) Forudsigelse af post-recidiv overlevelse [22]. Men ingen af ​​disse undersøgelser er beskrevet miRNA, der direkte bestemmer aggressive træk ved kutan melanom, såsom forøget proliferation, motilitet og invasion. Kun få hæmmende miRNA blev identificeret i melanom, herunder miR-34a (uveal melanom) [16], miR-193b [23], lad-7a [24], og miR-211 [25], [26], mens miR-182 [27] og mIR-221/222 [28] viste sig at stimulere metastatiske potentiale melanomceller. I betragtning af den kritiske vurdering af aggressiv versus ikke aggressiv melanom, og potentialet af terapi, finder vi det nødvendigt at lære de molekylære begivenheder aggressiv melanom.

Her har vi fokus på high-throughput identifikation af miRNA, der er direkte involveret i bestemmelsen af ​​en aggressiv melanom-fænotype. To isogene melanom-cellelinjer med en anden aggressiv mønster, de meget aggressive C8161 celler og de dårligt aggressive C81-61 celler, blev underkastet differentiel high-throughput screening af miRNA. Vi antager, at på grund af den isogene baggrund af cellerne, ville de differentielt udtrykte miRNA grupper beriges for miRNA med en direkte virkning på aggressive melanoma funktioner. Faktisk giver vi eksperimentelle beviser

in vitro

,

in vivo

i kliniske melanom prøver, der tidligere kendte tumor-undertrykkende og tumorfremmende miRNA passer denne hypotese. Bemærkelsesværdigt, beskriver vi nye miRNA med lidt oplysninger om deres rolle i cancer, såsom miR-185. De videnskabelige og translationelle konsekvenser af denne undersøgelse diskuteres.

Resultater

Differential aggressivitet melanom isogen cellelinjer

Den meget aggressive (HAG) C8161 og dårligt aggressive (PAG) C81-61 kutane melanomcellelinier blev afledt fra forskellige metastaser fra den samme patient [29]. Den differentielle aggressive fænotype på HÅG og PAG celler blev bekræftet af fire forskellige funktionelle assays: spredning, invasion gennem matrigel, dannelse rør i matrigel og dannelse af tumorer i xenotransplanterede mus. Faktisk viste HAG celler væsentligt højere spredning, invasion og dannelse rør kapaciteter

in vitro

, end PAG celler (figur 1, A-C). Desuden subkutan injektion af 1 x 10

6 HAG celler dannede tumorer i SCID-NOD mus inden for fem dage efter injektion, med en gennemsnitlig xenograft størrelse på 780 mm

3 ved dag 30. I modsætning hertil injektion af 1 × 10

6 PAG celler ikke udvikle sig til målbare tumorer inden for 30 dage (Figur 1D). Små PAG tumorer (-200 mm

3) blev observeret 90 dage efter injektion af PAG-celler (data ikke vist)

(A) Proliferation blev bestemt med standardiseret XTT kolorimetrisk assay 24 timer efter podning. . Antallet af HAG celler blev bestemt som 100%. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af tre udførte; (B) Procentdelen af ​​invaderende celler testet i en 20 h matrigel invasion assay. Resultaterne blev korrigeret for spredning sats. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af tre udførte; (C) HAG celler eller PAG-celler blev testet for dannelse rør aktivitet. Repræsentative hele feltet mikrofotografier er vist fra et repræsentativt forsøg ud af tre udførte; (D) De gennemsnitlige tumormasser dannet i SCID-NOD mus 30 dage efter injektion af 1 x 10

6 celler af HAG eller PAG cellelinier. Hver gruppe omfattede mindst seks mus.

Differentiel udtryk profil miRNA blandt HAG og PAG celler

Den bemærkelsesværdige fænotypisk forskel mellem de to isogene melanom linjer omfattede platform for at studere epigenetisk regulering af aggressive funktioner ved miRNA. En sammenlignende high-throughput profilering af miRNA blev udført. Vigtigere, blev et sæt af 81 miRNA udtrykt ved højere niveauer i HAG sammenlignet med PAG-celler (HAG

høj). Et andet sæt af 69 miRNA blev udtrykt ved lavere niveauer i HAG sammenlignet med PAG-celler (HAG

lav). En gruppe på 48 miRNA ud af de 81 HAG

høje miRNA blev ikke udtrykt overhovedet i PAG celler (figur 2A), mens 56 miRNA ud af de 69 HAG

