PLoS ONE: Prostata Cancer egenskaber i tilknytning til svar på Pre-Receptor Målretning af androgen Axis

Abstrakt

Baggrund

Faktorer, der påvirker differentierede reaktioner af prostata tumorer til androgen receptor (AR) akse- rettet terapeutiske midler er dårligt forstået, og der er behov prædiktorer for behandlingseffekt. Vi antager, at virkningen af ​​inhibering DHT ligand syntese ville associere med intratumoral androgen nøgletal indikerer relativ afhængighed af DHT-medieret vækst.

Metoder

Vi karakteriserede to androgen-sensitive prostatacancer xenograft modeller efter androgen suppression ved kastration i kombination med SRD5A hæmmer, dutasterid, samt et panel af kastrationsresistent metastaser opnået via hurtig obduktion.

Resultater

i LuCaP35 tumorer (intratumoral T : DHT-forholdet 2:01) dutasterid undertrykt DHT til 0,02 ng /g og langvarig overlevelse vs. kastration alene (337 vs.152 dage, HR 2.8, p = 0,0015). I LuCaP96 tumorer (T: DHT 10:01), blev overlevelse ikke forbedret på trods af lignende DHT reduktion (0,02 ng /g). LuCaP35 demonstrerede højere udtryk for steroid biosyntetiske enzymer opretholde DHT niveauer (5 gange højere SRD5A1, 41 gange højere, 99 gange højere RL-HSD, s 0,0001 for begge), rekonstituering af intratumoral DHT (til -30% af ubehandlet tumorer) og ca. 2 fold forøget ekspression af fuld længde AR. I modsætning hertil LuCaP96 demonstrerede højere niveauer af steroid catabolizing enzymer (6,9 gange højere AKR1C2, 3000 gange højere UGT2B15, p = 0,002 og p 0,0001 henholdsvis), vedvarende undertrykkelse af intratumoral DHT, og 6-8 gange induktion af fuld længde AR og liganden uafhængig V7 AR splejsningsvariant. Humane metastaser demonstrerede bioaktive androgen niveauer og AR fuld længde og AR splejsnings-variant-ekspression er konsistente med de observerede i xenotransplantater.

Konklusioner Salg

iboende forskelle i basal steroidogenese, samt variabel ekspression af fuld længde og splejse-variant AR, associeret med respons og modstand til at pre-receptor AR ligand undertrykkelse. Angivelse af steroidogene enzymer og AR isoformer kan tjene som potentielle biomarkører for følsomhed over for potente AR-akse hæmning og skal valideres i yderligere modeller

Henvisning:. Mostaghel EA, Morgan A, Zhang X, Marck BT, Xia J , Hunter-Merrill R, et al. (2014) Prostata Cancer Egenskaber Forbundet med svar på Pre-Receptor Målretning af androgen Axis. PLoS ONE 9 (10): e111545. doi: 10,1371 /journal.pone.0111545

Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: Februar 19, 2014 Accepteret: April 1, 2014; Udgivet: 30 oktober 2014

Copyright: © 2014 Mostaghel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Prostata Cancer Foundation Career Development Award (EAM) og Challenge Award (EAM, SP, RLV, AMM, RBM, PSN), Damon Runyon Genentech-Clinical Investigator Award C-40-08 (EAM), NIH give 1K23 CA122820-01 (EAM), DOD New Investigator Award W81XWH-10-1-0228 (EAM); GlaxoSmithKline (A.M. og P.S.N.); 1RC1 CA146849 (P.S.N.); PC093509 (P.S.N.); PA1 CA 85.859 (J.X., R. G., R.V., P.S.N.); NIH /NCI Pacific Northwest Prostata Cancer SPORE P50CA97186 (J.X., R. H., R. G., P.S.N., R.V.); og Institut for Veterans Affairs (B.T.M., S. P. og A.M.M.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: A.M.M., R.B.M. og P.S.N. har hørt og modtaget forskningsstøtte fra GlaxoSmithKline. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Selvom oprindeligt meget effektiv, androgen deprivation terapi for prostatakræft er ensartet præget af progression til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) over en periode på 18-36 måneder, med en deraf følgende median overlevelse på 1-2 år. [1] Mens androgen receptor (AR) -regulated genekspression oprindeligt undertrykkes, [2], [3] det transkriptionelle program reguleret af AR genaktiveres i CRPC via mekanismer, der opretholder både ligand og receptor medierede bidrag til AR signalering. [4] – [6] Disse omfatter resterende intratumorale androgener på niveauer er tilstrækkelige til at aktivere AR-programmet, [7] – [9] og øget AR aktivitet, enten via forstærkning eller overekspression (hvilket resulterer i forøget følsomhed over for lave ligand niveauer) [10 ], [11] eller gennem den nyligt beskrevne ekspression af trunkerede ligand-uafhængig AR splejsningsvarianter (AR

