Abstrakt
Repræsenterer en vedvarende kilde til celle udskiftning, neurale stamceller har fået betydelig opmærksomhed i de senere år. Neurosfæren assay repræsenterer en metode til at påvise tilstedeværelsen af neurale stamceller, men på grund af en mangel på specifikke og endelige markører til at identificere dem, deres kvantificering og satsen de udvider stadig ubestemt. Her foreslår vi en matematisk fortolkning af neurosfæren assay tillader faktisk måling af neural stamcelle symmetrisk division frekvens. Algoritmen af modelleringen viser en direkte sammenhæng mellem den overordnede celle fold ekspansion over tid målt på området assay og satsen stamceller ekspandere via symmetrisk division. Modellen giver en metode specifikt at evaluere effekten af sygdomme og behandlinger på neural stamcelle aktivitet og funktion. Ikke kun at give ny indsigt i evalueringen af de kinetiske træk ved neurale stamceller, vores modellering omfatter yderligere cancerbiologi som cancer stamceller-lignende celler er blevet foreslået at opretholde tumorvækst som somatiske stamceller opretholde vævshomeostase. Faktisk tumor stamceller modstand mod behandling gør disse celler et nødvendigt mål for effektiv behandling. Den neurosfære assay matematisk model præsenteres her muligt at vurdere hastigheden maligne stamceller-lignende celler ekspandere via symmetrisk division og vurderingen af virkningerne af lægemidler på selv-fornyelse og proliferative aktivitet af denne klinisk relevant befolkning, drive tumorvækst og tilbagefald.
Henvisning: Deleyrolle LP, Ericksson G, Morrison BJ, Lopez JA, Burrage K, Burrage P, et al. (2011) Bestemmelse af somatisk og Cancer Stem Cell selvfornyende Symmetric Division Rate Brug Sphere Analyser. PLoS ONE 6 (1): e15844. doi: 10,1371 /journal.pone.0015844
Redaktør: Mike O. Karl, CRT Dresden, Tyskland
Modtaget: 4. august, 2010; Accepteret: November 25, 2010; Udgivet: 5 januar 2011
Copyright: © 2011 Deleyrolle et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH), og National Health og Medical Research Council (NHMRC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Traditionelt blev stamceller menes at være placeret kun i væv, hvor differentierede celler var mest modtagelige for tab og behovet for udskiftning stor, såsom huden [1], intestinale epitel [2] og blodet [ ,,,0],3]. Da voksne centralnervesystemet (CNS) blev anset for at mangle en betydelig mængde af neuronal død, og har ingen regenerationsevne, syntes både usandsynligt, og unødvendig eksistensen af neurale stamceller (NSC). Men i 1992 eksistensen af NSC i voksne pattedyrs CNS med evnen til at give anledning til nye neuroner blev demonstreret [4]. Ligesom stamceller findes i andre væv, NSC (som linje hele ventrikulære neuroaxis af den voksne pattedyrs CNS [4], [5]) udviser den definerende
in vitro
stamceller egenskaber [2], [6] for spredning, omfattende selvfornyelse, generering af et stort antal afkom, og multi-slægt differentiering potentiale samt
in vivo
karakteristisk regenerere væv efter skade [4], [7], [8 ]. Voksne stamceller udgør en relativt inaktiv reservoir af uforpligtede celler. Disse celler har evnen til at dele sig igennem hele livet af organismen til at give anledning til mere engagerede progenitorceller genererer et stort antal udifferentierede celler. Disse progenitorer i sidste ende differentiere til slægt-begrænsede funktionelle celler. På grund af deres evne til at give anledning til nye celler, de faktorer der regulerer fordelingen af stamceller og progenitorceller, og differentieringen af deres afkom, er af stor interesse i at behandle CNS-sygdomme som følge af tab eller upassende cellernes funktion. Derfor er udviklingen af værktøjer, der giver stamcelle-specifik undersøgelse repræsenterer en enorm udfordring. Stamceller er vanskelige at visuelt definere, da der ikke findes nogen godt accepteret positiv markør. Som et resultat af disse celler er defineret på basis af en funktionel definition. Mens ansætte en funktionel udlæsning har gjort det muligt at identificere tilstedeværelsen (eller fraværet) af stamceller i en population, det desværre forbyder direkte isolation eller diskrimination af stamceller fra ikke-stamceller hvilket forhindrer nogen meningsfuld kvantitative data vedrørende deres frekvens og /eller ekspansion sats.
