PLoS ONE: Epigenetisk mekanismer bag den dynamisk udtryk for kræft-testis Gener, PAGE2, -2B og SPANX-B, under Mesenchymale-til-Epitelial Transition

abstrakt

Cancer-testis (CT) gener udtrykkes i forskellige cancere, men ikke i andre end i celler af kimcellelinje normale væv. Selvom DNA demethylering af promoter-proksimale CpG’er af CT-gener er knyttet til deres udtryk i kræft, de mekanismer, der fører til demethylering er ukendte. For at belyse disse mekanismer, vi valgte at studere Caco-2 kolorektal cancer cellelinje i løbet af sin spontane differentiering

in vitro

, som vi fandt CT gener, især

PAGE2, -2B

og

SPANX-B

, at være opreguleret i løbet af denne proces. Differentieringen af ​​disse celler resulterede i en mesenchymal-til-epitel overgang (MET) som det fremgår af forstærkningen af ​​epiteliale markører CDX2, Claudin-4 og E-cadherin, og et ledsagende tab af mesenchymale markører vimentin, Fibronectin-1 og Transgelin. PAGE2 og SPAN-X opregulering blev ledsaget af en stigning i Ten-eleven translokation-2 (TET2) udtryk og cytosin 5-hydroxymethylation samt afstandtagen af ​​heterochromatin protein 1 og Polycomb undertrykkende kompleks 2 protein EZH2 fra promotor-proksimale regioner af disse gener. Tilbageførsel af differentiering resulterede i nedregulering af

PAGE2, -2B

SPANX-B

, og induktion af epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) markører, der viser den dynamiske karakter af CT genregulering i denne model

Henvisning:. Yilmaz-Ozcan S, Sade A, Kucukkaraduman B, Kaygusuz Y, Senses KM, Banerjee S, et al. (2014) Epigenetisk mekanismer bag den dynamisk udtryk for kræft-testis Gener,

PAGE2

,

-2B

SPANX-B

under Mesenchymale-til-Epitelial Transition. PLoS ONE 9 (9): e107905. doi: 10,1371 /journal.pone.0107905

Redaktør: keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: 17. maj 2014; Accepteret: August 22, 2014; Udgivet: 17 September, 2014

Copyright: © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud nr. 112S023 fra The videnskabelig og teknologisk forskning råd i Tyrkiet (TUBITAK) til AOG, en ung Investigator Award fra den tyrkiske Academy of Sciences til SB, og ved TUBITAK-BIDEP stipendier til SYO og BK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancer-testis (CT) eller cancer-kimcellelinje gener udtrykkes i tumorer med oprindelse fra forskellige væv, såvel som i normale germlinie og trophoblastceller, men er generelt tavse i andre normale væv i den voksne [1] – [3]. Mere end 100 forskellige CT-gener kan grupperes efter homologi i familier [2]. Trods den manglende sekvens lighed mellem CT-gener fra forskellige familier, har re-ekspressionen af ​​alle CT-gener i tumorer været forbundet med demethylering af CpG rester inden for deres promoter-proksimale regioner [4]. Denne fælles mekanisme af ekspression regulering er mest sandsynligt årsagen til deres koordineret ekspression i cancer [5] – [7]. Men den nøjagtige mekanisme, hvorved DNA demethylering forekommer ved CT genpromotor-proximale regioner i cancere er ukendt. CT-gener viser for det meste en heterogen ekspressionsmønster i tumorer [8] – [10]; i modsætning til deres ekspression i testiklerne, som er afgrænset og velordnet [11]. En undersøgelse, hvor stamceller-lignende og ikke-stamceller lignende celler af brystcancer blev selektivt dræbt, viste, at CT-genekspression er generelt en funktion af mere differentierede, ikke-stamceller [12]. Tilsvarende i melanom, en undergruppe af celler med flere epitel har hurtig CT gener, når celler med mesenkymale funktioner ikke [13] gør. Interessant, kan melanom celler skifte mellem disse to klasser

in vivo

, tyder på, at tumor heterogenitet, som defineret af CT genekspression, kan udgøre en overgangsfase ligner kontakten mellem epitel og mesenkymale fænotyper. Faktisk er mesenchymal-til-epitel overgang (MET) associeret med induktion af CT-genekspression [14]. At definere mekanismer involveret i regulering af CT genekspression i kræft og under behandling, valgte vi at studere Caco-2 spontan differentiering model, som viser træk af MET og EMT under differentiering og de-differentiering, hhv. Vores data viser, at den dynamiske regulering af de to CT gener,