sv) mangler ligandbindingsdomænet (LBD). [12] – [17] Især undersøgelser af maksimal eller kombineret androgen blokade udnytte steroide eller ikke-steroide AR antagonister, der er målrettet AR LBD har kun vist en lille, om end statistisk signifikant forbedring i fem år overlevelsesraten (27,6 vs. 24,7 %; p = 0,005). [18] Den mest enkle forklaring på manglen på større virkningsfuldhed er den manglende evne af disse AR-antagonister til udkonkurrere resterende testosteron (T) og dihydrotestosteron (DHT) (som har AR bindingsaffiniteter, der langt overstiger de af syntetiske anti-androgener), [ ,,,0],19], eller en manglende evne til at effektivt at målrette AR

sv mangler LBD.

de kliniske reaktioner på nye potente AR-antagonister og nye steroid syntese-hæmmere, kombineret med tegn på intracrine androgen biosyntese i prostatakræft tyder på, at begreber af maksimal androgen blokade bør undersøges på ny og raffineret. En nylig undersøgelse designet til at målrette flere trin i androgen biosyntesen hos mænd svigtende ADT (ved hjælp hydrocortison, den CYP17A1 hæmmer ketoconazol, og steroid 5-alfa-reduktase hæmmer (SRD5A) dutasterid) producerede betydelige PSA fald i de fleste patienter og en median responsvarighed på 20 måneder. [20] Således kliniske virkning kan ikke kræve en AR antagonist i fastsættelsen af ​​mere effektiv undertrykkelse af ‘pre-receptor’ signalering gennem reduktion af AR-ligander. Vigtigt er det, at effektiviteten af ​​hæmmende AR aktivering i prostatakræft, enten gennem bedre pre-receptor tilgange eller dem direkte rettet mod AR, varierer betydeligt mellem patienter, og de faktorer, der bidrager til disse differentierede resultater er ukendt. For eksempel, forebyggelsesstudier hjælp SRD5A hæmmere faldt betydeligt hastigheden detektere lokaliserede prostatakræft, men dette indgreb var klart ikke effektive i forebyggelsen af ​​kræft progression eller påvisning i alle mennesker. [21], [22] Tilsvarende har de seneste kliniske forsøg med nye inhibitorer af CYP17A1 og AR i mænd med CRPC rapporteret væsentlige forskelle mellem patient i objektivt respons [23], [24].

I denne undersøgelse vi har forsøgt at bestemme tumorspecifikke karakteristika, der påvirker reaktionen af ​​prostatakræft til inhibering af præ-receptor AR signalering, anvendelse af androgen deprivation kombineret med det dobbelte SRD5A inhibitor dutasterid. T og DHT er biologisk aktive høj affinitet AR ligander. Imidlertid er mellem 3-10 gange højere koncentrationer af T kræves til at udøve samme AR-medierede transcriptionale virkninger af DHT. [25], [26] Således reducere DHT niveauer ved at inhibere omdannelse af T til DHT kan repræsentere et effektivt præ-receptor metode til at undertrykke den samlede størrelse af bioaktivt AR signalering. Vi antager, at virkningen af ​​SRD5A hæmning på tumorvækst ville forbinde med intra-tumorale androgen niveauer og /eller udtryk for steroid biosyntetiske enzymer, der tyder på en relativ afhængighed af DHT-medieret vækst. Faktorer, der bestemmer den relative respons prostata tumorer til at pre-receptor androgen suppression med midler, såsom SRD5A inhibitorer er ukendt, men kan tjene som indikatorer for effektivitet for disse stoffer i forebyggelse prostatakræft, eller som en del af ADT i fremskreden sygdom.

