PLoS ONE: Identifikation af mod malaria Forbindelser som Novel antagonister til kemokinreceptoren CXCR4 i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

På trods af nylige fremskridt i målrettede behandlinger, patienter med pancreas adenocarcinom fortsat har ringe overlevelse fremhæve det haster med at identificere nye terapeutiske mål. Vores tidligere undersøgelser har impliceret kemokinreceptor CXCR4 og dens selektive ligand CXCL12 i patogenesen og progression af pancreas intraepitelialneoplasi og invasiv kræft i bugspytkirtlen; dermed CXCR4 er et lovende mål for suppression af pancreas cancervækst. Her har vi kombineret

i silico

strukturel modellering af CXCR4 til at screene for kandidat anti-CXCR4 forbindelser med

in vitro

cellelinje analyser og identificeret NSC56612 fra National Cancer Institute (NCI) Open Chemical Repository Collection som en inhibitor af aktiveret CXCR4. Dernæst vi identificeret, at NSC56612 er strukturelt ligner den etablerede malariamedicin chloroquin og hydroxychloroquin. Vi evaluerede disse forbindelser i bugspytkirtelkræftceller

in vitro

og observerede specifik antagonisme af CXCR4-medieret signalering og celleproliferation. Seneste

in vivo

terapeutiske anvendelser af chloroquin i bugspytkirtelkræft musemodeller har vist nedsat tumorvækst og forbedret overlevelse. Vores resultater giver således et molekylært mål og grundlag for yderligere evaluering af chloroquin og hydroxychloroquin i bugspytkirtelkræft. Historisk sikkert i mennesker, chloroquin og hydroxychloroquin synes at være lovende midler til sikkert og effektivt målrette CXCR4 i patienter med kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Kim J, Yip MLR, Shen X, Li H, Hsin L-YC, Labarge S, et al. (2012) Identifikation af mod malaria Forbindelser som Novel antagonister til kemokinreceptoren CXCR4 i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 7 (2): e31004. doi: 10,1371 /journal.pone.0031004

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: Juni 29, 2011; Accepteret: December 30, 2011; Publiceret: 3 Feb 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Cancer Institute [P30 CA33572 til JK, MLRY, og NV]; National Institutes of Health (NIH) [NIH CA134637 til JK]; og American Cancer Society (ACS) [RSG-11-070-01-TBE til JK]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuscript.The indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Cancer Institute, NIH eller ACS.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft kanal kræft er en ensartet dødelig sygdom, der ofte diagnosticeret med fjernmetastaser på det tidspunkt. af indledende kliniske præsentation. Ukendt tidlig sygdom og en meget invasiv fænotype er primære faktorer for dårlig prognose i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen og fremhæve det haster at identificere molekylære mål for udviklingen af ​​sygdommen. For nylig har samspillet mellem chemokiner og deres tilsvarende receptorer blevet undersøgt i patogenesen, progression, og metastase af kræft i bugspytkirtlen [1], [2], [3]. Disse undersøgelser har antydet, at antagonister til kemokinreceptor CXCR4 kan ophæve den invasive fænotype af pancreascancer [4], [5], [6]. Trods stigende beviser på betydningen af ​​CXCR4 i bugspytkirtelkræft og andre maligniteter, antagonister til CXCR4 der er sikre og effektive til klinisk brug forblive mangler.

Chemokine CXCL12 (også kendt som stromale-afledt faktor-1α, SDF- 1α) aktiverer flere nedstrøms effektor veje ved binding dens receptor CXCR4 [7]. Den CXCL12-CXCR4 interaktion regulerer kemotaxi, adhæsion og sekretion af vækstfaktorer blandt mange af dets kendte funktioner [8]. Kort efter CXCR4 blev identificeret som en co-receptor for HIV-1 og HIV-2 [9], [10], den lille bicyclam molekyle AMD3100 blev identificeret som en specifik CXCR4 antagonist [5]. AMD3100 er nu almindeligt anvendt til at undersøge og afhøre CXCL12-CXCR4 interaktioner [7]. Selv AMD3100 forbliver i klinisk anvendelse til stamcellemobilisering, har sin kronisk indgivelse været forbundet med betydelig cardiotoksicitet [11]. Interessant nok har nylige undersøgelser vist, at ud over dets rolle som en antagonist til CXCR4 signalering, AMD3100 paradoksalt binder og aktiverer kemokinreceptor CXCR7 [12], [13].

