PLoS ONE: Høj lysyloxidase (LOX) i ikke-Malignt Prostata epitel forudsiger et dårligt resultat i prostatakræft Patient Administreret af vågent venter

abstrakt

Lysyloxidase (LOX) har vist sig at både fremme og undertrykke tumorprogression, men dens rolle i prostatacancer er stort set ukendt. LOX immunreaktivitet blev scoret i prostata tumor epitel, tumor stroma og i tumoren-tilstødende ikke-malign prostata epitel og stroma. LOX scorer i tumor og ikke-maligne prostata væv blev derefter undersøgt for mulige foreninger med kliniske karakteristika og overlevelse i en historisk kohorte af mænd, der blev diagnosticeret med prostatakræft ved transuretral resektion og efterfulgt af vagtsomme venter. Mænd med en lav LOX score i den ikke-maligne prostata epitel havde signifikant længere kræft specifik overlevelse end mænd med en høj score. Desuden LOX score i ikke-maligne prostata epitel forblev prognostisk i en multivariabel analyse, herunder Gleason score. LOX score i prostata tumor epitel positivt korreleret til Gleason score og metastaser, men var ikke forbundet med kræft overlevelse. LOX score i tumor og ikke-maligne prostata stroma syntes relateret til disse tumor egenskaber. I radikal prostatektomi prøver, LOX immun-farvning svarede til LOX in situ hybridisering og LOX-mRNA-niveauer blev fundet at være ens mellem tumor og tilstødende ikke-maligne områder, men steg betydeligt i knoglemetastaser prøver. LOX, både udtrykt i tumorer og i det omkringliggende tumorbærende organ tilsyneladende relateret til prostatacancer aggressivitet

Henvisning:. Nilsson M, Hägglöf C, Hammarsten P, Thysell E, Stattin P, Egevad L, et al. (2015) Høj lysyloxidase (LOX) i ikke-Malignt Prostata epitel forudsiger et dårligt resultat i prostatakræft Patient Administreret af vågent venter. PLoS ONE 10 (10): e0140985. doi: 10,1371 /journal.pone.0140985

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: August 6, 2015; Accepteret: 2 oktober 2015; Udgivet: 26 oktober 2015

Copyright: © 2015 Nilsson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet svensk (65X-05935-32-3, https://www.vr.se/inenglish.4.12fff4451215cbd83e4800015152.html) , Den svenske Cancer Foundation (CAN 2013/327, https://www.cancerfonden.se/sv/Information-in-English/), The Lions Cancer Research Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostata tumorer er generelt multifokal og heterogene og deres naturhistorie varierer fra uskadelige for dødelige. Aktuelle billeddannende metoder ikke tilstrækkelig detektere prostatatumorer, i stedet flere nålebiopsier, prøveudtagning mindre end 1% af prostata volumen, er taget fra prostata at identificere ondartet tumor væv. Tumor-holdige biopsier, forhåbentlig repræsenterer den mest ondartede tumor til stede, er histologisk scoret (Gleason score, GS) og sammen med serumniveauer af prostata-specifikt antigen (PSA), der anvendes til prognosticate tumor adfærd. I størstedelen af ​​prostatacancerpatienter disse metoder har begrænset evne til at forudsige sygdom aggressivitet, og bedre prognostiske markører er derfor et presserende behov [1]. Salg

Ikke-maligne prostata væv er altid samples af biopsier, og de seneste undersøgelser af os og andre har foreslået, at tumorbærende organ forskelligt påvirkes /tonet af indolent vs aggressive tumorer [2]. Ændringer i de normale dele af tumorbærende prostata kan udover adaptive ændringer også være resultatet af felt cancerization [3, 4]. Ændringer i de ikke-maligne dele af tumor-bærende prostata (uanset årsagen), er vigtigt at identificere og validere de potentielt kunne tjene som nye markører til at diagnosticere og prognosticate prostatakræft [2-4]. Vi har kaldt det tumor-tilstødende tilpasset ikke-malign prostata væv som Tumor anvist (og således indikerer) Normal Tissue (nuance) [2]. TINT indbefatter morfologisk normalt udseende epitel og stroma af tumorbærende organ og er ikke i direkte kontakt med tumoren epitel og er således adskilt fra tumorstroma /tumormikromiljøet.