Materialer og Metoder

LuCaP Menneskelig prostatakræft Xenografter

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes Sundhedsstyrelsen. Alle forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Fred Hutchinson center Institutional Animal Care Brug Udvalg (file 1775). Alle operation blev udført under isofluoran anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. De LuCaP35 og LuCaP96 linjer er patient afledte xenotransplantater, der blev etableret som en del af University of Washington vævsbank som tidligere beskrevet [27], [28] og blev udvalgt til analyse som begge linjer demonstrerer kastration følsomme vækst i intakte hanmus. Kort beskrevet LuCaP35 blev afledt fra en lymfeknude metastase opnået fra en 66-årig kaukasisk mand med CRPC. LuCaP96 stammer fra transuretral resektion af en primær Gleason 9 prostatacarcinom opnået i en 61 år gammel kaukasisk Mandlige en måned forud for dokumentation af kastrationsresistent sygdom. I begge xenotransplantater AR exon DNA-sekvens er vildtype (data ikke vist).

Male CB-17 SCID-mus (Charles River Laboratories, Wilmington MA) blev implanteret subkutant med 30 mm

3 tumorstykker . Når tumorer nåede et gennemsnit på 300 mm

3, mus (LuCaP35 n = 62; LuCaP96 n = 65) blev kastreret (Cx) og randomiseret til behandling med køretøjet eller dutasterid (Dut) terapi over 8 uger. Dutasterid blev administreret (PEG monolaurat (Sigma 460.133) /1% Tween 80 (Sigma P4780)) ved oral sondeernæring 5 dage om ugen i et volumen på 200 pi. Tumorvolumen blev bestemt ved den følgende formel (lange og korte akse længder i mm): lang × (Short∧2) /2. Tumorer fra en delmængde af mus i hver gruppe blev høstet ved tidlige tidspunkter behandling (tumorstørrelse af ~500 mm

3; interval 7-21 dage). Når tumorer nåede ca. 750-1000 mg i størrelse, blev dyrene aflivet efter institutionel protokol og xenotransplantaterne høstet og flash frosset til bestemmelse af væv androgener og udvinding af total RNA. Det gennemsnitlige antal dage mus i Cx + DUT grupper havde været off dutasterid behandling på tidspunktet tumorer blev resektion blev 211 dage for LuCaP35, og 96 dage for LuCaP96. Dutasteride blev generøst tilvejebragt af GlaxoSmithKline.

Alle procedurer, der involverer mennesker blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Washington Medical Center, og alle emner underskrevet skriftligt informeret samtykke. Patienter med metastatisk prostatacancer undergik hurtige obduktioner under ledelse af University of Washington prostatakræft Donor Autopsy Program som beskrevet tidligere [9], [27]. Obduktioner blev udført inden for 4-10 timer efter døden. Prøver af alle grove metastatisk tumor sites blev opnået under sterile forhold og stedet og omfanget af ossøse og ikke-ossøse metastaser blev registreret. Frisk væv blev lynfrosset i flydende nitrogen umiddelbart efter høst og holdt ved -80 ° C. Salg

Steroid Målinger

Androgen niveauer i xenograft væv blev bestemt ved massespektrometri (MS) under anvendelse af metoder, vi har beskrevet. [29] Denne procedure resulterede i en nedre grænse for kvantificering af 1 pg per prøve for testosteron og DHT. Intra-assay variationskoefficienter genereret ved hjælp af humant serum til høje, midt og lav-range prøver var 3,5, 3,1 og 3,8% for testosteron og 6,3, 4,3 og 15,8% for DHT henholdsvis.

RNA Isolation, kvantitativ RT -PCR og immunhistokemi

prøver blev anvendt til RNA-isolering, cDNA-syntese og kvantitativ RT-PCR ved anvendelse af fremgangsmåder og primere vi tidligere har beskrevet. [9], [30] Immunohistokemisk farvning og scoring for AR og PSA blev udført som vi tidligere har beskrevet, [31] under anvendelse af et polyklonalt anti-PSA-antistof (DAKO, Inc.), et anti-AR antistof rettet ved N terminalen (klon F36.4.1, Biogenex), og et anti-AR antistof rettet ved C-terminalen (C-19, Santa Cruz). Negative kontrolprøver immunostains substituere præimmun immunoglobulin af samme art som den, hvori antistoffet blev genereret, viste ingen reaktionsproduktet.