lave miRNA ikke blev påvist i HAG celler (figur 2B). Resten af ​​de differentielt udtrykte miRNA blev fundet i begge cellelinier ved forskellige kvantificerbare, beløb (Figur 2C). Vi antager, at disse miRNA klynger ville blive beriget for miRNA, der er involveret i direkte regulering af de forskellige fænotypiske forskelle. Mere specifikt, vi spekuleret på, at HOJ

lave miRNA ville blive beriget med miRNA tegner sig for undertrykkende virkninger på forskellige celle funktioner f.eks spredning (Suppressiv miRNA), mens HAG

høje miRNA ville blive beriget med miRNA med onkogene eller tumorfremmende effekter (oncogen miRNA) (figur 2).

(A) Listen over miRNA, der er udtrykt i HAG celler, men ikke i PAG celler; (B) Listen over miRNA, der er udtrykt i PAG celler, men ikke i HAG celler; (C) Relativ ekspression af miRNA, der udtrykkes i både HAG og PAG-celler. Ekspression af HAG-til-PAG-forhold (Y-akse) er vist som 2∧-ΔΔCt. HAG

lav repræsenterer miRNA med lav HAG-til-PAG-forholdet. HAG

høj repræsenterer miRNA med høj HAG-til-PAG-forholdet.

Valg af miRNA for specifikke funktionelle assays

Vi fokuserede primært på HAG

lave miRNA, som er formentlig tumor-undertrykkende og kunne danne grundlag for nye behandlingsforløb for modermærkekræft. miRNA med tumor-undertrykkende potentiale blev analyseret for forudsagte mål med Targetscan algoritme [30], og for de berørte biologiske processer med Miranda (miRpath) algoritme [31]. Alle de potentielt berørte biologiske processer blev rangordnet efter den samlede P-værdi, med en cut-off af 0,01. Yderligere fokus på de robuste processer blev aktiveret ved at vælge biologiske processer, der indgår mindst 30 kandidat målgener. Bemærkelsesværdigt, disse beregningsmæssige trin fremhævet fire biologiske processer, der er meget involveret i kræft, herunder Wnt sti (82 gener, P = 1,7 × 10

-9), fokal vedhæftning (100 gener, P = 8,6 × 10

– 9), MAPK-vejen (120 gener, P = 2 × 10

-7) og Phosphatidylinositol pathway (35 gener, P = 7,2 × 10

-3). Tyve ni af miRNA blev forudsagt at målrette mod alle fire processer, med kun 12 blevet rapporteret at eksperimentelt udøve en undertrykkende virkning på nogen kræft.

I alt fem kandidat Smittespredningshæmmende miRNA, som aldrig har været undersøgt i melanom, blev udvalgt til kloning og eksperimentelle forsøg. Tre miRNA var inden udtryk interval (miR-34a, miR-185 og miR-204, figur 2C) og to, som blev bragt til tavshed (miR-31 og miR-184, figur 2B) i HAG celler. MIR-17 blev valgt som et eksempel for kandidat oncogen miRNA (figur 2C). Den differentielle ekspression af hvert af disse miRNA blev valideret i to uafhængige RNA præparater (data ikke vist). Forskellige roller miR-17, miR-31 og miR-34a i cancer er blevet rapporteret før, selvom aldrig i kutant melanom. Derimod er der er knappe beviser på rollerne som miRNA -184, -185 og -204 i cancer. Exemplar forudsagde roller i biologiske og molekylære funktioner vedrørende disse miRNA er sammenfattet i supplerende tabel S1 [32].

Expression profil af udvalgte miRNA i kliniske melanom prøver

Femten patient-afledte primære kulturer af melanom blev analyseret for ekspressionsniveauet for de valgte miRNA. Alle melanom kulturer blev etableret fra fjerne metastaser. Supplerende data om de patienter, findes i supplerende tabel S2. Som forventet blev en betydelig variation i miRNA udtryk observeret blandt de enkelte prøver, hovedsageligt af miR-31 (figur 3). Den gennemsnitlige udtryk niveau af de fleste kandidat Smittespredningshæmmende miRNA i kliniske prøver var mellem de tilsvarende miRNA værdier i PAG og HAG celler, bortset fra miR-185 og miR-31. Mens gennemsnitshøjden af ​​MIR-185 var meget tæt på PAG-celler, MIR-31 niveauer var klart højere end selv PAG-celler (figur 3). I modsætning hertil var den gennemsnitlige ekspression af kandidat oncogen MIR-17 blandt de kliniske prøver var endnu højere end i HAG celler (figur 3). De miRNA udtryk mønstre i kliniske prøver viser direkte, at de fleste kandidat Smittespredningshæmmende miRNA, med undtagelse af miR-31, udtrykkes på et betydeligt lavere niveau end kandidaten oncogen miR-17 (figur 3). Disse resultater enig med vores hypotese og foreslå, at den tilgang, der anvendes til at identificere funktionelle Smittespredningshæmmende og oncogen miRNA har fysiologisk relevante grunde.