Vi har tidligere vist, at ændringer i prostata TINT epitel og stroma er relateret til prognostisk vigtige tumor karakteristika såsom GS og tumor stadie, og kan bruges til at vurdere risikoen for at dø af prostatakræft i et vågent venter kohorte [2, 5-13]. For at udforske farvetone konceptet mere detaljeret har vi anvendt en dyremodel, hvor rotte-prostatacancerceller implanteres i prostata af immunkompetente rotter. Dette resulterer i adaptive tumorfremmende ændringer i tumorbærende prostata lap, f.eks forøgede tætheder af makrofager og mastceller og forøgede hyaluronan [8, 9, 14-16]. Arten og omfanget af disse ændringer er relateret til ikke blot at tumor størrelse, men også til tumorceller aggressivitet (Adamo et al., Ikke publiceret). Genekspression undersøgelser viste, at én faktor markant opreguleret i rotte FARVETONE var Lysyloxidase (LOX) [17].

LOX er en udskilte kobber-afhængig amin-oxidase, med den primære funktion at tværbinde kollagen og elastin (både opreguleret i rotte FARVETONE [17]), i den ekstracellulære matrix (ECM). Øget ekstracellulær LOX-aktivitet resulterer derfor i en stivere mikromiljø, der fremmer tumorprogression, metastase, og invasion [18-20]. LOX har også vist sig at være nødvendig for pre-metastatisk niche formation [21]. For nylig, LOX, secerneres af tumor epitelceller, viste sig også at inducere pre-metastatiske knoglelæsioner, der går forud og støtte dannelsen af ​​brystkræft metastaser [22]. Forøget LOX ekspression er blevet associeret med en dårligere resultat hos patienter med astrocytomer, ikke-lille lungecancer og mavecancer [23-25]. Imidlertid LOX har også vist sig at have anti-tumor aktivitet i flere cancertyper, herunder lunge, pancreas, mavekræft og nasopharyngeal carcinom [26-28],. LOX hæmmer HRAS-induceret tumor dannelse og omvendt HRAS-transformation af fibroblaster [29, 30]. Biproduktet fremstillet ved spaltning af LOX proenzym er også blevet vist at have tumor suppressive egenskaber [31, 32]. Nedsat LOX ekspression er blevet observeret i en række af cancere og har impliceret LOX som et tumorsuppressorgen [33].

rolle LOX i prostatacancer ikke er etableret, og begge inhibitoriske og stimulerende virkninger er rapporteret. High LOX-mRNA-ekspression er forbundet med høj kvalitet prostatatumorer og tumortilbagevenden [34] og er blevet vist at korrelere med GS [35]. Omvendt blev LOX mRNA-ekspression faldt i metastatisk forhold til primære prostata tumorer [36] og lave niveauer af LOX udtryk er også blevet rapporteret i high-grade tumorer [37, 38], hvilket tyder på tab af LOX udtryk under prostata tumor progression.

Formålet med denne undersøgelse var derfor at undersøge LOX proteinekspression i prostata tumor epitelceller, tumor stroma, tumor-tilstødende ikke-malign prostata epitel (nuance epitel) og i tumor-tilstødende ikke-malign tumor stroma (nuance stroma ) og relatere LOX udtryk i forskellige rum til histopatologiske og kliniske parametre samt til udfaldet i en historisk kohorte af prostatakræft forvaltes af vågent venter (se [12] for detaljer). Sammenfattende finder vi, at LOX farvning score i prostata FARVETONE epitel forudsagt prostatakræft specifik overlevelse og gav additiv prognostisk information til GS.