Da gældende data tyder på, at AMD3100 ikke kan være sikker eller effektiv som en anti-CXCR4 antagonist til terapeutiske anvendelser i bugspytkirtelkræft, specifikke antagonister mangler at blive identificeret til dette formål. I denne tværfaglige undersøgelse, vi kombineret

in silico

modellering af CXCR4 struktur med high-throughput screening og

in vitro

analyser i bugspytkirtelkræft cellelinjer at identificere nye antagonister til CXCR4-medieret celleproliferation i bugspytkirtelkræftceller. Vores undersøgelse viser, at en sikker og effektiv malariamedicin chloroquin og hydroxychloroquin er effektive CXCR4-antagonister, der undertrykker kræft i bugspytkirtlen celleproliferation.

Resultater

Computational Modeling of CXCR4

strukturelle ensemble af vildtype CXCR4-receptoren blev forudsagt ved hjælp af

ab initio

strukturforudsigelse metode (MembStruk4.3) [14], [15]. Vi sammenlignede bindingen af ​​mono- og bicyclam forbindelser til vores forudsagte strukturer med mutagenese-data til at validere vores beregningsmæssige forudsigelser [16]. Vores forudsigelser blev indsendt til konkurrencen vurdering proteinstruktur (GPCRDOCK2010) forud for karakterisering af krystalstrukturen af ​​CXCR4 [17]. En detaljeret sammenligning af den forudsagte struktur med krystalstrukturen har bekræftet rigtigheden af ​​vores modellering og har været offentliggjort andetsteds (figur 1) [18].

Det lille molekyle betegnet “1T” placeres i den forudsagte bindende site. Den geometriske middelværdi afvigelse af de forudsagte og krystalstrukturer er 2,5 Å, hvilket viser tæt tilpasning af vores forudsagt model med den etablerede krystalstruktur. Følgelig den forudsagte placering af bindingsstedet af det lille molekyle “1T” matchet med krystalstrukturen. Den lille molekyle “1t” er afbildet som små kugler.

Vi udførte virtuelle ligand screening (VLS) af National Cancer Institute (NCI) Open Chemical Repository Collection 3 forskellige forudsagte konformationer af CXCR4. Derefter blev kandidat små molekyler filtreret baseret på deres nærhed til rester, der spiller en vigtig rolle i antagonist bindende, nemlig: D92 (TM2), H121 (TM3), D171 (TM4), E262 (TM6) og E288 (TM7) [ ,,,0],19], [20]. Ca. 90% af de små molekyler blev udelukket på dette trin.

Bindende energier af de små molekyler blev derefter beregnet og de øverste 10% af de små molekyler med de laveste bindingsenergier blev bibeholdt. De kemiske strukturer i de øverste 10% af de hits varierede fra multi-aromatiske ringstrukturer til strukturer med længere alkylkæder. Den primære kriterium for yderligere udvælgelse var samspillet mellem kandidatlandene molekyler med rester, der er kendt for at være vigtige for antagonist binding [16]. Disse molekyler blev derefter undersøgt for protein-ligand kontakter og 50 kandidat små molekyler blev udvalgt fra ca. 350.000 molekyler for eksperimentel test.

NSC56612 og beslægtede forbindelser inhiberer CXCR4-medieret signalering

Af de 50 kandidat forbindelser fra VLS, var vi i stand til at skaffe 32 fra NCI for eksperimentel afprøvning. Screening af de 32 forbindelser blev udført ved anvendelse af Tango-assayet, der tester inhiberingen af ​​CXCL12-medierede rekruttering af β-arrestin til den carboxyterminale ende af CXCR4. Dette assay identificerede en hit forbindelse, der undertrykte β-arrestin rekruttering og de kemiske strukturer af denne forbindelse NSC56612 er vist i figur 2. Vi yderligere udført en farveskala af direkte ligandbinding, sekundær messenger calcium flux, og nedstrøms kemotaksiassays medieret af CXCR4 /CXCL12 akse for at verificere, at disse forbindelser er direkte målrettet mod CXCR4. NSC56612 blev anvendt som en skabelon til at identificere forbindelser med lignende kemiske strukturer. Det førte til identifikation af tre andre forbindelser, der er anti-malariamidler:. Chloroquin, hydroxychloroquin, og quinacrine (figur 2)

(A) NCI sammensatte NSC56612, (B) chloroquin, (C) hydroxychloroquin, og (D) quinacrine.