udtryk for kandidat Smittespredningshæmmende eller oncogen miRNA, som anført, i HAG (stribede søjler), PAG (grå søjler) og 15 lav passage primære kulturer af metastatisk melanom (sorte søjler). Vandret linje afbilder den gennemsnitlige ekspression. Y-aksen angiver absolut udtryk for hver miRNA efter normalisering til U6 endogene kontrol i hver prøve, og præsenteres som en /ACt.

Regulering af aggressiv fænotype af melanom celler ved kandidat Smittespredningshæmmende miRNA

Bestemmelse af miRNA, der inhiberer den aggressive fænotype af melanom kunne blive et grundlag for udvikling af nye platforme for cancerterapi. For at evaluere den funktionelle virkning af kandidat Smittespredningshæmmende miRNA på de aggressive træk ved melanom, vi klonet og stabilt overudtrykkes dem i HAG celler for at vurdere deres virkning in vitro og in vivo. En tom vektor tjente som kontrol. En over-ekspression af mindst 50 gange blev bekræftet ved real time PCR (figur 4A). Den fænotype de transducerede celler blev testet

in vitro

for spredning, invasion og dannelse rør aktiviteter. Bemærkelsesværdigt, blev en betydelig og konsekvent inhibering i netto proliferation tillagt ved MIR-31, MIR-34a, MIR-184 og MIR-185 sammenlignet med kontrolgruppen celle (figur 4B). miR-204 ikke hæmme proliferation af HAG celler (figur 4B). I modsætning hertil MIR-204 inhiberede markant invasionen aktivitet HAG celler (figur 4C). Invasion blev ligeledes hæmmet af miR-184, men ikke af den anden Smittespredningshæmmende miRNA (figur 4C).

(A) Verifikation af overekspression af miRNA i HAG transduktanter, sammenlignet med mock-transducerede celler. Y-aksen angiver gange ændring ovenfor Mock-transducerede celler. (B) Net spredning af transduktanter blev kvantificeret med standardiserede XTT test. Antallet af celler blev bestemt 48 timer efter podning. Antallet af Mock-transduktanter blev bestemt som 100%. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af tre udførte. (C) Invasion aktivitet af transduktanter blev kvantificeret med 20 timer-matrigel invasion assay, med korrektion for proliferation. Invasionen på Mock-transducerede celler blev bestemt som 100%. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af 3 udføres. * Betegner P 0,05, ** betegner P 0,01 (2-halet

t-test

)

Tube dannelse aktivitet blev væsentligt hæmmet af miR-34a og miR-185. og mere mildt af mIR-31 og mIR-184, men ikke af mIR-204, sammenlignet med kontrol (figur 5, A-F). Kvantificering af total rørlængde blev udført ved anvendelse ImageJ. Vigtigt er det, den kvalitative vurdering af mikrografiske fanger (figur 5, A-F) tilsluttede sig den kvantitative samlede længde analyse (figur 5G). De differentielle virkninger af miRNA kunne ikke blot tillægges deres differentielle overekspression intensiteter (figur 4A). Næsten alle celler var levedygtige ved analyse, som fremgår af 5% positive trypanblåt-farvning (data ikke vist)

Tube dannelse evne transduktanter blev afprøvet i 3D kultur, 24 timer efter podning.. Hvert forsøg blev udført i tredobbelte brønde. (A) Et repræsentativt mikrofotografi af en 3D kultur af Mock-transducerede HAG celler; (B-F) Repræsentative mikrofotografier af miRNA-transducerede HAG celler, som er angivet i hvert billede. Alle billeder blev taget til fange under × 40 forstørrelse. Alle billeder (A-F) blev afledt fra den samme repræsentative viste forsøg ud af tre udførte. (G) Tube dannelse blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ analysere skelet plugin. Figuren viser de gennemsnitlige længde beregnes for hver transduktant ud af alle mikrofotografier fanget i alle tre eksperimenter udført. * Betegner P 0,05, ** betegner P 0,01 (2-halet

t-test

)

Tilsammen alle fem kandidatlande Smittespredningshæmmende miRNA faktisk udøvet betydelige hæmmende effekt på. forskellige aggressive træk ved melanomceller. Dette stemmer overens med deres betydelige nedregulering i HAG celler (figur 2), og deres samlede lav ekspression i kliniske prøver (figur 3). Det styrker også vores high-throughput miRNA screening og understreger dens pålidelighed.