Materialer og metoder

Patienter

LOX farvning score (se nedenfor) blev analyseret i vævsprøver indsamlet fra mænd, der gennemgik transuretral resektion af prostata (TURP) mellem 1975 og 1991, og hvor histologisk analyse viste tilstedeværelse af prostatakræft (for detaljer se [7]). Undersøgelsen omfatter 351 mænd, hvoraf 304 (herunder 265 scorede for LOX) mænd havde ikke modtaget nogen kræftbehandlingen før TURP og blev fulgt med vagtsomme venter. Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 74 år (51 til 95 år) og median samlet opfølgningstid var 5,2 år (0 til 25,5 år). Lokal tumor etape blev fastlagt på tidspunktet for kirurgi ved digital rektal undersøgelse og tilstedeværelsen af ​​metastaser blev evalueret ved radio-nukleotid knoglescanning. Ingen lymfeknude iscenesættelse blev udført og serum PSA var ikke tilgængelig som materialet blev indsamlet før PSA æra. Fra vævsprøverne indsamlet Vi konstruerede væv microarrays (TMA), der indeholdt 5-8 prøver af tumorvæv (hver prøve indeholdende både tumor epitel og tumorstroma) og 4 prøver af ikke-malignt væv (hver prøve indeholdende både TINT epitel og tone stroma ) fra hver patient [7]. GS blev revurderet, når TMA blev konstrueret og materialet er tidligere blevet analyseret for faktorer af potentiel prognostisk betydning, såsom tumorvolumen, phosphoryleret AKT (Pakt) [6], hyaluronan [9], phosphoryleret epidermal vækstfaktor receptor (pEGFR) [7], vaskulær tæthed, tumorcelleproliferation [10] og akkumulering af forskellige typer af inflammatoriske celler [8, 12], og disse data blev nu forbundet med de nuværende LOX resultater. Materialet blev indsamlet efter svenske regler på et tidspunkt, hvor informeret samtykke ikke var påkrævet. Forskningen etiske komité på Umeå Universitetshospital (Regional Etisk Review Board i Umeå), godkendt af undersøgelsen og frafaldes behovet for samtykke. Patientinformation blev anonymiseret og anonymiseres før analyse.

Desuden blev vævssnit fra 10 prostatakræft patienter, som gennemgik radikal prostatektomi i 2012 undersøgt for LOX protein og mRNA-ekspression ved hjælp af immunhistokemi og

in situ

hybridisering (se næste afsnit). Denne undersøgelse blev godkendt af det regionale Etiske Review Board i Umeå, og alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke.

LOX immunhistokemi, og

in situ

hybridisering, og mRNA-ekspression

TMA og radikal prostatektomi prøver blev farvet for LOX bruger den automatiske farvning systemet Ventana Benchmark Ultra (Ventana Medical Systems Inc.). Kort beskrevet blev fire um tykke paraffinsnit forbehandlet med CC1 (Tris /borat /EDTA-buffer (pH 8,0), 64min, 95 ° C) i antigen-genvinding og farvet med primære kanin polyklonalt antistof mod LOX (Novus Biologicals, Littleton CO, USA , NB100-2530, fortyndet 1: 400). Prøver blev visualiseret under anvendelse Ultraview Universal DAB Detection Kit (Ventana, Tuscon AZ, USA). Human placenta blev anvendt som en positiv kontrol for LOX, der viser positiv farvning i decidua og trophoblastceller. Sektioner blev digitaliseret og analyseret ved brug Pannoramic seeren 1.15.2 (3DHistech, Budapest, Ungarn).

in situ

hybridisering for LOX mRNA detektion blev udført manuelt ved hjælp RNAscope 2,0 FFPE Reagent Kit (Advanced celle Diagnostics Inc., Hayward, CA, USA). Kort beskrevet blev fire um tykke FFPE vævssnit afparaffineret og forbehandlet med varme og protease efterfulgt af inkubering med proben målretning Hs-LOX i 2 timer ved 40 ° C. Forforstærker, forstærker, og HRP-mærkede oligonukleotider blev derefter hybridiseret sekventielt efterfulgt af kromogent udfældning udvikling med DAB. Endelig blev prøver kontrastfarvet med Meyers hematoxylin, og analyseret i en lys felt mikroskop. Hver prøve var kvalitet kontrolleres for RNA integritet med en RNAscope probe til cyclophilin B (PPIB) RNA (positiv kontrol) og for ikke-specifik baggrund med en probe for bakteriel dapB RNA (negativ kontrol). Specifik RNA-farvning signal blev identificeret som brun, pointere prikker.