Figur 3A viser koncentrationen afhængighed kurven for den direkte hæmning af fluorescens-mærket CXCL12 binding af NSC56612, chloroquin, hydroxychloroquin, og quinacrine. Kompetitive bindingseksperimenter viste at disse forbindelser direkte inhiberer binding af CXCL12 til CXCR4 med lav mikro-molær affinitet. Assayet hvori β-arrestin-2 rekruttering medieret af CXCL12 vurderes viste også inhibering med disse tre stoffer med lav mikro-molær virkning (figur 3B). Figur 3B viser også hæmning af AMD3100, en CXCR4 antagonist.

(A) Koncentration afhængig hæmning af fluorescerende mærket CXCL12 (60 nM) binding til Snap-mærket CXCR4-receptoren i HEK293 celler ved NSC56612, chloroquin og hydroxychloroquin. De halve maksimale effektive koncentrationer (EF

50), den værdi, hvortil maksimal CXCL12-CXCR4 binding hæmmes med 50%, for AMD3100, NSC56612, chloroquin og hydroxychloroquin er 60,0 nM, 5,5 pM, 6,1 pM, og 9,8 uM , henholdsvis. Disse kurver er repræsentative data fra 3 eksperimenter udført in duplo. (B) Dosisafhængig inhibering af CXCL12-induceret β-arrestin-2-medieret beta-lactamase-aktivitet i manipuleret Tango assay ved forbehandling med AMD 3100, NSC56612, chloroquin, og hydroxychloroquin. Emissionsdata på 460/530 blev defineret som responsforhold. Disse kurver er repræsentative data fra 3 eksperimenter udført in duplo. (C) Dosisafhængig inhibering af CXCL12-induceret intracellulær calcium flux af AMD 3100, NSC56612, chloroquin, hydroxychloroquin. CXCR4-medieret calciuminflux blev målt ved 1 uM AMD3100 og to forskellige koncentrationer (100 pM og 200 pM) af de tre forbindelser i Molt-4-celler. AMD 3100, NSC56612 viste chloroquin, og hydroxychloroquin 50 til 60% inhibering af CXCL12-induceret calciumindstrømning. Disse kurver er repræsentative data fra 3 eksperimenter udført in duplo. (D) Inhibering af CXCL12-induceret Jurkat cellemigrering ind ved AMD3100 (100 nM), NSC56612 (100 uM), chloroquin (100 uM), og hydroxychloroquin (100 uM). Alle fire forbindelser udviste 40% til 50% reduktion i CXCL12-induceret cellemigration. Figuren viser data fra 4 eksperimenter udført in duplo. Fejl søjler repræsenterer ± én SD. Student t-test:. * 0,05 og ** 0,01

Calcium flux, en sekundær messenger til CXCL12-medieret aktivering af CXCR4, måler aktivering af CXCR4. Den CXCL12-medieret calciumflux blev målt ved to forskellige koncentrationer af de fire stoffer, nemlig 100 uM og 200 uM. Som det ses i figur 3C, NSC56612 viste chloroquin, og hydroxychloroquin 50% til 60% inhibering af CXCL12-induceret calcium flux, mens quinacrin viste mindre end 10% inhibering (data ikke vist). Vi målte omfanget af inhibering med disse forbindelser til kemotaksi, en nedstrøms virkning i CXCR4-udtrykkende celler. Figur 3D viser virkningen af ​​forbindelserne i kemotaksiassays hvor inhiberingen af ​​CXCL12-induceret cellemigrering måles. For at vurdere koncentrationen af ​​forbindelser, der er nødvendige for kemotaksi inhibering, udførte vi en dosis-afhængig inhibering af kemotaksi af den ledende forbindelse NSC56612 som vist i figur 4. Alle fire forbindelser udviste 40% til 50% reduktion i CXCL12-induceret cellemigration. Quinacrine viste betydelig effekt i retning inhibering kemotaksisplader (data ikke vist), mens det havde ringe eller ingen virkning på calcium flux assay. Da quinacrine ikke undertrykke CXCL12-medieret calcium flux, blev det udeladt fra yderligere analyse i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Resultaterne af disse assays viser, at chloroquin og hydroxychloroquin direkte inhibere CXCR4 signalering. Salg