Facilitering af aggressiv fænotype af melanom celler ved kandidat oncogen miRNA

Siden miRNA 17-92 klynger funktionelle rolle i kræft er veletableret, men aldrig er det blevet testet i kutant melanom, afprøvede vi mIR-17 til dens virkning på aggressiviteten af ​​PAG-celler. MIR-17 blev klonet og stabilt overudtrykkes i PAG-celler. En tom vektor tjente som kontrol. En 25-fold overekspression af MIR-17 blev verificeret ved real time PCR (figur 6A). Vigtigere, MIR-17-transducerede PAG celler udviste en signifikant forøget proliferativ aktivitet (figur 6B), men ikke invasive evne (figur 6C) eller dannelse rør aktivitet (data ikke vist). Disse resultater understøtter de potentielt onkogene virkninger af miR-17 i melanom.

(A) Verifikation af miR-17-5p overekspression i PAG transduktanter, sammenlignet med mock-transducerede celler. Y-aksen angiver gange ændring ovenfor Mock-transducerede celler. (B) Net spredning af PAG transduktanter blev kvantificeret med standardiserede XTT test. Antallet af celler blev bestemt 48 timer efter podning. Antallet af Mock-transduktanter blev bestemt som 100%. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af 3 udføres. (C) Invasion aktivitet PAG transduktanter blev kvantificeret med 20 h-matrigel invasion assay, med korrektion for spredning. Y-aksen angiver den procentdel af invaderede celler. Figuren viser et repræsentativt forsøg ud af tre udførte. ** Betegner P. 0,01 (2-halet

t-test

)

miRNA-medieret regulering af aggressiv melanom funktioner

in vivo

i kræft biologi,

in vitro

resultater ofte ikke nødvendigvis afspejler

in vivo

adfærd. Til dette formål blev virkningerne af udvalgte undertrykkende miRNA yderligere vurderet

in vivo

i melanom xenograftmodeller. Virkningen af ​​den undertrykkende miRNA, MIR-34a og MIR-185 på tumorvækst blev målt efter subkutan injektion af 3 × 10

5 HAG transduktanter. Tumormasser blev overvåget i 28 dage efter injektion. Over-ekspression af specifikke miRNA blev bekræftet forud for injektion (data ikke vist). Vigtigere, blev en statistisk signifikant inhibering i tumorvækst observeres i både MIR-34a og MIR-185 transducatnts, sammenlignet med kontroldyr tumorer (figur 7A). Samstemmende med disse resultater,

ex-vivo

vejning af tumoreksplantater ved ophør af forsøgene bekræftede, at den gennemsnitlige tumor masse af både miR-34a og miR-185 transducatnts var lavere end Mock-transducerede tumorer (figur 7B) .

in vivo

overekspression af de transducerede miRNA blev bekræftet i tumoreksplantater (Figur 7C). Disse resultater bekræfter med udtrykket resultater og funktionelle undertrykkende effekter demonstreret

in vitro

(Figur 4-5).

(A) Overvågning af tumorvækst i SCID-NOD mus. Hver gruppe bestod af syv mus. Et repræsentativt eksperiment ud af fire udførte er vist. Statistisk signifikans blev testet med 2-sidede-parret

t-test

; (B) Gennemsnitlig vægt af tumorer eksplanterede ved ophør af forsøget. Statistisk signifikans blev testet med 2-sidede

t-test

; (C) Over-ekspressionen af ​​transducerede miRNA blev bekræftet ved ophør af forsøget i alle tumorer med qPCR. * Betegner P. 0,05

Diskussion

Indtil dato har de fleste forsøg karakterisere roller miRNA i kræft generelt eller melanom i særdeleshed, har fokuseret på forskellen profilering af normal celler i forhold til deres maligne modydelser celler [19], [20]. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at identificere miRNA, der deltager i processen med malign transformation. Her fokuserede vi på identifikation af miRNA, der direkte regulerer kræft aggressive træk af melanom celler. Formålet med denne fremgangsmåde var at kortlægge de miRNA, der kunne være involveret mekanistisk i forskellige sygdomsfænotyper og i sidste ende afgrænse deres regulerende rolle af aggressive kræft funktioner. Vi anvendte to isogene matchede melanomcellelinjer, som blev afledt af to forskellige metastaser fra den samme patient. Disse cellelinier afviger betydeligt i deres invasive, proliferative og tumorgene egenskaber (figur 1). På grund af den delte genetiske baggrund af cellerne, vores sigte var at den differentielle ekspression af miRNA ville korrelere godt med deres differential aggressiv fænotype.