Statistiske analyser

For at evaluere forskelle i tumorvolumen bane, vi først bestemmes ændre punkter i tumorvækstkurver anvendelse af t-tests for sekventielt sammenligne tumorvolumener hver to dage. Efter segmentering kurverne, vi anvendte en lineær mixed model til at kvantificere behandlingseffekten på tumorvækst for hver lineære periode ved regression log tumor volumen på dag af måling på behandlingsgruppe, og på et samspil mellem dag og behandling, mens der tegner sig for variation i oprindelige mængde tumor tværs mus. Progressionsfri overlevelse i kastration vs. kastration + dutasterid mus (defineret som tumorstørrelse 750 mm

3) blev bestemt via Kaplan Meier-analyse med sammenligning af kurver ved hjælp af Mantel-Haenszel logrank test. At forudsige den omtrentlige stikprøvestørrelse i hver behandlingsgruppe, der måtte være nødvendig for at påvise en statistisk signifikant effekt af kastration plus dutasterid versus kastration alene, vi udnyttet komplet tilfælde resampling for en række stikprøvestørrelser n = 10, 20, …, 200 over 500 bootstrap replikater. For hver prøve størrelse og bootstrap gentagelse, vi passer en Cox proportionel risiko model og indspillede den anslåede hazard ratio og p-værdi.

Til analyse af QRT-PCR-data, tærsklen gennemsnitlige cyklus (Ct) for hver gen blev normaliseret til ekspressionen af ​​housekeeping-genet RPL13A i den samme prøve (delta Ct). Den gennemsnitlige ekspression af RPL13A var 15,6 +/- 0,5 (gennemsnit +/- SD) og 14,1 +/- 0,8 i LuCaP35 og LuCap96 tumorer henholdsvis. Welch er to prøve t-tests blev anvendt til at sammenligne forskelle i androgen niveauer og forskelle i gennemsnitlig delta Ct s for hvert gen mellem behandlingsgrupperne uden korrektion for multiple test. P-værdier 0,05 blev anset for signifikante. Fold-change blev beregnet af delta-delta Ct-metoden (fold = 2

ΔΔCt). Den rå DCT s, ddCT s og fold ændringer præsenteres i de Supplerende data.

Resultater

Prostata kræft reagerer på androgen suppression demonstrere iboende forskelle i basale niveauer af intratumorale androgener og steroidogene genekspression

for at vurdere tumor egenskaber forbundet med respons og modstandsdygtighed over for AR sti-rettet terapi, vi først bestemmes intratumorale androgener og steroidogene genekspression i to prostata cancer patient afledte xenotransplantater, LuCaP35 og LuCaP96. Disse linjer udtrykker AR og PSA, (figur 1A) og reagere på kastration med tumorregression og forlængelse i progressionsfri overlevelse (PFS), men i sidste ende udvikle sig til kastrationsresistent vækst (p 0,0001 for begge, figur 1B, 1C). Især LuCaP35 og LuCaP96 tumorer reseceret fra mus med intakt gonadefunktion udstillet markante forskelle i basale niveauer af intratumorale androgener (Figur 1D): LuCaP96 tumorer har højere niveauer af T og lignende niveauer af DHT, og dermed en større andel af intratumoral T: DHT sammenlignet med LuCaP35 tumorer, på 10:01 og 02:01, henholdsvis (LuCaP96 T = 10,2 ± 6,5 ng /g; DHT = 0,9 ± 0,4 ng /g; LuCaP35 T = 2,6 ± 2,0 ng /g; DHT = 1,4 ± 0,8 ng /g, tabel S1)

(A) repræsentant FFPE prøver af hver xenograft blev farvet med hematoxylin og eosin (H 750 mm

3) i mus med LuCaP35 (B) eller LuCaP96 (C) xenografter. Intakte mandlige SCID-mus blev implanteret subkutant med 30 mm

3 stykker af de angivne xenotransplantater. Når tumorer nået ~300 mm

3, mus tilfældigt indskrevet i kohorter, der var enten venstre intakt (Ingen Cx) eller kastrerede (Cx). P-værdier for kurve sammenligninger blev dannet ved anvendelse af Mantel-Haenszel logrank test. (D) middelværdi og standardafvigelse af væv testosteron (T, sort bjælke) og DHT (grå søjle) niveauer målt ved massespektrometri i tumorer i den angivne xenograft (passeret i intakt mus). (E) Relativ ekspression af transkripter for de angivne steroidogene gener beregnedes under anvendelse af delta DCT-metoden (fold ændring = 2∧ddCt). Gener udtrykkes differentielt i LuCaP35 vs. LuCaP96 inden for en størrelsesorden er angivet inden for de grå linjer. Signifikante forskelle (ved Welch t-test; p 0,05), angives med sorte cirkler; hvide cirkler angiver gener, der ikke var signifikant forskellig mellem LuCaP35 og LuCaP96 (alle værdierne i supplerende data 2) .Upward trekanter angiver yderst differentielt udtrykte gener specifikt fører til øget T (AKR1C3, 40 gange) eller øgede DHT niveauer (SRD5A1, 5,0 gange ; 17BHSD10 4,8 fold; RLHSD, 99 gange). Nedadgående trekanter angiver yderst differentielt udtrykte gener specifikt medierende DHT katabolisme (AKR1C2, 7 fold, UGT2B15, 3000 fold).