en voksende mængde af beviser understøtter hypotesen om, at en population af tumor-initierende celler (tics), der udviser biologiske egenskaber svarende til normale somatiske stamceller, fastholder maligne tumorer. Tics er postuleret at opholde sig i akut myeloid leukæmi [9], samt i bryst [10], [11], prostata [12], lunge- og mesenkymale tumorer [13]. Vigtigere, har neurale TIC også blevet isoleret og fundet at udvise meget lignende funktionelle egenskaber til neurale stamceller [14], [15], [16], [17]. Den såkaldte cancer stamceller model antyder, at det er disse stamceller karakteristika, der gør tics resistente over for behandling og drive tumor tilbagefald. Som et resultat af disse celler repræsenterer et væsentligt mål for effektiv anticancerterapi. Derfor udvikling af metoder, der undersøger deres biologi og kinetiske adfærd er relevante for udformningen af innovative behandlinger rettet mod dette specifikke cellepopulation.
I CNS en af metoderne til at isolere og ekspandere somatiske og cancer stamceller er neurosfæren assay (NSA) [4], [14], [15], [18]. Af interesse og attesterer, at dets robusthed, er frit svævende sfære kultur systemet også bruges til at undersøge bl.a., brystkræft stamceller [11], [19]. mens NSA er en egnet metode til at identificere stamceller aktivitet, vi hævder dog, at opregningen af kugler er ikke hensigtsmæssigt at måle stamcelle frekvens eller ekspansion sats da dette resulterer i en overvurdering [20], [21].
den aktuelle undersøgelse viser udvikling, validering og anvendelse af en metode, der gør det muligt specifikt kvantificering af somatiske og kræft stamceller symmetrisk division sats ved hjælp af gratis svævende sfære assay.
Resultater
tankeeksperiment
i modsætning til dyrkning og passage af de fleste linjer, hvor hovedparten af cellerne overlever opdeling og går på at formere indtil kulturen bliver sammenflydende, under passage i NSA, flertallet ( 90%) af de celler dør eller ikke længere formere sig. Dette understøttes af det faktum, at størstedelen af de delende celler under én passage giver anledning til mindst 256 afkom ved at undergå mindst otte celledelinger (data ikke vist). Dette ville resultere i et 256-fold ekspansion ved hver passage, hvis hver eneste belagte celle var vækstfaktor-responsiv og delt 8 gange. Men vores eksperimenter beskrevet nedenfor viser en cellulær fold ekspansion mellem 1 og 20 med de forskellige celletyper, vi brugte. Disse data sammen med offentliggjorte klonalitet oplysninger [20], [21], [22] viser, at mindre end 10% af cellerne forgyldt med NSA bidrage til den samlede befolkning ekspansion. Derfor kun den overlevende brøkdel af vækstfaktor-responderende kugle-dannende celler deler, danner kugler, og forny grundlæggelsen befolkning. Celledød uanset, under hver passage, der er en geometrisk stigning i antallet af celler, der genereres. Typisk hvis 100.000 celler udplades, større end 90.000 af cellerne dør inden for de første 24-48 timer, hvorefter 10.000 celler til at proliferere, danner kugler og i sidste ende genererer ca. 500.000 celler. Dette 5-fold ekspansion tendens til at være ret konsekvent, når de passerer celler over tid og aldrig viser en tidsafhængig optrapning fold ekspansion (dvs. 5-fold, 7-fold, 8-fold etc.) [23]. Desuden hver enkelt neurosfære linie i det væsentlige unik med hensyn til fold-forøgelse af antallet af celler genereret fra passage til passage (nogle linjer kan vise en 5-fold ekspansion mens andre en 6 eller 4-fold ekspansion), men konsistente inden den særlige linje.