High-throughput screening afslørede en stor kohorte af differentielt udtrykte miRNA mellem højt (HAG ) og dårligt (PAG) -aggressive melanom-cellelinjer (figur 2). Vi antager, at HAG

lave miRNA er undertrykkende, og at HAG

høje miRNA er onkogene. Faktisk giver vi betydelige beviser understøtter vores hypotese, ved ektopisk udtryk for fem udvalgte HAG

lave miRNA i HAG celler (figur 4, 5, 7) og en HAG

høj miRNA i PAG celler, som repræsentant for denne gruppe (figur 6). Dette er den første rapport med succes demonstrere en systematisk tilgang til en metodisk identifikation af miRNA, der direkte regulerer aggressive kræft funktioner. Den rigdom af identificerede miRNA, der regulerer funktioner i melanom celle aggressivitet understøtter brugen af ​​isogene cellelinjer med differentieret fænotype som en screening platform.

Udtrykket af disse miRNA blev valideret i 15 lav passage primære kulturer, med gennemsnitshøjden af ​​mIR-17, der er højere end den for den undertrykkende Mirs, hvilket således bekræfter den fysiologiske relevans (figur 3). Udtrykket af disse miRNA bør yderligere undersøges i fremtiden progression væv microarrays, og deres prognostiske værdi testet i overensstemmelse hermed.

I det nuværende arbejde vi fokuseret på en gruppe af enten godt karakteriserede miRNA er kendt for at have en rolle i andre maligniteter (MIR-17, MIR-31 og MIR-34a), og på en anden gruppe af relativt unstudied miRNA med hensyn til deres rolle i maligne processer (MIR-184, mir-185, mir-204). Bemærkelsesværdige, roller alle disse miRNA er aldrig blevet beskrevet i kutant melanom.

MIR-31 blev rapporteret at udøve hæmmende på metastaser i brystkræft [33], [34] og i lungehindekræft [17] , mens det har en potentiel onkogen rolle i så hoved og hals pladecellecarcinom og lungecancer [35], [36]. miR-34a blev konsekvent rapporteret som en undertrykkende miRNA i mange maligniteter [37]. Vores resultater er enig med den foreslåede hæmmende rolle for miR-34a og miR-31. Desuden har MIR-34a tidligere blevet rapporteret at målrette c-Met [16]. Da c-Met er blevet rapporteret at deltage i tubulogenesis processer gennem c-Met /HGF-system [38], er det fristende at spekulere, at den mekanisme, hvormed MIR-34a inhiberer dannelse rør er via dette gen. De onkogene egenskaber af miR-17-5p blev drøftet i tidligere publikationer i andre maligniteter [13]. Efter aftale med disse rapporter, ektopisk udtryk for miR-17-5p i PAG celler forøget spredning sats (figur 6B).

I modsætning hertil er meget lidt kendt om miR-184, miR-185 og miR- 204 i kræft. De fleste nuværende undersøgelser af miR-184 og miR-204 fokus på deres rolle i udvikling og morfogenese, som kunne forudsiges beregningsmæssigt (Supplerende tabel S1). De få publikationer vedrørende miR-184 i kræft viste modstridende effekter, enten undertrykkende [39] eller onkogen [40]. En enkelt rapport viste, at miR-204 hæmmede metastase i hoved og hals pladecellekræft [41]. En anden rapport beskrev nedregulering af miR-204 i stærkt invasive melanom sub-line i forhold til sin ikke-invasiv isogene modstykke [19], støtte vores resultater med hensyn til invasionen-hæmmende aktivitet af miR-204 (fig. 4C). MIR-185 er stadig mest unstudied, men det blev for nylig påvist at udøve undertrykkende virkninger i flere maligniteter ved at målrette Six1 onkogen [42], [43]. Den fremtidige udfordring vil være at afgrænse de mål gen netværk af disse miRNA og forstå den molekylære basis for deres tumor-undertrykkende rolle.