SIDE

SPANX-B

i dette modelsystem, indebærer ændringer i Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) og heterochromatin protein 1 ( HP1) belægning inden for deres promoter-proksimale regioner, med overensstemmende ændringer i TET udtryk og cytosin hydroxymethylation (HMC) niveauer.

Metoder

cellelinjer, induktion af differentiering og de-differentiering

Caco-2-cellelinje blev opnået fra SAP Enstitusu (Ankara, Tyrkiet). HCT116 (kolorektal) og Mahlavu (hepatocellulær) cancer cellelinjer blev opnået fra LGC standarder, Middlesex, Storbritannien. En lungecancer-cellelinie (SK-LC-17) var fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA. Caco-2 celler blev dyrket i EMEM og andre i RPMI suppleret med 20% FBS, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1,5 g /l natriumbicarbonat og 1 mM natriumpyruvat. Alle celledyrkningsmedier og supplementer blev erhvervet hos Biochrom AG, Berlin, Tyskland. Den første dag cellerne nåede konfluens blev udpeget dag 0. Celler dyrket i parallelle kulturer blev anvendt til at bestemme fænotypiske ændringer på dag 0, 5, 10, 20 og 30, efter konfluens. Yderligere foranstaltninger for differentiering for celler, der anvendes i denne undersøgelse er rapporteret andetsteds [15]. For at fremkalde dedifferentiering blev celler på den 20. dag i differentiering fritliggende og genudpladet på omkring 50% sammenløb og RNA og protein blev høstet 5 dage efter udpladning.

I silico

analyse af CT og EMT genekspression

Expression data indeholdt i GSE1614 [16] var GC-RMA normaliseret ved hjælp GeneSpring v. 11.0. CT-genekspression blev analyseret baseret på 31 probesets i svarende til 23 CT-gener fra 7 familier (figur S2). En fortolkning er blevet til med en enhed, liste bestående af EMT relaterede gener som defineret af Loboda et al. [17], på tre forskellige tidspunkter. Gener for validering blev udvalgt blandt dem, for hvilke signifikante forskelle i ekspression (p 0,05) blev observeret ved envejs-ANOVA-test og Bonferroni FWER korrektion, når prolifererende celler blev sammenlignet med dem på dag 15.

Kvantitativ RT- PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Ambion, Foster City, CA, USA) og behandlet med DNase i (Ambion, Foster City, CA, USA). 200 ng RNA revers transkriberet under anvendelse Revert-Aid første streng cDNA syntesekit (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA). PCR reaktioner blev udført under anvendelse af et ABI 7500 termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Alle reaktioner blev udført ifølge producentens anbefalinger. TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til følgende: GAPDH (4352934E), SPANX-B (Hs02387419_gH), PAGE2 og -2B (Hs03805505_mH), GAGE ​​(Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1), og MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Green Master mix med ROX henvisning farvestof (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til at bestemme

CDH1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1

TAGLN

udtryk (tabel S1) . Cykling betingelser for disse assays var 50 ° C i 2 min., 95 ° C i 10 min., Efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 15 sek., 60-65 ° C i 1 min. Relative ekspression blev beregnet ved ΔΔCt metoden [18]. Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer, og alle forsøg blev gentaget mindst to gange.