Celler blev udpladet i dyrkningsplader forsynet med 8-uM poremembranerne at skabe øvre og nedre cellekultur kamre. Celler blev udpladet i det øvre kammer og CXCL12 (30 nM) alene eller med tilsætning af NSC56612, chloroquin eller hydroxychloroquin blev anbragt i bundkammeret. Antallet af celler, som migrerede gennem membranen i 5 timer blev talt. Der vises data fra 4 eksperimenter udført in duplo. Relative ændringer i cellemigrering er afbildet med kontrolgruppen tilstand tjener som 100% migration. Fejl søjler repræsenterer ± én SD.

Klorokin og hydroxychloroquin Inhibit CXCL12-medieret ERK Phosphorylering

I en tidligere undersøgelse, opdagede vi, at CXCL12 inducerede en stigning i ERK phosphorylering [21]. Skønt udsættelse for CXCL12 også aktiveret PI-3K /AKT pathway, i hvilken grad AKT phosphorylering blev ændret var meget lavere end ERK phosphorylering. Derfor har vi fokuseret vores undersøgelse i denne undersøgelse på ERK aktivering. Først, vi bekræftet, at CXCL12 inducerer en stigning i phospho-ERK i bugspytkirtelkræft cellelinier (figur 5A). Derefter, demonstrerede vi, at chloroquin og hydroxychloroquin udøve dosisafhængige inhiberende virkninger på CXCL12-medieret ERK phosphorylering i PANC-1 og AsPC-1-celler (figur 5B). Endelig viser vi den kvantitative analyse af hæmning i phospho-ERK i figur 5C.

(A) Immunfarvning for phospho-ERK blev udført for PANC-1, Hs-766T, AsPC-1, og MIAPaCa- 2 cellelysater. Celler blev forbehandlet med chloroquin eller hydroxychloroquin (0,1 uM) i 30 minutter, hvorefter cellerne blev udsat for CXCL12 (200 ng /ml) i 20 minutter. Et antistof mod total ERK1 /2 blev anvendt som en loading kontrol. De CXCL12-medierede stigninger i phospho-ERK blev effektivt ophævet med enten chloroquin eller hydroxychloroquin. (B) Forbehandling af PANC-1 og AsPC-1-celler med chloroquin og hydroxychloroquin (0,1-10 uM) i 5 minutter efterfulgt af udsættelse for CXCL12 (200 ng /ml) viser dosisafhængige virkninger af lægemiddelbehandling på CXCL12-medieret ERK phosphorylering. (C) Western blots blev scannet og kvantificeret ved hjælp af AlphaImager Tm3400 (Alpha Innotech). Fold ændringer for phospho-ERK sammenlignet med ubehandlede kontroller blev beregnet som relative ekspression, som var normaliseret til protein båndintensiteter af total ERK. Dataene viser middelværdien af ​​tredobbelte eksperimenter med

s

-værdier. 0,05 betragtet som statistisk signifikant

Klorokin og hydroxychloroquin Trigger Apoptose og hæmmer CXCL12-medieret spredning og Anti-Apoptose