For at identificere mekanismer, der bidrager til basale forskelle i intratumoral T og DHT-koncentrationer, vi evalueret tumor-specifikt udtryk for udskrifter, der koder de primære enzymer involveret i steroid syntese og nedbrydning (Figur S1). Mens mange steroidogene gener blev udtrykt i LuCaP35 inden for en størrelsesorden af ​​deres udtryk i LuCaP96 (figur 1E), flere forskelle i overensstemmelse med de forskellige tumor androgen profiler var til stede. Især genekspression i LuCaP35 var konsistent med androgen produktion og vedligeholdelse af DHT-niveauer, hvilket viser højere niveauer af steroid biosyntetiske gener såsom STAR (10 gange) og HSD3B1 (10 gange), højere ekspression af gener medierende DHT produktion (SRD5A1 , 5-fold; 17BHSD10 4,8-fold, RLHSD, 99 gange), og lavere ekspression af gener medierende DHT katabolisme (AKR1C2, 7 gange lavere, UGT2B17, 3000 gange lavere). I modsætning hertil genekspression i LuCaP96 var konsistent med produktion og vedligeholdelse af T, med signifikant højere niveauer af AKR1C3 (40-fold; konsistent med en stigning i T produktion fra androstendion), sammenholdt med lavere niveauer af SRD5A1 (det primære enzym er ansvarlig til konvertering af T til DHT i neoplastisk prostata væv) [32] og højere niveauer af DHT katabolisme enzymerne AKR1C2 og UGT2B17. (Cyklus tærskler og fold ændringer for alle gener i figur 1E er præsenteret i tabel S2). Da disse tumorer blev opformeret i genetisk identiske murine værter disse data identificere iboende tumor-specifikke variation i androgen metaboliske programmer kulminerede i markante intratumorale forskelle i AR ligand koncentrationer.

Pre-receptor-androgen vej undertrykkelse med kastration plus SRD5A hæmning demonstrerer en tumor-specifik effekt i at forsinke progression til CRPC

i betragtning af den 5-10 gange højere potens af DHT i at engagere og aktivere AR i forhold til T, [25], [26] strategier rettet mod reduktion DHT ved at hæmme metabolisme af T til DHT kan repræsentere et effektivt præ-receptor metode til at undertrykke den samlede størrelse af AR signalering. For at bestemme om tumor-specifikke forskelle i den basale forhold mellem intratumoral T: DHT ville påvirke klinisk respons på agenter målrettet omdannelse af T til DHT, vi behandlede kohorter af mus med LuCaP35 og LuCaP96 tumorer med kastration alene, eller kastration plus dual SRD5A inhibitor dutasterid. Intakte mandlige SCID mus blev subkutant implanteret med 30 mm

3 stykker af LuCaP35 eller LuCaP96 tumorer. Efter vækst til ~300 mm

3, blev musene kastreret og randomiseret til køretøjet eller dutasteride indgives ved oral sondeernæring i 8 uger.

Mean tumorvolumener hos LuCaP35 tumorer blev markant undertrykt af kombinationen af ​​kastration plus dutasteride vs. kastration alene (figur 2A). Tumor vækst fandt sted i tre forskellige stadier efter påbegyndelse af behandling: en kort periode med fortsat vækst (dag 0-14), en forlænget fase af tumorregression eller stabilitet (dag 14-75), og en afsluttende fase tumor fornyet vækst ( dage 75-200). For bedre at kvantificere effekten af ​​dutasterid, vi sammenlignet tumor volumen baner i kastration vs. kastration plus Dutasteride grupper ved hjælp af en lineær mixed model anvendes på hver post-behandling fase. Dutasteride plus kastration faldt betydeligt i procent stigning i tumor volumen pr dag versus kastration alene i den indledende “on-behandling ‘etape (fra 3,2% [95% CI 2,7-3,7] til 0,9% [95% CI 0,2-2,0]; p p 0,0001). Men efter behandlingsophør, demonstrerede, dutasterid-behandlede tumorer hurtigere procent fornyet vækst per dag (fra 1,1% [95% CI 0,9-1,3] til 2,3% [95% CI 1,8-2,9]; p 0,0001), hvilket tyder fortsat behandling ville være nødvendig for at opretholde terapeutisk effekt.