data svarende til LOX-mRNA-niveauer i parrede prøver af primær prostata tumor og tilstødende ikke-malign prostata væv (n = 12), og i kastrationsresistent prostatacancer cancer (CRPC) knoglemetastaser prøver (n = 30) blev ekstraheret fra tidligere publicerede undersøgelser var det humane HT12-v3 Illumina Beadchip genekspression Grupperingen blev anvendt ifølge producentens protokol (Illumina, San Diego, CA, USA) og som tidligere beskrevet [39, 40].

Scoring af LOX immunoreaktivitet og

in situ

hybridisering

tumor epitel, tumor stroma, TINT epitel og TINT stroma blev identificeret ved morfologisk udseende, og LOX farvningsintensitet og spredning blev scoret separat i disse fire forskellige rum som negativ (0), svagt (1), moderat (2), eller stærk (3). I TMA, LOX scoringer er median værdier for fem til otte scorede prøver af tumorvæv eller fire scorede prøver af ikke-maligne væv for hver patient. Den immunoreaktivitet (LOX IR) blev scoret uafhængigt af to forskellige forskere (C. H., 351 patienter og M. N., 50 patienter) uden kendskab til patientdata. LOX farvning blev observeret i cytoplasmaet og ofte også i kerner, men disse to rum blev ikke scoret særskilt.

Desuden LOX IR og LOX-mRNA-ekspression blev bedømt som beskrevet ovenfor på hele sektioner fra 10 radikal prostatektomi prøver, herunder både tumor- og ikke-maligne epitel og stroma.

Hypoxi behandling

in vitro

, RNA Forberedelse og kvantitativ RT-PCR analyse

Prostata epitelceller (RWPE-1 ) og stromale myofibroblaster (WMPY-1, (ATCC, Manassas VA, USA) afledt fra den perifere zone af histologisk normal human prostata blev dyrket i overensstemmelse med producentens protokol (ATCC). cellerne blev dyrket i plader med 6 brønde ved 37 ° C i 24 timer i en hypoxi (1,0% O

2, 5% CO

2, 94% N

2) eller i normoxi (21,0% O

2, 5% CO

2 , 74% N

2). Seks gentagelser blev anvendt ved total RNA blev fremstillet under anvendelse af TRIzol fremgangsmåden ifølge protokol (Invitrogen). totalt RNA blev DNase-behandlet (DNase 1, Ambion) for at fjerne kontaminerende DNA, og 0,8 ug blev anvendt til syntese af cDNA ifølge fabrikantens instruktioner ved anvendelse Superscript II (Invitrogen). Real-time QRT-PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System og Taqman Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Den kvantificering af mRNA-niveauer blev henrettet i en 20-ul reaktion volumen med 20 ng cDNA pr reaktion for LOX (kommercielt tilgængelige primer og probe mix, LOX, Hs00942480_m1, Applied Biosystems). Negative kontroller blev kørt parallelt, og de relative værdier for hvert gen blev normaliseret ved hjælp h18S, (Hs99999901_s1) som reference gen og analyseret i Taqman Analysis Software SDS2.4 (Applied Biosystems).