Klorokin og hydroxychloroquin cytotoksicitet i bugspytkirtelkræft cellelinjer blev vurderet og IC50’er blev bestemt (figur 6). Under anvendelse af disse værdier, vi evaluerede CXCR4 signalering i et celleproliferationsassay. Vi har tidligere observeret CXCR4-medierede stigninger i celledeling i bugspytkirtelkræftceller [21]. Derfor chloroquin og hydroxychloroquin blev vurderet for antagonisme af CXCR4-medieret celleproliferation; og vi observeret, at begge midler effektivt antagoniserede CXCR4-medieret celleproliferation i PANC-1, Hs-766T, og MiaPaCa-2-celler (figur 7). Da øget proliferation ikke blev observeret i AsPC-1 celler efter udsættelse for CXCL12 blev disse celler ikke vurderes med chloroquin og hydroxychloroquin i denne analyse. Vores resultater er i overensstemmelse med offentliggjorte rapporter, der viser, at ikke alle kræft i bugspytkirtlen cellelinjer reagerer på CXCL12 med øget proliferation [2]; den mekanisme ansvarlig for denne er endnu ikke blevet belyst. Både chloroquin og hydroxychloroquin viste reduktion i phospho-ERK i nærvær af CXCL12, med den totale ERK koncentration er upåvirket. Disse resultater viser, at chloroquin og hydroxychloroquin specifikt inhiberer CXCR4-medieret signalering til at undertrykke celleproliferation i bugspytkirtelkræftceller.

AsPC-1, Hs-766T, MiaPaCa-2, og Panc-1-celler blev behandlet med en dosis vifte af chloroquin eller hydroxychloroquin (0,01-10 uM) efter 72 timer for at bestemme halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50-værdier) af disse forbindelser. ASPC-1 og Hs-766T celler havde lignende IC50-værdierne for chloroquin og hydroxychloroquin, mens MiaPaCa-2 og PANC-1 celler havde højere IC50-værdierne for hydroxychloroquin end chloroquin.

(A) PANC-1 , (B) Hs-766T, og (C) MiaPaCa-2-celler blev forbehandlet med chloroquin eller hydroxychloroquin (0,1 uM) i 30 minutter, hvorefter cellerne blev udsat for CXCL12 (200 ng /ml) i 72 timer. (D) Forbehandling med chloroquin og hydroxychloroquin udløste også apoptose og nedsat CXCL12-medieret apoptose i PANC-1 celler. Dataene viser middelværdien af ​​tredobbelte eksperimenter.

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Da mekanismen for ændringer i celledeling ikke var klart, vi også vurderet apoptose efter udsættelse for chloroquin og hydroxychloroquin. Først vores resultater tyder på, at CXCL12 fremmer anti-apoptose i bugspytkirtelkræftceller. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte rapporter for de CXCL12 /CXCR4 akse [22], [23]. For det andet, vores resultater viser, at chloroquin og hydroxychloroquin ophæver CXCL12-medieret anti-apoptose (figur 7D), hvor forbehandling med chloroquin eller hydroxychloroquin øget apoptose i PANC-1 celler.

Diskussion

Ved hjælp af en tværfaglig tilgang startende med datamodellering af CXCR4 receptor struktur til

in vitro

analyse af CXCR4 signalering, vores undersøgelse har fastslået, at chloroquin og hydroxychloroquin handle som nye CXCR4 inhibitorer i bugspytkirtelkræftceller. Vi har vist, at disse klinisk sikre og effektive anti-malaria midler specifikt hæmmer binding af CXCL12 til CXCR4 og hæmmer CXCL12-CXCR4 nedstrøms effektor veje, der medierer calcium flux, rekruttering af ß-arrestin-2 og celle migration. I bugspytkirtelkræft cellelinjer bestemt vi, at chloroquin og hydroxychloroquin blok CXCL12-medieret signalering gennem ERK vej med efterfølgende virkninger på både apoptose og celleproliferation. Da CXCR4 synes at have en vigtig rolle i patogenesen og udviklingen af ​​pancreascancer [1], [2], [3], vores arbejde har vigtige kliniske implikationer i identifikationen af ​​en hidtil ukendt terapeutisk anvendelse til disse etablerede anti-malariamidler.