Promoter methyleringsanalyse

Genomisk DNA blev isoleret ved proteinase K-behandling, efter en phenol-chloroform-ekstraktion protokol. Bisulfit behandling af 200 ng genomisk DNA blev udført ved anvendelse Zymo DNA-methylering Gold Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfit modificerede DNA blev opbevaret ved -20 ° C og anvendt til PCR i løbet af 2 måneder. To runder af DNA-amplifikation blev udført under anvendelse One Taq Hot Start DNA-polymerase (New England Bioscience /NEB, Ipswich, MA, USA) under anvendelse af et Perkin Elmer 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Anvendte primere er angivet i tabel S1. PCR-produkter blev gel ekstraheret under anvendelse af Qiagen gelekstraktionskittet (Qiagen, Hilden, Tyskland) og klonet i pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmid-DNA blev oprenset ved anvendelse af QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) fra mindst ti kloner, og sekvensen analyseret ved IONTEK (Istanbul, Tyrkiet).

5-hydroxymethyl cytosin analyse

Caco-2 genomisk DNA (gDNA) blev klippet ved probelydbehandling (30 sek. på, 30 sek. off, 5 cykler) for at opnå 200-600 bp. fragmenter vurderet ved 1% agarose gel elektroforetisk analyse. Immunfældning blev udført ved anvendelse af hMEDIP kit (Abcam, Cambridge, UK) ifølge producentens instruktioner. 5 pg af kontrol-DNA blev tilsat til 500 ng gDNA at bruge som en intern kontrol. Positive og negative kontroller i kittet blev indbefattet i alle forsøg. 2 pi fra det eluerede DNA blev anvendt som skabelon til kvantitativ RT-PCR under anvendelse af 2 X SYBR Green Master Mix med ROX henvisning farvestof (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) med primerne er givet i tabel S1 og S2. Primer effektivitet blev kontrolleret. Cyklingsbetingelser var 50 ° C i 2 min., 95 ° C i 10 min. efterfulgt af 40 cykler af 94 ° C i 15 sek., 60 ° C i 1 min. Delt genomisk DNA blev inkluderet i kvantitativ RT-PCR for at beregne% input.

immunfluorescensmikroskopi Salg

Celler bundet til objektglas ved centrifugering under anvendelse af Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) blev straks fikseret i 2% formaldehyd /PBS ved stuetemperatur i 15 minutter. Fikserede celler blev permeabiliseret i 0,2% Triton X-PBS i 10 min. efterfulgt af blokering med 1% BSA i 0,1% PBS-Tween i 1 time. Inkuberinger med det primære antistof, fortyndet i 1:50 blev udført natten over ved 4 ° C. Sekundært antistof blev tilsat ved 1:200, efter vask i 0,1% PBS-Tween i 5 minutter. 3 gange og inkuberet med cellerne i 45 minutter. ved stuetemperatur (se tabel S3 for den komplette antistof liste). Farvede prøver blev monteret med monteringsmedium (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) indeholdende DAPI-opløsning. Cellelinjer anvendes som positive kontroller var Mahlavu (PAGE-2, -2B og SPANXB), MDA-MB 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) og SW620 (CDX2, FN1). Negative kontroller var kombinationer af primære antistoffer med un-relaterede sekundære antistoffer. Alle billeder blev opnået ved hjælp af en AxioCam MRC5 billedoptagelse enhed (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Western-analyse

Cellelysater (ekstraheret med RIPA buffer) adskilt på 4-12% Novex Bis -tris SDS geler (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev overført til Immobilon-PSQ membraner (Millipore Corp. Bedford, MA, USA) med en Invitrogen western blotting-systemet (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA). Efter blokering med 5% mælkepulver i 0,02% PBS-T, blev blots inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C. Primære antistof fortyndinger var 1:1000 for CDX2, fibronektin, vimentin og transgelin, 1:2500 for β-actin og 1:100 for SPANX-B og PAGE-2, 2b antistoffer. HRP-konjugeret sekundært antistof (Abcam, Cambridge, UK) blev anvendt ved en 1:5000 fortynding og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Signaler blev påvist ved anvendelse af ECL luminescens-assay (BioRad, Hercules, CA, USA).

chromatin immunoprecipitation

kromatin Immunfældning (chip) blev udført som tidligere beskrevet [15]. Kort fortalt blev formaldehyd tværbundne cellebestanddele udfældet ved proten A Sepharose perler koblet til antistoffer mod EZH2, HP-1 eller H3K27m3 (Abcam, Cambridge, UK), såvel som isotype-specifik kontrol. Fældet DNA blev opformeret ved anvendelse af primere specifikke for

PAGE2

,

-2

eller

SPANX-B

promotorsekvenserne (tabel S1 og S2), efter de-krydsbinding.