Statistik

bivariate korrelationer blev beregnet under anvendelse af Spearman rang korrelation test. Korrelationer mellem nominelle variable og kontinuerlige variabler blev analyseret under anvendelse af Kendall tau B korrelation. Der blev indsamlet på tidspunktet for prostatakræft diagnose og omfatter alle patienter i undersøgelsen. Patienterne blev fulgt med vågent venter indgik i Kaplan-Meier overlevelse analyser og Cox regressionsanalyse. Varigheden af ​​begivenhed overlevelse (EFS) er defineret som tiden fra TURP indtil datoen for prostatakræft død, død andre årsager, eller hvis der ikke døden indtraf, indtil datoen for den sidste opfølgning. Forskelle i resultat mellem grupper blev testet med log-rank test. Den prognostiske betydning af LOX IR blev undersøgt af Cox regressionsanalyse alene og sammen med GS. Sandsynlighed for begivenheden overlevelse (P-EFS) præsenteres ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). En intraclass korrelationsanalyse blev brugt til at validere de to forskellige LOX scoringer. Mann-Whitney U-test blev anvendt til sammenligning mellem hypoxisk og kontrol behandlet prostata celler, og til sammenligning mellem CRPC prøver og ikke-maligne prostata /primære prostata tumorer. Den Wilcoxon Signed-rækker test blev anvendt til sammenligning mellem parret ikke-maligne prostata væv og primære prostata tumorer prøver. Tærsklen for signifikans blev sat til 0,05. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 23,0 software (SPSS Inc., Chicago, USA).

Resultater

LOX udtryk i maligne og non-maligne humane prostata væv

Til vurdere betydningen af ​​LOX i prostatakræft, en TMA herunder tumorvæv og tumor-tilstødende ikke-maligne prostata væv (væv kerner blev udtaget ved tilfældige afstande fra tumorvæv) fra 351 prostata cancer patienter med lange opfølgning blev analyseret og scoret af LOX immunhistokemi i fire forskellige rum; ikke-malign prostata epitel (nuance epitel), ikke-malign prostata stroma (nuance stroma), prostata tumor epitel og prostata tumor stroma. I TINT epitel en moderat LOX immun farvning blev generelt observeret i basale epitelceller mens luminal epitelcelle farvning var variabel mellem patienter og scorede fra ingen eller svag farvning til moderat eller stærk (median score var 2, Fig 1A). LOX ekspression i TINT stroma blev detekteret i glatte muskelceller og fibroblaster og farvningsintensitet varierede mellem patienter fra svage til stærke (median score 2,5, Fig 1A). Tumor epitelceller var generelt positive og farvning intensitet i både tumor epitel og tumor stroma varierede mellem tumorer (median score 2 for begge steder, data ikke vist). LOX farvende scores i de forskellige rum blev alle korreleret til hinanden (data ikke vist). De stærkeste korrelationer blev fundet mellem LOX score i TINT epitel og den tilsvarende FARVETONE stroma (

Rs = 0

50

,

s. . 0

001 .)

mellem tumor epitel og tumor stroma (

Rs = 0

44

,

s. 0

001

) . For at måle sammenhængen, to efterforskere scorede LOX immun-reaktivitet selvstændigt og en intra-class korrelationsanalyse gav en Chronbach alpha på 0,81 indikerer et gyldigt scoring.

(A) Repræsentant immunhistokemisk farvning af LOX (brun) i afsnit af ikke-maligne prostata vævsprøver (nuance epitel og TINT stroma) fra to patienter med prostatacancer (originale forstørrelser x 200). Case Et show svag epitelial farvning (score 1) og sag B stærk epitelial farvning (score 3). (B) på hinanden følgende sektioner fra ikke-maligne prostata væv farves med

in situ

hybridisering eller immunhistokemi for LOX. Bemærk, at mRNA (brune prikker) og protein (brun) ekspression i individuelle kirtler var relateret, i stroma i modsætning mRNA var generelt lav, men protein ofte påvist (original forstørrelse x200). (C) LOX-mRNA-ekspression i ikke-malignt prostatavæv (nuance) (n = 12), i primær prostata tumorvæv (n = 12), og i kastrationsresistent knoglemetastaser (CRPC) (n = 30) under anvendelse Illumina genet udtryk array.

for at undersøge placeringen af ​​LOX produktion i prostata vi brugte

in situ

hybridisering. Som TMA materiale var for gammel til denne analyse, vi undersøgt og scoret LOX immun farvning og LOX-mRNA-ekspression indeks i 10 radikal prostatektomi prøver ( 3 år gamle materiale). LOX proteinekspression i de radikale prostatektomi svarede til farvning i i TMA’erne vise variabel farvningsintensitet i både normale og tumor epitel- og stromale celler (Fig 1B). LOX-mRNA blev hovedsageligt udtrykt i de luminale prostata epitelceller og i tumorceller med få positive celler i den ikke-maligne og maligne prostata stroma, der viser, at LOX hovedsagelig blev produceret i prostata epitel- og tumorceller (Fig 1B). Desuden LOX mRNA-ekspression indeks i epitelceller korreleret med LOX farvning score (

R

S

=

0

.