Vores indledende undersøgelser kræves nøjagtig karakterisering af strukturen af ​​CXCR4. Brug af beregningsmæssige metoder, der tidligere er udviklet af os, vi forudsagde den tredimensionelle struktur af CXCR4 og bindingsstederne for kendte antagonister med små molekyler, såsom cyclam forbindelser [16], [24], [25]. Vores strukturelle forudsigelser blev udført forud for offentliggørelsen af ​​krystalstrukturen af ​​CXCR4 [17]. Efterfølgende sammenligning af forventet strukturer til krystal viste en fremragende aftale af kvadratrodsafvigelsen i koordinaterne for liganden på 2,2 Å. Disse resultater blev opmuntrende at fremme vores undersøgelse på udkig efter små molekyle CXCR4 antagonister i bugspytkirtelkræftceller. Med de forudsagte konformationer af CXCR4, brugte vi etableret biblioteker af forbindelser for at identificere kandidatantagonisten hits. Begrænsning hits til de bedste 32 kandidater, udførte vi high-throughput screeningsassays, hvilket yderligere indsnævret vores kandidat liste til 3 forbindelser. Disse indledende undersøgelser førte os til NCI sammensatte NSC56612. Udforskning af den kemiske struktur af NSC56612 for lignende forbindelser via offentlige og kommercielle databaser afslørede, at NSC56612 delte strukturel homologi til chloroquin, hydroxychloroquin, og quinacrin; men kun chloroquin og hydroxychloroquin bestået alle vores screeningsassays. Den uensartede effekt af quinacrine kunne være sekundær til uensartethed nedstrømseffektorer (

f.eks.

, Phospholipase C eller G-proteiner) for forskellige cellulære funktioner, hvilket kan resultere i varierende respons mellem celler. Andre undersøgelser har tidligere demonstreret forskellig effektivitet af diskrete G-protein koblet receptor ligander til forskellige assays [26], [27]. For at identificere de formodede bindingssteder af disse forbindelser Vi forankret chloroquin og hydroxychloroquin til krystalstrukturen af ​​CXCR4 (figur 8) og anført, at de tertiære amingrupper i disse forbindelser gør hydrogenbindinger med D97 på TM2 og E32 i aminoterminalen af ​​receptoren ; og aromatiske rester Y45, W94, H113 og Y255 show favorable van der Waals interaktion med det aromatiske ringsystem i disse forbindelser.

Green helixer, TM1, 2, 3, 5, 6, og 7 er vist. Ved binding, både chloroquin og hydroxychloroquin interagere positivt med de angivne rester (E32, N37, Y45, W94, D97, H113, I185, D187, Y255, E288) vist i pinde. Disse rester er inden for 5 Å af den bundne forbindelser. Imidlertid er de aminosyrerester ved CXCR4 bindingssted orienteret lidt forskellig afhængigt af, om chloroquin eller hydroxychloroquine binder. De relative orienteringer af CXCR4 aminosyrerester som interagerer med chloroquin og hydroxychloroquin er vist som grøn og cyan pinde henholdsvis.

Siden den invasive fænotype forbundet med CXCR4 er en manifestation af CXCL12-drevet signalveje testede vi chloroquin og hydroxychloroquin

in vitro

. Vi valgte at evaluere MAPK signalvejen, fordi vi tidligere har vist sin rolle i mediering af vækst og proliferation i pancreas intraepitelialneoplasi og bugspytkirtelkræftceller [21]. I vores aktuelle undersøgelser observerede vi effektiv hæmning af CXCL12-drevne ERK phosphorylering og hæmning af CXCL12-medieret proliferation

in vitro

.

Der er klinisk evidens for de anti-cancer effekter af chloroquin og hydroxychloroquin . I et klinisk studie med glioblastom multiforme, blev chloroquin administreret sammen med konventionel kemoterapi som adjuverende behandling hos patienter, som gennemgik kirurgisk resektion for glioblastoma multiforme. De patienter, der modtog chloroquin erfaring forbedret overlevelse sammenlignet med patienter, som fik kemoterapi alene [28]. Selvom de ikke identificere CXCR4 som et potentielt mål, Rubin

et al.

, Havde tidligere vist, at CXCR4 antagonisme hæmmede glioblastoma multiforme vækst, hvilket tyder på, at CXCR4 var et passende mål for glioblastom terapi [29]. Derudover har et klinisk forsøg for metastatisk kolorektal cancer indarbejdet hydroxychloroquin sammen med standard cytotoksisk kemoterapi [30]. Vores gruppe og andre har undersøgt CXCR4 udtryk i kolorektal cancer og observerede en potentiel rolle for CXCR4 i kolorektal cancer progression [4], [31], [32]. Vores undersøgelse viser, at chloroquin og hydroxychloroquin er antagonister til CXCR4 og tilvejebringer således en molekylær basis for anvendelse af chloroquin i patienter med metastatisk colorectal cancer. Da dette kliniske forsøg er i gang, er resultaterne endnu til at modnes. Klorokin har også for nylig blevet testet

in vivo

i en murin bugspytkirtelkræft model demonstrerer tumordræbende virkninger med forbedret overlevelse [33]. Men disse efterforskere brugte chloroquin uden en forståelse af dens virkninger på CXCR4,.