evnen til på ubestemt tid serielt passerede NSC’er [23] og det faktum, at de fleste af cellerne dør eller stoppe prolifererende ved hver passage, angiver, at befolkningen skal vedligeholdes af en langsigtet prolifererende celle (s) (per definition en celle med stamcelle faciliteter). Vi indhold at frekvensen af langtids prolifererende (LTP) celler (aka NSC’er) vil blive afspejlet i den hastighed, hvormed befolkningen ekspanderer (dvs. fold stigning fra passage til passage), og dette afspejles i hældningen af vækstkurven. For at forstå, hvordan selvfornyende symmetriske afdelinger af LTP celler påvirker vækstkurven, overveje følgende tankeeksperiment (figur 1)
(a):. Numerisk simulering af stilken /vækst stamceller. Da antallet af stamceller (dvs. LTP celler), der genereres i en afledt ved kloning kugle øges, bliver den samlede fold ekspansion og hældningen af vækstkurven steget så godt. (B): Hvis antallet af stamceller (LTP) celler inden en kugle holdes konstant og det totale antal af celler i en kugle fordobles (ii) eller firedoblet (iii), hverken folden ekspansion eller hældningen af vækstkurven ændres dog kurven er forhøjet. LTP, langtids prolifererende celler; STP, kortsigtet prolifererende celler; ND, ikke-delende celler.
(figur 1a) I tilfælde af en LTP-celle, der genererer en kugle med 1000 celler uden at undergå nogen symmetriske celledelinger, den resulterende sfære vil kun indeholde en enkelt LTP celle. Ved en efterfølgende passage, vil alle cellerne igen dø eller ikke deltage i kultur ekspansion bortset fra enkelt LTP celle, der overlever, deler, og danner en ny sfære. Da vi fortsætter til passage dette område (eller population af celler) på denne måde ville vi observere en 1-fold ekspansion, som er repræsenteret ved en flad vækstkurve som det ses i figur 1a (i).
Overvej nu at en enkelt LTP celle gennemgår en selvfornyende symmetrisk celledeling da det skaber en kugle med 1000 celler. I dette tilfælde ville kuglen have 2 LTP celler. Ved en efterfølgende passage, ville 998 af cellerne dør og hver af de to LTP celler ville give anledning til en kugle med 1000 celler. Denne fordobling af det samlede antal kugler (og dermed celler) ville fortsætte, hvilket giver en vækstkurve, der ligner figur 1a (ii).
Endelig, hvis vi mener, at LTP cellen undergår 3 symmetriske divisioner giver anledning til 4 LTP-celler og 996 ikke-LTP-celler, ville dette frembringe en 4-fold ekspansion ved hver passage og en vækstkurve at blive udtrykt som i figur 1a (iii).
(figur 1b ) Hvis vi nu holde antallet af LTP-celler i en kugle konstant (sige, 4) og med hver iteration ændre totale celler genereret pr kugle fra 1000 (i) til 2000 (ii) til 4000 (iii), finder vi, at den elevation af vækstkurven påvirkes men ikke dens hældning (som set af en uændret fold ekspansion). Dette indikerer, at det samlede antal celler frembragt gør indflydelse grafen men ikke hældningen af vækstkurven.
Derfor cellen fold ekspansion, repræsenteret ved hældningen af vækstkurven, afspejler den hastighed, hvormed LTP celler ekspandere. Da LTP celle ekspansion sats er en direkte indikation af antallet af selvfornyende symmetriske celledelinger, følger det, at folden ekspansion eller hældning kan bruges til at forudsige LTP (eller stammer) celle selvfornyende symmetrisk division.
matematisk modellering
Forudsætninger.