70

,

s. . 0

05

)

Vi har tidligere undersøgt transkriptomet af prostata tumorvæv i radikale prostatektomi, i ikke-maligne prostata væv i de samme patienter (samplet 0,5-3 cm fra den nærmeste tumor foci, median distance 1 cm), og i kastrationsresistent (CRPC) knoglemetastaser af separate patienter [39, 40]. I disse prøver var ens i ikke-maligne og maligne primære tumorvæv (figur 1C) transkriptet niveau af LOX-mRNA. Imidlertid LOX-mRNA-niveauer var signifikant højere i CRPC knoglemetastaser sammenlignet med niveauerne i de primære prostatatumorer (Fig 1C). LOX mRNA niveauer i ikke-maligne prostata væv syntes relateret til afstanden fra tumor (data ikke vist) i overensstemmelse med resultater under påvise, at LOX farvning i TINT epitel i vågent-venter kohorte blev kun marginalt relateret til tumor stadie (og dermed ikke nøje forholde sig til tumorstørrelse og gennemsnitlig afstand til nærmeste tumor).

LOX immunoreaktivitet er forbundet med markører for tumor aggressivitet

Analyser blev udført for at undersøge mulige sammenhænge mellem LOX udtryk i fire forskellige prostata væv rum til kliniske parametre og histologiske karakteristika af tumoren. LOX score i tumor epitel var positivt associeret med GS, tumor stadium, tilstedeværelsen af ​​metastaser på diagnosetidspunktet, tumor mikrokar tæthed og tumor proliferation (tabel 1). LOX score i TINT epitel var korreleret til tumor fase, og tumor- og ikke-malign mikrokar densitet (tabel 1). Men LOX score i tumor stroma og TINT stroma syntes relateret til disse tumor egenskaber (data ikke vist).

Derudover undersøgte vi, om LOX score var forbundet med detekteret i tumor andre faktorer og TINT væv, vedrører patientoverlevelse [6-9]. Tumor epitelial LOX score positivt korreleret til pEGFR IR både tumor og TINT epitel samt hyaluronan i tumor og TINT stroma. Tumor epitelial LOX point er også positivt korreleret til Pakt i TINT epitel (tabel 1). LOX IR i TINT epitel var positivt korreleret til pEGFR og Pakt både tumor og TINT epitel (tabel 1). Dette tyder hidtil ukendte relationer mellem LOX ekspression i tumoren og prostata FARVETONE epitel og disse faktorer. Mastceller og S100A9 positive makrofager viste ingen korrelation til LOX IR (data ikke vist).

LOX immunoreaktivitet i prostata FARVETONE epitel forudsiger kræft specifik overlevelse

Patienter med højt LOX udtryk (≥ medianværdien 2.0) i TINT epitel havde en signifikant reduceret cancer specifik overlevelse sammenlignet med resten (15-års sandsynlighed for hændelse overlevelse (P-EFS) var 58 ± 5% og 81 ± 8% i de to grupper, fig 2). Endvidere blev en høj TINT epitel LOX score forbundet med en øget relativ risiko for prostatakræft-specifik død i en univariate Cox regressionsanalyse (tabel 2). Desuden LOX IR i TINT epitel gav additiv prognostisk information til GS i en multivariat Cox regressionsanalyse (tabel 2). Der var ingen signifikante relationer mellem patient overlevelse og LOX IR i tumor epitel, tumor stroma eller TINT stroma (data ikke vist).

Patienter opdelt i to grupper afhængigt af LOX immunoreaktivitet (IR) i ikke-maligne luminale epitelial prostata væv (FARVETONE epitel).