Resultater

CT genekspression under Caco-2 spontan differentiering (Caco-2 SD)

Den udifferentierede kolorektal cancer cellelinje Caco-2 gennemgår enterocytic differentiering efter at have nået sammenløb

in vitro

[19], [20]. Gradvis differentiering er observeret op til 30 dage efter konfluens som det fremgår af opregulering af forskellige differentierings-associerede gener herunder sucrase-isomaltase, alkalisk phosphatase og carcinoembryogenic antigen (CEA), (fig S1) [15]. En

i silico

analyse af CT genekspression som defineret af 31 probesets i GSE1614 datasæt, som indeholder genekspression data til Caco-2 SD model opnået under differentiering (prolifererende (2

nd dag), post-spredning-udifferentierede (8

th dag), og post-spredning-opdelte (15

th dag)) [16], afslørede beskedne opregulering af næsten alle CT gener under differentiering (Figur S2). Vi valgte at validere ændringen i ekspressionen af ​​seks CT gen /gen familier ved kvantitativ RT-PCR i differentierende Caco-2 celler

in vitro

.

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

og

SSX4

afskrifter var målbart på den første dag i sammenløb, samt på senere tidspunkter (data ikke vist). Men signifikant opregulering af

PAGE2

(

2 og 2B

), og

SPANX-B

gener var tydelig (figur 1).

Relativ mRNA ekspressionen af ​​CT gener (

PAGE2

,

-2B

SPANXB

) (A), epitelial gener (

E-cadherin (CDH1)

,

claudin 4 (CLDN4)

,

CDX2

) (B), og mesenkymale gener (

fibronektin 1 (fn1), vimentin (VIM)

,

transgelin (TAGLN)

) (C) som bestemt ved kvantitativ PCR på dag 0, 10, 20 og 30 post-konfluens. Data viser gennemsnittet af to eksperimenter. Ændring i ekspressionsniveauerne for alle gener mellem dag 0 og 30 er statistisk signifikant (P 0,0001 ved tovejs ANOVA med Tukey indlæg hoc test)

PAGE2

og

SPANX-B

udtryk følg MET i Caco-2 SD model

Spontan differentiering af Caco-2

in vitro

er blevet rapporteret at resultere i MET [21], [22 ]. At afgøre, om dette skete parallelt med opregulering af

PAGE2

og

SPANX-B

, vi analyserede GSE1614 datasæt til ekspression af gener, der repræsenterer EMT i kolorektal cancer [17], og udvalgt 6 gener skal valideres i vores model. Analyse af mRNA og protein udtryk for disse afslørede et fald i mesenkymale gener (

vimentin, fibronektin 1

og

transgelin

) med en samtidig stigning i ekspressionen af ​​epitelial gener (

CDX2, claudin -4

og

E-cadherin

) som cellerne differentierede, hvilket viser, at stigningen i CT genekspression sker samtidig med MET i denne model (figur 1 . Figur S3)

PAGE2, SPANX-B og EMT genekspression

in situ

for at undersøge, om ændringerne i protein udtryk for CT og EMT generne opstod samtidig i de samme celler, vi udførte dobbelt immunofluorescensfarvning under differentiering. En gradvis tab af mesenchymale markører blev observeret som celler differentieret, med en samtidig stigning i epiteliale gener og CT-gener. SPANX-B og PAGE-2 var ofte co-udtrykkes med epitelial markør CDX2 i de samme celler, men næsten aldrig med VIM eller FN1 (figur 2, 3 og figur S4, S5, S6, S7).

immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2-celler med DAPI kontrastfarvning afslører en gradvis stigning i nuklear SPANX-B (grøn) med et samtidigt fald i cytoplasmatisk vimentin ekspression (rød); (20 × forstørrelse) (A). Mindre end 1% af SPANX-B positive celler viste farvning for vimentin på dag 0 (B).

immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2-celler med DAPI kontrastfarvning afslører overlappende SPANX-B (Alexa Fluor 488 : grøn) og CDX2 (Alexa Fluor 568: rød) udtryk; (20 × forstørrelse) (A). Mere end 60 til 80% af cellerne viser dobbelt-mærkning, når analyseret kvantitativt (B).

PAGE2 og SPANX-B-ekspression korrelerer med øget HMC og 10-11 translokation methylcytosin dioxygenase (TET) op -forordning

Angivelse af alle CT-gener studeret hidtil herunder

PAGE2

og

SPANX-B

har været forbundet med den demetylering af CpG rester inden for regionerne nærmest transkriptionsstarten site [1], [2], [23] – [26]. I denne linje, både

PAGE2

og

SPANX-B

kan være opreguleret med 5-aza 2′-deoxycytidin behandling (figur S8). Men hydrogensulfit sekventering af promoter-proksimale regioner af både

PAGE2

og

SPANX-B

afslørede ingen forskelle på forskellige stadier af Caco-2 SD (Figur 4). Som bisulfit sekventering er ude af stand til at skelne methyl cytosin (MC) fra HMC, vi spurgte, om ændringen i CT genekspression kunne relateres til ændrede HMC /MC-forhold inden for deres initiativtagere. Faktisk kromatin immunofældning (chip) med et HMC specifikt antistof afslørede en stigning i HMC under differentiering i både

PAGE2

og

SPANX-B2

initiativtagere (figur 5). Vi næste spurgte, om stigningen i HMC var relateret til en stigning i TET1, -2, og -3 udtryk som disse proteiner er ansvarlig for at konvertere mC til HMC [27], [28]. Faktisk er stigningen i HMC af

PAGE2

og

Spanx-B2

initiativtagere blev korreleret med en opregulering af

TET2

mRNA-ekspression, sammen med beskedne stigninger i

TET1

og

3 fotos (figur 6A). Dobbelt immunfluorescensfarvning viste, at størstedelen af ​​celler, der udtrykker PAGE2 eller SPANX-B var positive for TET2 farvning; indikerer disse to begivenheder fandt sted i de samme celler (figur 7). Det er derfor sandsynligt, at stigningen i TET2 ekspression forårsager forøget HMC i disse gener. Interessant nok blev kun en lavmolekylær translationsprodukt (-25 kD) af TET2 steget i de differentierende celler, når ingen klar forskel i den fuld-længde TET2 protein blev observeret (figur 6B 0,001, 0,02, og 0,001 for EZH2; 0,003, 0,001, og 0,0001 for H3K27m3; og 0,001, 0,001, og. 0,001, for HP1 henholdsvis

PAGE2

og

SPANX-B

opregulering er tilbageført i EMT

Vi antager, at hvis de epigenetiske ændringer underliggende CT genekspression skete parallelt med markedsøkonomisk behandling, at denne proces kan vendes, hvis celler indtastet EMT. For at teste denne hypotese blev differentierede Caco-2-celler afmonteret og fik lov til at proliferere i 5 dage. Dette resulterede i deres hurtige de-differentiering som det fremgår af nedregulering af SI. De-differentierede celler nedreguleret

PAGE2

og

SPANX-B

, samt

CDX

, da de opreguleret

TAGLN

, i overensstemmelse med løbende EMT (figur 9). Selv transskription af alle tre

TET

gener faldt i de-differentiering (figur 9), vi ikke observere et fald i HMC i denne periode (data ikke vist). Vi konkluderer derfor, at den opregulering af CT genekspression er reversibel i denne model.

De-differentiering induceret af vækst under ikke-sammenflydende betingelser angivet med nedsat

saccharose isomaltasemangel

(SI ) mRNA niveauer (A), fører til nedregulering af

CDX2

,

PAGE2, -2B

SPANX-B

, med samtidig opregulering af

TGLN

(B).