Her foreslår vi en matematisk model, der tillader en at kvantificere selvfornyende symmetrisk stamceller division i vævskultur.
vi bryde klasse af alle mulige celler i to typer (i) delende celler og (ii) ikke-delende (ND) celler. Eksempler på ND er celler, der har fuldt differentierede eller celler, der er døde. Vi bryder yderligere klassen af delende celler i to undertyper, langtids prolifererende (LTP) celler og kortfristede prolifererende (STP) celler. Levetiden for LTP-celler er defineret til at være uendelig, og i forbindelse med en eksperimentel indstilling, betyder, at levetiden er længere end for eksperimentet. Produkterne fra en LTP celledeling antages at være enten to LTP-celler (symmetrisk selvfornyende division) eller en LTP celle og en STP celle (asymmetrisk celledeling). Vi antager LTP celle differentierende symmetrisk division sats (LTP → STP + STP) at være nul i de oprindelige vækstbetingelser analysen. Vi antager endvidere, at under eksperimentet tid overlevelse og selvfornyende egenskaber af LTP-celler er bestemt og stabil (defineret af en stabil tilstand som beskrevet nedenfor).
Levetiden for STP celler defineres som endelig, som i forbindelse med en eksperimentel indstilling, betyder, at levetiden er betydeligt kortere end for eksperimentet. Produkterne af en STP celledeling antages at være enhver binær kombination af STP-celler og ND-celler. Det skal understreges, at dette udelukker specifikt STP celledeling fra at producere en LTP celle. Vi endvidere antage, at enhver delende celle, når de placeres i den korrekte miljø, vil fortsætte gennem sin cellecyklus og til sidst dividere, på en måde, der er uafhængig af tilstedeværelsen af andre celler. Produkterne af celledeling vil klæbe og cellecyklussen fortsætter for alle delende celler. Efter tid, en klynge af celler, i det følgende benævnt en kugle, vil have udviklet. Vigtigere er, disse forudsætninger indebærer, at en kugle, der hidrører fra en STP celle vil indeholde STP-celler og ND-celler, mens en kugle, der stammer fra en LTP celle vil indeholde LTP-celler, STP-celler og ND-celler.
passage neurosfærer nødvendigvis indebærer dissociationen af sfærerne i de individuelle bestanddele (dvs. celler). En fraktion af disse bestanddele celler bliver derefter udtaget prøver podet i en ny kolbe indeholdende et miljø permissiv for celledeling (figur 1). Her antager vi, at LTP celler er stamceller-lignende celler, mens STP celler er mere begrænsede progenitorceller. Derfor er den langsigtede udbygning af befolkningen afhænger direkte af udvidelsen af LTP og ikke STP celler. Vi har tidligere vist, at 95% af kuglerne i NSA ikke kan væltes mere end 4 eller 6 gange tyder størstedelen af kuglerne er afledt fra STP-celler, og at LTP-celler udviser en højere proliferativt potentiale [20], [21]. Derfor præcist at definere en population af celler som indeholder stamceller-lignende (dvs. LTP) celler den samlede tidsforløbet af forsøget skal spænde over 4 til 6 passager.
Direkte modellering af neurosfæren Assay.
Efter et par indledende passager (svarende til en “restitutionsperiode”, hvis begyndende med frisk dissekeret primært væv), det dissocierende, plating, og dyrkning af kugler i bulk kultur vil blive konsekvent som processen når en stabil tilstand der afspejler en kompleks ligevægt mellem celleoverlevelse, død, proliferation og differentiering. Det vil sige, en indledende antal celler podes (f.eks 2,5 × 10
5), som genererer kugler og producere i alt celletal for kolben (f.eks 1 × 10
6), hvoraf en del høstes (f.eks 25% tages) og anvendt til at pode en anden kolbe til passage. De målelige mængder er celletallet ved begyndelsen af passagen,
T
i
, og celletallet ved enden af passagen,
T
f
. Den fold ekspansion,
F
, beregnes ved
Efter den periode tilpasning af cellerne til dyrkningsbetingelser, når eksperimentet har indgået den stabile tilstand, F er konstant inden for grænserne af eksperimentelle fejl. Hvis staten er stabil så må det også være rigtigt, at de første antal LTP, STP og ND celler er de samme for hver passage. Tilsvarende skal de endelige tal være den samme for hver passage. Desuden disse celletyper skal undergå den samme samlede fold ekspansion, dvs.