Selvom chloroquin og hydroxychloroquin er for nylig blevet anvendt til anti-cancer-programmer, de oprindeligt blev formuleret som anti-malariamidler. Disse lægemidler formuleredes fordi Atabrine, den første syntetiske anti-malaria-forbindelse, havde uønskede bivirkninger af farvning af hud og øjne [34]. Både chloroquin og hydroxychloroquin er svage baser, der er målrettet blodlegemer, der er smittet med malaria [35]. Disse lægemidler virker ved fortrinsvis at diffundere ind parasittens vacuolen hvor hæmoglobin nedbrydes [36]. I det sure vacuole, bliver de protonerede og fanget [36]. Inden vacuolen, de inhiberer nedbrydningen af ​​hæm, biprodukt af parasitiske nedbrydning af hæmoglobin [36]. Ophobningen af ​​hæm bliver toksisk og fører til celle og død af parasitten [36]. Bortset fra disse anti-malaria indikationer, har mekanismen for de antineoplastiske virkninger af chloroquin og hydroxychloroquin blevet undersøgt [37]. Chloroquin synes at inhibere autofagi og inducere p53-afhængig apoptose [38]; og kan også forstærke effekten af ​​kemoterapi eller strålebehandling [39].

Som konklusion, ved hjælp af en tværfaglig tilgang vi identificeret nye CXCR4-antagonister og har vist, at chloroquin og hydroxychloroquin hæmmer CXCL12-CXCR4 signalering. I betragtning af, at effektive antagonister til CXCR4 mangler, og at nye behandlingsformer har endnu til at forbedre overlevelsen over 1 år for patienter med metastatisk pancreascancer [25], [40], [41], vores resultater har vigtige kliniske implikationer. Vores undersøgelsens resultater giver et videnskabeligt grundlag for at bruge klorokin eller hydroxychloroquin i en bugspytkirtelkræft retssag; og da sikkerhedsprofilerne er veletablerede for disse stoffer, et klinisk forsøg kan hurtigt implementeres for patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Forudsigelse af CXCR4 Struktur

MembStruk4.3,

ab initio

struktur forudsigelse metode blev anvendt til at generere et ensemble af vildtype human CXCR4 strukturer [14], [15]. De trans-membran (TM) regioner i CXCR4 blev forudsagt ved hjælp af Tm2ndS metoden med tilpasningen multipel sekvens af human, rotte og mus CXC og CC-familien af ​​kemokinreceptorer (tabel 1) [14]. Vi optimeret den relative rotation og translation af de syv TM helixer og de spiralformede snoninger begynder fra en samlet bundt af kanoniske helixer bygget fra TM forudsigelser. Canonical højrehåndet a-spiraler blev bygget for hver helix og deres spiralformede akser blev orienteret i rummet i henhold til 7,5 Å lav opløsning elektron tæthed kort over frøen rhodopsin [42].

Dette 7,5 Å elektrontæthedskort billede de positioner og relative orienteringer af de spiralformede akser, der tjente til at optimere den spiralformede bundt. De relative translationelle orienteringer af de 7 spiraler blev optimeret ved at tilpasse den hydrofobe maksimum bestemmes for hver helix til et plan. Drejningsorienteringen blev optimeret under anvendelse af en kombination af hydrofobe øjeblikke og molekylære dynamiske teknikker. Data fra krystalstrukturen af ​​CXCR4 [17], som først for nylig er blevet karakteriseret, blev ikke brugt til disse forudsigelser.