Hypoxi opregulerer LOX i ikke-maligne prostata celler

in vitro

LOX udtryk har vist sig at være reguleret af hypoxi [18, 41] og implantation af cancerceller induceret hypoxia i de ikke-maligne dele af tumorbærende prostata lap i rotter [17]. Hypoxi kan således være en forklaring på den høje LOX-ekspression ses i ikke-malign prostata epitel af nogle prostatacancerpatienter som hypoxia er almindelig i de epiteliale rum i ikke-maligne og maligne humane prostatavæv [42]. I tråd med dette viser vi, at den menneskelige prostata epitel (RWPE-1) og stromal myofibroblastlignende (WPMY-1) celler inkuberes hypoxi i 24 timer

in vitro

væsentligt havde højere LOX mRNA-niveauer i forhold til normoksiske kontroller (Fig 3). Størrelsen af ​​LOX opregulering var højest i RWPE-1-celler (11-fold vs. 2-fold i WPMY-1). Dette antyder, at hypoxi kunne opregulere LOX ekspression i normal prostata epitel og stroma.

Relativ LOX-mRNA-ekspression i humane prostata-epitelceller (RWPE-1) og human prostata stromale myofibroblaster (WPMY-1) dyrkes

in vitro

i normoxiske eller hypoxiske betingelser for 24 timer. Værdier er middel ± SEM, **

s

0,01.

Diskussion

Tidligere undersøgelser i en rottemodel foreslået, at tilstedeværelsen af ​​en prostatakræft forøget LOX-ekspression ikke kun i tumoren, men også i resten af ​​tumorbærende prostata lobe [17]. Formålet med denne undersøgelse var derfor at undersøge, om dette kunne være den situation også hos patienter. Dette syntes at være tilfældet, og høje niveauer af LOX i tumoren-tilstødende ikke-malign prostata epitel (nuance epitel) var forbundet med kortere cancer specifik overlevelse i patienter med prostatacancer. Desuden LOX score i prostata FARVETONE epitel gav additiv prognostisk information til GS. Vi har i dyremodeller tidligere vist, at forekomme adaptive ændringer i det omgivende tumorbærende orgel og at sådanne ændringer kan anvendes til at prognosticate prostatakræft hos patienter [2, 5-10, 13]. Her viser vi, at LOX score i prostata FARVETONE epitel korrelerer med mange faktorer tidligere undersøgte i TINT epitel (pEGFR, Pakt) og TINT stroma (mikrokar tæthed) og vist at forholde sig til tumor aggressivitet og resultatet [6-8, 10].

Serum PSA niveauer og Gleason scoring af tumor-holdige biopsier har, for skitseret i indledningen grunde begrænset evne til at forudsige tumor adfærd i de fleste nydiagnosticerede [1]. Derfor kunne yderligere diagnostiske og prognostiske markører, fx i det omgivende normale prostatavæv derfor være potentielt nyttige, især som ikke-malign prostata altid samples i prostata biopsier [2, 4]. Vores undersøgelse tyder på, at LOX ekspression i epitelet af den ikke-maligne del af tumorbærende organ kunne hvis valideret i yderligere undersøgelser fungere som en uafhængig prognostisk markør for prostatacancer. Men sammenlignet med pEGFR [7] og Pakt [6] LOX farvning i TINT tilsyneladende mindre informative.

Desuden og i overensstemmelse med nogle tidligere rapporter [34, 35] viser vi, at LOX-IR i prostata tumor epitel var korreleret til adskillige kliniske egenskaber i relation til tumor aggressivitet såsom GS, tumor stadium mikrokardensitet densitet, tumorproliferation og metastaser. Nye relationer mellem LOX udtryk i tumor epitel og pEGFR, Pakt og hyaluronan blev også fundet. Hyaluronan blev for nylig foreslået at arbejde som en inducer af LOX udtryk i brystkræftceller, hvilket kan forklare den positive korrelation til LOX IR i tumor epitelceller [43].