Da LTP celler kun kan oprettes fra LTP celler, og hver LTP celle danner en kugle, så må det også være sandt, at der i gennemsnit der er
F
LTP celler i hver LTP afledt sfære. Det vil sige, at antallet af LTP celler skabt i en LTP stammer sfære (defineret til at være
l
) skal gives af,
l = F
.
Den samme analyse kan ikke anvendes på STP celler, fordi både LTP og STP celler producerer STP celler. Tilsvarende kan den samme analyse ikke anvendes på ND-celler. Som sådan dataanalyse bliver et spørgsmål om at måle celletal ved starten og slutningen af hver passage, dividere to for at tilvejebringe en fold ekspansion, derefter midle fold udvidelser af passager i stabil tilstand. Per definition dette gennemsnit svarer til antallet af LTP (dvs. NSC’er) celler i en LTP-afledt sfære. Derfor bør denne metode præcist afspejler hyppigheden af stamceller-lignende celler i stamceller-lignende celle afledt sfærer.
LTP selvfornyende symmetrisk division sats.
Den mindste tidsenhed i ovenstående model er en enkelt passage. Vi har nu udlede en model til transport inden for passage LTP celletal. Som tidligere bemærket, LTP celledeling har to mulige udfald (i) en
selvfornyende
symmetrisk division (LTP → LTP + LTP) eller (ii) en asymmetrisk division (LTP → LTP + STP). Vi betegner sandsynligheden for det første resultat af
p
ll
og den anden resultat af
p
ls
. Da der ikke er andre mulige udfald, skal summen af disse to sandsynligheder være enhed. Lad cellecyklus tid af LTP celler være betegnet ved
c
l
. Sandsynligheden for en symmetrisk celledeling per tidsenhed er således
p
ll-service /
c
l
. Dette kan også tolkes som hastigheden af LTP celle symmetrisk deling, og vi vil betegne det ved
K
ll
. Da kun LTP celler producerer LTP celler, vækstraten af LTP celle tal er proportional med den aktuelle samlede antal LTP celler. Det skal også bemærkes, at en asymmetrisk opdeling ikke ændrer det samlede LTP celleantal. Væksten af LTP celletal kan således udtrykkes som
Dette udtryk kan løses for at udtrykke de absolutte antal af LTP celler ad gangen
t
,
Det er nu muligt at sidestille denne model med ovennævnte direkte model. For en passage starter ved t = 0 og slutter ved t =
t
f
,
Omorganisering dette udtryk giver en metode til beregning af satsen for LTP celle symmetrisk deling
det vil sige, antallet af LTP celle selvfornyende symmetrisk opdeling kan beregnes ved at tage den naturlige logaritme af folden ekspansion og dividere med passagen tid. Derfor ændringer i folden udvidelse (hældning af kurven vækst) afspejler ændringer i LTP (dvs. stamceller) cellefrekvens af variationer i deres selvfornyende symmetrisk celledeling sats.
Validering af modellen ved hjælp af Neural Colony Forming celleassay (N-CFCA)
Svarende til NSC’er (LTP-celler), progenitor (STP) celler har evnen til at formere sig, og generere afkom, som kan differentieres i funktionelle celler. Men i modsætning til stamceller, progenitorceller har en mere begrænset udbredelse potentielle overtid. Den nyligt udviklede neurale kolonidannende celleassay (N-CFCA) udnytter disse forskelle i proliferativ evne, at aktivere en til at skelne NSC’er fra progenitorer baseret på størrelsen af kolonier, de producerer, når de overføres til kultur [21]. I overensstemmelse med den antagelse, at progenitorceller udviser begrænset proliferativ kapacitet sammenlignet med stamceller, og at størrelsen (diameter) af kolonien kan anvendes til at skelne sin grundlægger celletype, demonstrerede vi, at store kolonier ( 2 mm) har en større proliferativ potentiale og har alle de vigtigste vævskultur stamceller egenskaber (omfattende selvfornyelse, generation stort antal afkom og multi-slægt differentiering potentiale) i forhold til mindre kolonier (som ikke udviser disse kriterier stamceller). Derfor N-CFCA en metode til at optælle neurale stamceller frekvens [21].