Virkningerne af enkelte miRNA kan tilsyneladende ikke være identiske mellem

in vitro

in vivo

opsætninger. For eksempel, mens miRNA-34a og -185 udstillet stærke anti-proliferative effekter

in vitro

(figur 4B), de påvirkede langt mere moderat tumor vækst

in vivo

(figur 7A ). Dette kunne tilskrives en stor forskel i udtryk intensitet mellem

in vitro

in vivo

indstillinger (Figur 4A og 7C). Ikke desto mindre er

in vivo Salg forsøg antyder, at selv når overekspression er relativt svag (figur 7C), en eksperimentel resultat, der tager hensyn til flere biologiske processer, såsom tumorvækst, kan stadig afspejle undertrykkende virkning af overudtrykte miRNA (figur 7). Desuden disse eksperimenter forenkle muligheden for kombinatoriske regulatoriske virkninger af forskellige miRNA, der kan arbejde enten i koncert eller interferens [44]. Således kan en koordineret nedregulering og opregulering af miRNA forme en vis fænotype selv når ændringerne i hvert miRNA ekspressionsniveauet er ikke ekstreme. Faktisk har vi observeret flere direkte og invers statistiske sammenhænge mellem den testede Smittespredningshæmmende miRNA i de kliniske melanom prøver, som kunne tyde synergistiske eller antagonistiske virkninger mellem dem (data ikke vist). Resultatet af samspillet mellem de forskellige undertrykkende miRNA bør undersøges nærmere at uddybe vores forståelse af fænotype formning af kombinatoriske miRNA mønstre, og siden synergistiske hæmmende kombinationer kunne give en solid føring innovativ terapi.

Som konklusion, dette er den første rapport, der med succes demonstreret en systematisk tilgang til identifikation af miRNA, der direkte regulerer aggressive kræft funktioner. Vi beskrev seks miRNA, der bidrager til den aggressive fænotype af kutant melanom både

in vitro

in vivo

, og knyttet disse observationer til kliniske prøver. Identifikation af miRNA, der former den aggressive fænotype af sygdommen kan føre til udvikling af innovative fremtid terapi og molekylære mellemstationer systemer. Nylige publikationer viste muligheden for at målrette eksperimentelle melanom metastaser bruger nanopartikler bærer miR-34a [45] eller et syntetisk miRNA-agonist [46].

Materialer og metoder

Etik Statement

Alt dyr arbejde i mus blev udført efter godkendelse af en Institutional Review Board of Sheba Medical center (562/2010). Alle kliniske prøver stammer fra patienter, hvorfra melanom kulturer blev etablere, blev opnået efter godkendelse af den etiske komité i Israel Sundhedsministeriet (IMoH godkendelse nr 3518/2004). Alle patienter har villigt underskrevet den informerede samtykkeerklæring

Celler

De to isogene menneskelige kutane melanom cellelinier C8161 celler. (Meget aggressiv – HAG) og dårligt aggressive C81-61 (Dårligt aggressiv – PAG) [29] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Mary Hendrix (Børnenes Memorial Research center, Chicago, USA). Disse cellelinier blev afledt af to forskellige metastaser fra den samme patient. Primære melanom kulturer blev udviklet fra kirurgisk fjernede metastatisk melanom læsioner (IMoH godkendelse nr 3518/2004) og blev dyrket som tidligere beskrevet [47]. PAG-celler blev dyrket i Hams F10-medium supplement med 15% FBS, Pen /Strep og 1 × MITO + (BD Biosciences). Normale humane epidermale melanocytter blev holdt i et serumfrit unik medium (Promocell). 293T-celler (ATCC) blev holdt i DMEM (Gibco /Invitrogen) indeholdende 10% FBS (DMEM /FBS).

miRNA ekspressionsanalyse

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion). High-throughput screening af miRNA blev udført ved real time PCR under anvendelse TLDA format TaqMan miRNA kits (Applied Biosystems). Ekspression af specifikke miRNA og U6 RNA (som endogen kontrol) udførtes ifølge revers transkription fra 200 nt RNA-fraktioner ved anvendelse af TaqMan miRNA kits (Applied Biosystems). Cutoff niveauer for signifikans blev bestemt som mindst 4 gange forholdet mellem testede prøver og cyklus 36 som grænse for ekspression sortiment, baseret på vores tidligere vurdering af denne teknologi.