Vi afledt et ensemble af lave energi TM tønde konformationer for CXCR4 og dens konstitutivt aktive mutanter [43] . Receptor konformationer blev udvalgt til at have det maksimale antal af inter-spiralformede hydrogenbindinger og den højeste samlede energi af proteinet konformation i et lipiddobbeltlag. Tre mulige lavenergi konformationer blev udvalgt til CXCR4 der havde forskellige orienteringer af TM3, TM5, og TM7. TM5 havde 3 forskellige konformationer: 2 havde forskellige orienteringer af resten Y219

5,58, som svarer til de 2 forskellige orienteringer af Y223

5,58 i rhodopsin og opsin krystalstrukturer [44], [45]. TM7 havde 2 forskellige spiralformede orienteringer, hvor positionen af ​​E288

7,39 var anderledes.

Docking af AMD3100 og Virtual ligand Screening

Den forudsagte bindingssted af mono- og bicyclam derivater af AMD3100 på CXCR4 blev valideret ved anvendelse af etablerede site-styret mutagenese oplysninger [19], [20]. Dette forudsagde bindingssted blev derefter brugt til at udføre virtuelle ligand screening (VLS) at identificere nye antagonist hits for CXCR4. National Cancer Institute (NCI) Open Chemical Repository Collection [46], som består af ca. 300.000 forbindelser, blev forespurgt ved hjælp af Maestro LigPrep modul (Schrödinger, San Diego, CA). Flere konformationer af kandidat-ligander blev derefter docket i det forudsagte bindingssted af CXCR4 hjælp Glide SP (Schrödinger) skalere van der Waals radier til 0,5 og delvis opladning cutoff til 0,15. De kombinerede coulombisk og van der Waals energi cutoffs blev derefter hævet til 100 kcal /mol. De ladede molekyler blev elimineret, og de neutrale molekyler, der blev anset bedre kandidater blev udvalgt til videre undersøgelse. De forankret ligand konformationer for neutrale molekyler blev derefter filtreres baseret på begravede overfladeareal, hvor ligander, der var 80% begravet og baseret på deres afstande til sure rester D171, D262, og E288 blev udvalgt. Disse 3 rester har vist sig at være vigtige i binding CXCR4-antagonister [19], [20].

Brug af Prime modul i Maestro, sidekæderne inden 5 en radius af liganden blev omfordelt. Efter sidekæden omplacering, bindingsenergierne (BE) af hvert kuperet konformation blev beregnet under anvendelse BE = PE (ligand i fast protein) – PE (ligand i solvatisering), hvor PE (ligand i fast protein) er den potentielle energi af liganden beregnet med proteinet atomer faste og PE (ligand i solvatisering) er den potentielle energi af liganden beregnet med overfladen Generaliseret Born kontinuum solvatisering metode [47]. De øverste 200 konformationer af hvert sæt blev derefter visuelt inspiceret for at maksimere gunstige receptor interaktioner. Vi derefter udvalgt de 50 bedste forbindelser fra hver CXCR4 receptorkonformation til efterfølgende test.

fluoresens mærket Konkurrencedygtige ligandbindingsanalyse

kompetitiv binding undersøgelser for at evaluere kandidat CXCR4-antagonister blev udført ved hjælp af chemokine CXCR4 receptor ligand bindingsassay kit ifølge producentens instruktioner (Tag-lite, Cisbio; Bedford, MA) [48], [49]. Kort fortalt blev HEK-293-celler inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer med det fluorescerende-mærket CXCL12 ligand med eller uden CXCR4-antagonister. Efter inkubation blev cellerne ophidset ved 620 nm og registreres på dual-emissioner (620 nm og 665 nm) ved hjælp PHERAstar (BMG LABTECH Inc .; Cary, NC). De relative forhold mellem CXCL12-CXCR4 binding blev opnået ved at dividere acceptorsignal (665 nm) som donoren signal (620 nm) og multiplicere denne værdi med 10.000.

CXCR4 Rekruttering af β-arrestin

Aktivering af CXCL12-CXCR4 akse resulterer i rekruttering af β-arrestin-2 til den carboxyterminale ende af CXCR4 [50]. For at verificere hæmning af β-arrestin-2 rekruttering af kandidat CXCR4-antagonister, brugte vi en kommerciel CXCR4 assay (Tango, Invitrogen, Carlsbad, CA) [51], [52]. Kort fortalt de manipulerede celler (3 x 10

4) blev podet i plader med 96 brønde og inkuberet natten over. DMSO eller antagonister blev tilsat til cellerne i 30 minutter. Derefter CXCL12 (60 nM) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 5 timer.