For at understøtte den matematiske modellering af NSA med biologiske eksperimenter, vi har sammenlignet dyrkning og udvidelse af embryonale og voksne murine NSC i betingelser, der resulterer i forskellige vækstrater (dvs. forskellige fold ekspansion indebærer forskellige stamcelle selvfornyende symmetrisk division rate). Mens NSA modellen ikke tillade os at præcist at kvantificere antallet af stamceller (udelukkende skyldes, at vi ikke ved, hvor mange stamceller vi startede med), det tillader en sammenligning mellem grupper af befolkninger i stamceller ekspansion sats, som afspejler frekvensen af symmetrisk stamceller celledeling. I dette særlige tilfælde sammenlignet vi cellen fold ekspansion af følgende betingelser (tabel 1): (koncernen1) Føtal E14 NSC kulturer vs. Aged voksne (20 måneder) NSC kulturer, (gruppe 2) Føtal E14 NSC kulturer med mitogenet EGF vs . anvendelsen af EGF + bFGF, (Gruppe 3) Voksen NSC kulturer med mitogenet EGF vs. anvendelsen af EGF + bFGF. Fra disse foranstaltninger effektivt stamcelle symmetrisk division sats (K
ll
) blev afledt (tabel 1). Fosterstamceller dyrket med begge vækstfaktorer udviste en 7,16-gange forøget ekspansion sats sammenlignet med 24-måneder gamle stamceller dyrket med EGF alene (gruppe 1) og en 1,33-fold forskel i forhold til de føtale kulturer eksponeret for EGF alene (gruppe 2 ). Gruppe 3 vises en 1,57-fold forskel mellem de to tilstande. Disse forskelle inden for grupperne i prisen stamceller ekspanderede var korreleret til de absolutte antal af stamceller målt ved anvendelse af N-CFCA (fig. 2), og sammenligningen er vist i tabel 2. For at teste den forudsætning, at begge metoder var de samme sammenlignede vi differencen af deres produktion til nul under anvendelse af t-test. Den p-værdi på den statistiske test var 0,28 hvilket viser, at begge assays forudsige en lignende ændring i forholdet mellem neural stamcelle nummer eller fold ekspansion (aka selvfornyende symmetrisk division rate), validere denne matematiske fortolkning af NSA.
Celler fra hver gruppe blev dyrket i N-CFCA. Graferne sammenligne i hver gruppe, antallet af store kolonier, større end 2 mm i diameter (den eneste størrelsesorden udstiller alle de centrale vævskultur stamceller funktioner) opnået efter 21 dage
in vitro
. * P = 0,039, ** p = 5,38 × 10
-11, n = 15, t-test, 2 haler. Vejviser
Anvendelse af modellen
Vi brugte derefter modellen som en metode til at studere somatiske stamceller selvfornyende symmetrisk division mekanisme. Brug af N-CFCA, vi tidligere vist, at væksthormon receptor knock out (GHR – /-) mus udviste signifikant færre periventricular region afledt stamceller sammenlignet med vildtype dyr (23 ± 3 vs 40 ± 3) [24]. Tilsvarende dyrket i NSA, sammenlignet med vildtype neurale stamceller, GHR – /- NSC’er udvidet ved en betydelig lavere hastighed (. 2,04 ± 0,2 vs 3,63 ± 0,4, figur 3a) [25] korreleret til en nedsat selvfornyende symmetrisk division rate (fig. 3b). Igen, begge analyser forudsagde de samme forhold mellem de to populationer (1,74 og 1,78 for N-CFCA og NSA henholdsvis) [24]. Disse resultater tyder på, at væksthormon signalering styrer selv-fornyelse af somatiske neurale stamceller ved at regulere deres symmetriske division sats. Pluchino og kolleger beskrev den inhiberende virkning af kronisk inflammation på stamceller selvfornyelse [26]. Denne undersøgelse rapporterede, at eksponering af voksne subventrikulære zone afledte stamceller til at inducere-betændelse Th1 cytokiner forårsagede et signifikant fald i antallet af NSC’er målt med N-fiskerikontrolorganet og at dette fænomen var ledsaget med en formindskelse af hældningen af vækstkurven [ ,,,0],26]. Disse data yderligere at validere vores matematiske fortolkning af neurosfæren assay og støtte den model, hvor Th1 cytokiner nedregulere somatiske voksne stamceller ekspansion sats via symmetrisk celledeling relateret mekanisme.