Ren et al. viste, at LOX-mRNA-ekspression overvejende blev udtrykt i normale humane og muse prostata epitelceller, med lavere niveauer udtrykt i prostata stroma [36]. Dette og konstateringen i vores

in situ

hybridisering indikerer, at LOX hovedsageligt er produceret af prostata epitel. Andre genekspressionsstudier har vist, at LOX udtrykkes i både normal prostata epitel og stroma [37]. I overensstemmelse med disse undersøgelser viser vi, at LOX-protein blev fundet i både human prostata ikke-malign epitel og stroma men at niveauerne af LOX varierede mellem patienter. En årsag til den høje LOX niveauer i prostata FARVETONE kunne være, at tumoren ved mekanismer ukendte, inducerer LOX-ekspression i ikke-maligne prostata celler. Dette understøttes af vores fund, at ortotopisk rotte prostata tumorceller implanteret til prostata af rotter resulterede i forøget ekspression af LOX-mRNA i TINT sammenlignet med tumor-fri kontrol væv [17].

Vi har for nylig vist, at rotte prostata FARVETONE tissue gen-ekspressionsmønsteret er karakteriseret ved processer som inflammation, transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) signalering og hypoxi [17]. Implantation af cancerceller i rotteprostata også induceret hypoxia, som vist ved pimonidazole farvning, i de ikke-maligne dele af tumorbærende prostata lobe [17]. Vi viser her, at hypoxi markant opreguleret LOX-mRNA-ekspression i humane prostata epitelceller og prostata myofibroblaster

in vitro

, og human prostata væv (både tumor og omgivende normale) er generelt hypoxisk [42]. Hypoxi kunne således forklare de øgede LOX niveauer i nuance og at øgede niveauer af LOX er en konsekvens af tumordannelse. En nylig undersøgelse fra Cox et al. implicerer, at hypoxiske brystkræft udskiller LOX som efterfølgende inducerer pre-metastatiske knoglelæsioner [22]. Her blev LOX score i tumor epitelceller fundet at være associeret med knoglemetastaser og LOX score i TINT epitel til overlevelse, hvilket antyder, at LOX secerneres fra tumoren og vigtigere også fra de ikke-maligne dele af tumorbærende prostata kunne deltage i præ-metastatisk niche dannelse også i prostatacancer. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge denne mulighed og den relative betydning af tumor vs. TINT udskilles LOX. Hypotesen om, at de ikke-maligne dele af tumorbærende prostata kunne bidrage betydeligt understøttes af vores observation, at LOX-mRNA-niveauer er ens i humane prostatatumorer og i tilstødende ikke-malign prostata væv [39, 40].

TGF-β er blevet vist af andre for at opregulere LOX i prostata og brysttumorceller [36, 44] og aggressive prostatacancerceller udtrykker mere TGF-β end indolent tumorer og høj TGF-β-ekspression i tumorceller epitelceller er forbundet med en dårlig resultat i vores kohorte af prostatacancerpatienter [45]. TGF-β stimulering af normal prostata epitel kan således resultere i øget LOX udtryk og kan forklare nogle af de øgede LOX i nuance. Desuden positiv korrelation af LOX med pEGFR og Pakt antyder, at øget LOX udtryk er koblet til prostata epitelcelle aktivering. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge, hvordan prostatatumorer kan stimulere ikke-maligne prostata celler til at øge deres LOX ekspression.

Denne undersøgelse tyder på, at høj LOX-syntese i tumor epitel- og i de epiteliale celler i tumor-bærende organ kan stimulere prostata tumor vækst og spredning. Dette resultat er i overensstemmelse med en række andre undersøgelser, der er anført i indledningen. Nogle undersøgelser dog foreslå, at LOX også kunne være hæmmende og et gradvist tab af LOX ses i prostatakræft metastaser [36], men ikke i den nuværende. I en eksperimentel undersøgelse anvendte vi et LOX-inhibitor (BAPN) hos rotter med implanterede prostatatumorer og fandt, at LOX sandsynligvis stimuleret tidlig tumorvækst og omvendt være inhiberende i allerede etablerede tumorer (Nilsson et al., Ikke publiceret).