TET1

og

-2

mRNA’er også nedreguleret under de-differentiering (C).

Diskussion

Tidligere undersøgelser viste, at CT-genekspression korreleret med en epitelial snarere end en mesenchymal fænotype, og viste opregulering af CT-gener under MET [12], [14]. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der beskriver ændringer i flere epigenetiske mekanismer i promotorer af to CT gener under MET-lignende differentiering overensstemmende med en dynamisk ændring i genekspression. Som hydrogensulfit sekventering af

PAGE2

og

SPANX-B

initiativtagere viste ingen ændringer ved differentiering, skal den øgede HMC strengt involvere methylerede CpG rester. Dette er i overensstemmelse med det faktum, at TET enzymer er ansvarlig for omdannelsen af ​​5-methyl cytosin til 5-hydroxymethyl cytosin [27], [28]. Omdannelse af HMC til mC er en langt mere kompleks proces og kan ikke ske med lignende kinetik [32], [33]. Dette er sandsynligvis grunden til, at vi ikke observere en ændring i HMC løbet af fem døgn de-differentiering proces med Caco-2 celler på trods af faldet observeret i globale TET niveauer. Vores konklusion om, at

PAGE2

,

SPANX-B

TET2

induktion er reversibel ligner en anden undersøgelse i embryonale stamceller, hvor C-vitamin viste sig at inducere TET2 udtryk, hvilket igen resulterede i opregulering af CT-gener. Begge begivenheder var reversible ved C-vitamin tilbagetrækning [34].

Selvom hydroxymethylation inden genpromotorer er blevet rapporteret at falde i differentiering af normale celler, en nylig undersøgelse viste, at omkring 20% ​​af alle ændrede cytosiner i de fleste CT-gener i menneskelige hjerne, hvor de ikke er udtrykt, består af HMC [35]. Opregulering af TET2 udtryk i kræft har været forbundet med MET [36], [37]; og derfor en mere differentieret tilstand [30]. Svarende til den inverse korrelation mellem EZH2 og CT /TET2 ekspression rapporterer vi her, har andre vist EZH2 og TET enzymer til at undertrykke og inducerer differentiering af neuronale prækursorer, henholdsvis [38]. CT gener er opreguleret i de indledende faser af udviklingen i det menneskelige embryo, men falde som væv differentiere yderligere [39]. Som voksen kolon væv ikke viser PAGE2 eller SPANX-B-ekspression (data ikke vist), havde Caco-2-celler evnen til at differentiere yderligere, kan begge gener er blevet nedreguleret fuldstændigt. På den anden side, det faktum, at vi ikke kunne vise opregulering af

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1

eller

SSX4

udtryk i denne model kan være, fordi disse gener udtrykkes på tidligere stadier af differentiering. Vi tror dette, fordi SPANX-B-ekspression er primært i post-meiotiske celler i testiklerne (dvs. spermatocytter, spermatider, eller sæd), mens GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1 eller SSX udtryk er primært i spermatogonier [11] . Salg

Vores data og den for flere andre ‘angiver, at cancerceller, der udtrykker CT-gener har mere af en epitelial snarere end en mesenchymal fænotype. Vi foreslår, at CT-gener

PAGE2

og

SPANX-B

induceres under et vindue af differentiering, der korrelerer med opregulering af epitel markører for differentiering. Den Caco-2 SD model har gjort det muligt at observere aktivt skiftende epigenetiske landskab inden initiativtagerne til disse CT gener. Men som CT-genekspression i tumorer nøje er relateret til methylering tilstand af deres promotor, den proces, der fører til CT geninduktion i

n vivo

sidste ende kan resultere i “fiksering” af den epigenetiske stat, som vil til gengæld resultere i CpG-methylering. Men via dynamisk MET i tumorer [40], er det tænkeligt, at selv dette kan ændre sig i løbet af sygdommen.