(a-b) sammenlignet med vildtype dyr , GHR – /- neurale stamceller udviste lavere udvidelseshastighed (a, ** p = 0,005, n = 7, t-test, 2 haler), der var korreleret til en nedsat symmetrisk celledeling frekvens (b, ** p = 0,003, n = 7, t-test, 2 haler). (C-d) Sammenligning af væksten i neurosfære analysen af tre humane GBM prøver viste distinkte fold udvidelser (c) og skråninger af vækstkurve (d). t-test (2 haler) blev anvendt til at sammenligne folden ekspansion mellem linjerne A og B (*** p = 1,4 × 10
-6, n = 8-9), linjerne A og C (** p = 1,4 × 10
-5, n = 8-6) og linjer B og C (* p = 0,001, n = 9-6). (E) LTP kræftcelle symmetrisk division frekvens (K
ll
) blev afledt fra folden ekspansion observeret ved hver passage. t-test (2 haler) blev anvendt til at sammenligne K
ll
mellem linjerne A og B (*** p = 8,34 × 10
-12, n = 8-9), linjerne A og C (** p = 1,66 × 10
-8, n = 8-6) og linjer B og C (* p = 0,002, n = 9-6). (F) Overlevelse analyse efter implantation i striatum af NOD /SCID mus af 200.000 celler fra tre forskellige tumorcellelinjer påvist et omvendt forhold mellem hastigheden af symmetrisk opdeling af den langsigtede proliferativ cancercelle og sygdomsprogression. Logrank test, p = 0,0038 sammenligning A til B, s 0,0001 sammenligning A til C og B til C. (g) Grafen repræsenterer den gennemsnitlige overlevelsestid efter hGBM intrakraniel transplantation som en funktion af den sats LTP cancerceller undergået symmetrisk division (K
ll
). De stiplede linier svarer til 95% tillid bånd af fit kurve opnået ved ikke-lineær regression (y = 2,323 – 0.2091x + 0.005125x
2). Koefficient R
2 og p-værdi vises også.
Den matematiske model kunne også anvendes til kræft biologi. Flere typer af kræft, herunder brystet og CNS, indeholder celler udviser stamceller-lignende celle funktioner såsom langsigtet repopulation ejendom [10], [14], [16], [27]. Kræften stamceller hypotese, at tumorer hierarkisk organiseres og vedligeholdes af en særskilt subpopulation af langsigtede repopulation cancer stamceller-lignende celler giver terapeutiske resistens egenskaber. Derfor forstå dynamikken i disse celler er af stor interesse for at forstå cancer biologi og at udforme innovative og særlige behandlinger. Vi anvendte vores model til at sammenligne cancerstamceller-lignende celle (aka LTP cancerceller) selvfornyende symmetrisk division frekvens og tumorprogression mellem flere voksne humane glioblastoma multiforme (hGBM) cellelinier dyrket i neurosfæren assaybetingelser [16]. De tre forskellige hGBM analyserede prøver (A, B og C) og genereres i vores laboratorium udstillet forskellige ekspansion profiler (afspejlet i forskellige skråninger af kurven) og LTP kræft celle symmetriske division satser (Fig. 3c-e). Ortotopisk transplantation af 200.000 celler fra hGBM prøverne A, B og C i striatum af immunsvækkede mus førte til tumordannelse efterfulgt af dyrenes død (Fig. 3f). Vigtigt er det, blev sygdomsprogression direkte og omvendt korreleret med selvfornyende symmetrisk opdeling på de LTP kræftceller. Dette blev udtrykt ved at sammenligne den gennemsnitlige overlevelsestid af værtsdyr implanteret med en af de tre hGBM tumor stamcellelinjer til LTP cancercellen symmetrisk division rate (K
ll
) (fig. 3g).