Fra et klinisk perspektiv, data fra vores laboratorium samt fra andre afslører, at sub- gruppering af tumorer baseret på genekspressionsprofiler kan tydeligt identificere celler med forskellige kemo-følsomhed profiler [12], [41], [42]. I denne linje, vi forudsige fremtidige undersøgelser vil afsløre forskellige narkotika følsomhed profiler for tarmkræft undertyper som eventuelt defineret af

PAGE2

og

SPANX-B

udtryk, for hvilke Caco-2 SD-model kunne anvendes.

Støtte Information

Figur S1.

Post-sammenløbet differentiering af Caco-2

in vitro

. Opregulering af

sucrase-isomaltase

(A), og carcinoembryonisk antigen (CEA) (B) i celler opsamlet ved angivne dage efter konfluens (DPC) som bestemt ved kvantitativ RT-PCR og Western-analyse, henholdsvis . Alkalisk phosphatase-ekspression opreguleres også målt ved immunohistokemi afslørende differentiering (C). Andre mål for differentiering for celler, der anvendes i denne undersøgelse er tidligere blevet beskrevet (ref. 17). * P 0,001 (ANOVA med Tukey indlæg hoc test)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s001

(DOCX)

Figur S2.

opregulering af CT genekspression under Caco-2 spontan differentiering

in vitro

. Heat map baseret på 31 probesets i GSE1614 svarende til 23 CT gener fra 7 familier. I forhold til prolifererende celler, genekspression trinvist stiger ind på sammenløb (8

th dag) og yderligere under post-sammenløbet differentiering (15

th dag)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905. S002

(DOCX)

figur S3.

Western analyse af differentielt udtrykte gener under Caco-2 SD. En gradvis stigning i SPANX-B og CDX2 parallelt til et fald i ekspression af FN, VIM og TGLN op til dag 30 post-konfluens. Resultater fra 3 uafhængige differentiering forsøg er vist

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s003

(DOCX)

Figur S4.

SPANX-B og Fibronectin udtryk show begrænset overlap i differentiere Caco-2 celler. Immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2-celler med DAPI kontrastfarvning afslører en gradvis stigning i nuklear SPANX-B (Alexa Fluor 488: grøn) med et samtidigt fald i cytoplasmatisk fibronectin ekspression (Alexa Fluor 568: rød); (20 × forstørrelse) (A). Mindre end 10% af celler, der udtrykker SPANX-B farvet for fibronectin på dag 0 (B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s004

(DOCX)

Figur S5.

PAGE2, -2B og vimentin udtryk er gensidigt udelukkende i at differentiere Caco-2 celler. Immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2 celler med DAPI kontrastfarvning afslører en gradvis stigning i den nukleare PAGE2, -2B (Alexa Fluor 488: grøn) med en samtidig reduktion i cytoplasmatisk vimentin udtryk (Alexa Fluor 568: rød); (20 × forstørrelse) (A). Mindre end 10% af celler viste dobbelt fluorescens, når Farvning blev analyseret kvantitativt på dag 0. På senere tidspunkter, ingen af ​​cellerne viste dobbelt-farvning (B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s005

(DOCX)

Figur S6.

PAGE2, -2B og fibronektin udtryk er gensidigt udelukkende i at differentiere Caco-2 celler. Immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2 celler med DAPI kontrastfarvning afslører en gradvis stigning i den nukleare PAGE2, -2B (Alexa Fluor 488: grøn) med en samtidig reduktion i cytoplasmatisk fibronektin udtryk (Alexa Fluor 568: rød); (20 × forstørrelse) (A). Mindre end 15% af celler viste dobbelt fluorescens, når farvning blev analyseret kvantitativt på dag 0 (B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s006

(DOCX)

Figur S7.

Nuklear co-lokalisering af CDX2 og PAGE2, -2B i differentiere Caco-2 celler. Immunfluorescensfarvning differentiere Caco-2-celler med DAPI kontrastfarvning afslører overlappende PAGE2. -2B (Alexa Fluor 488: grøn) og CDX2 (Alexa Fluor 568: rød) udtryk;