Udover hjernetumorer vi har anvendt vores model til brystkræft. Dyrkede vi og opformeret
in vitro
tre forskellige bryst tumorcellelinjer (KPL-1, MCF-7 og BT-474 navngivet henholdsvis linje A, B, og C) Ved at anvende tilsvarende dyrkningsbetingelser, der anvendes til NSA. Vi anvendte serumfrit medium indeholdende human epidermal vækstfaktor (rhEGF) og basisk fibroblastvækstfaktor (rhbFGF) tillader brysttumorceller til at vokse og danne sfæriske ikke-adhærente mammospheres [11], [19], målt folden udvidelse af brystcancer linjer over seks til otte passager og beregnet deres respektive K
ll
(fig. 4a-b). Vores matematisk model af mammosphere assay forudsiger en hastighed på LTP cancercelle symmetrisk opdeling af 0,125 ± 0,011 for linje A, 0,078 ± 0,005 for linie B og 0,026 ± 0,003 for linje C. 10
6 celler af hver brysttumorcellelinje blev transplanteret under huden på immunsvækkede mus og dannede tumorer ved forskellige sats (fig. 4c). Svarende til hjernen tumor eksperimenter, cellelinjer der udviser højere LTP cancercelle symmetrisk division Andelen til hurtigere tumorudvikling kombineret med dårligere overlevelse som demonstreret i graf, der sammenligner K
ll
til den gennemsnitlige overlevelsestid af de transplanterede dyr (fig. 4c-d).
(a-b) tre brystcancercellelinier blev dyrket i mammosphere assay. Under disse forhold de 3 cellelinjer vises forskellige ekspansion sats og LTP celle symmetrisk division frekvens. ** P 1 × 10
-5, t-test, 2 haler, n = 36-48. (C) Tumorvækst blev overvåget overtid mellem de 3 grupper, hvorfra overlevelse analyse blev udført og plottes som procent af dyr, der ikke nå den maksimale tumorstørrelse (520 mm
3) som en funktion af tid. Logrank test, p 0,0001 sammenligne de tre populationer til hinanden, n = 10. (d) Svarende til hGBM, tumorprogression efter brystkræft celle s.c. transplantation var direkte og omvendt korreleret til den symmetriske division satsen for LTP kræftcelle. De stiplede linier svarer til 95% tillid bånd af fit kurve opnået ved ikke-lineær regression (y = 0,1743 – 0.001123x – 0.00002258x
2). Koefficient R
2 og p-værdi vises også.
Alt i alt tyder disse resultater på, at LTP kræftcellen selvfornyende symmetrisk division sats målt
in vitro
hjælp Sphere Analyser kan anvendes til at forudsige tumor progression baseret på den antagelse, at øget selvfornyende symmetriske afdelinger af LTP cancerceller vil producere mere tumorfremkaldende celler, hvilket resulterer i en mere aggressiv tumor. Disse data også validere den potentielle anvendelse af vores model i cancer og støtte betydningen af den maligne LTP cellekammer i driver udvidelsen af tumoren og påvirke resultatet sygdom.
Modellen kan også anvendes til at identificere midler som specifikt rettet mod LTP cancer cellepopulation vs. der er rettet mod STP cancer cellepopulation. Tidligere havde vi vist, at eksponering af dyrkede hGBM til BMP4 reducerer K
ll
tyder på, at den er rettet mod LTP kræftcellen population (dvs. kræft stamceller), hvilket blev bekræftet af en signifikant reduktion i
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.