Mean tumor volumen i mus med LuCaP35 (A) og LuCaP96 (B) xenografter. Intakte mandlige SCID mus blev subkutant implanteret med 30 mm

3 stykker af den angivne xenograft. Når tumorer nået ~300mm

3 blev mus kastreret og tilfældigt indskrevet i kohorter behandlet med enten køretøj (Cx) eller dutasterid (Cx + Dut) i 8 uger (angivet med sort streg over x-aksen). Mean tumorvolumener er afbildet for hver behandlingsgruppe på de angivne dage efter tilmelding (Cx, sorte firkanter; Cx + DUT, hvide cirkler).

I modsætning hertil blev tumorvolumener hos LuCaP96 tumorer ikke undertrykt af tilsætning af dutasterid til kastration (figur 2B), uden ændring i hazard ratio (HR) for PFS (HR 0,9, p = 0,97; ikke vist). For at undersøge hvor meget ikke-signifikant forskel var på grund af antallet af dyr, vi bootstrapped fra de oprindelige data 500 gange og fandt, at selv med n = 170 mus pr behandlingsarm, en beskeden (HR 1.4), men statistisk signifikant forbedring i overlevelse blev observeret i kun 50% af iterationer, hvilket tyder sandsynligheden for detektering af en klinisk betydningsfuld behandlingseffekt i en større undersøgelse var lav. Samlet set disse observationer viser, at pre-receptor androgen vej undertrykkelse med kastration plus SRD5A hæmning kan forsinke progression til kastrationsresistent vækst. Men denne reaktion ikke er universel, men snarere forekommer at være tumortype-specifik, og er forbundet med de tumorer, der udviser et androgen metabolisk enzym profil rettet mod at holde intratumorale DHT niveauer såsom LuCaP35, snarere end en T-domineret tumor såsom LuCaP96.

tumor størrelse ved påbegyndelse af behandling påvirker den langsigtede svar på androgen suppression plus SRD5A hæmning

for yderligere at undersøge tumor egenskaber forbundet med respons til at pre-receptor AR vej hæmning, vi bestemt, om svar til behandling var relateret til tumor størrelse ved behandlingens påbegyndelse. Selv om undersøgelsen er designet til at begynde behandling på en tumor volumen på ~300 mm

3, logistik af dyreforsøg resulterede i en målelig forskel i tumorstørrelse ved studiets start. Vi vilkårligt grupperet tumorer i kohorter af 250 mm

3, 250-400 mm

3, og 400 mm

3 ved indskrivning og sammenlignet effekten af ​​kastration vs. kastration plus dutasterid inden for hver gruppe . Især den signifikant forbedring i median overlevelse bibragt af dutasterid i hele LuCaP35 kohorte (fra 152 til 337 dage, HR for progression 2,8 [95% CI 1,4-4,6], p = 0,0015, figur 3A), syntes overvejende skyldes en effekt på tumorer, der var mindst ( 250 mm

3) på tidspunktet for indskrivning (HR for progression 7,3 [95% CI 2,2 til 30], p 0,0015, vs. kastration alene, figur 3B). I modsætning hertil kombination af kastration plus 8 ugers dutasterid ikke statistisk effekt PFS i tumorer måler 250-400 mm

3 eller 400 mm

3 ved indskrivningen (ikke vist); men dette kan afspejle faldt magt forbundet med post-hoc sub-klassificering af grupperne

Kaplan-Meier-kurver over progressionsfri overlevelse. (defineret som tumorstørrelse 750 mm3) i alle LuCaP35 tumorer behandlet med kastration alene (Cx) vs. kastration + dutasterid (Cx + Dut) (A), og i tumorer indskrevet i behandling, når tumorer var 250 mm

3 (B). P-værdier for kurve sammenligninger blev dannet ved anvendelse af Mantel-Haenszel logrank test. Mean vækst tumor volumen kurver på de angivne dage efter indskrivning i LuCaP35 tumorer indskrevet i behandling, når tumorer var 250 mm

3 (C), mellem 250-400 mm

3 (D), og 400 mm

3 (E). Dutasteride behandling blev fortsat i 8 uger (angivet med sort streg over x-aksen) i kastration + dutasterid gruppe.

Inspektion af tumor volumen kurver foreslog en undertrykkende effekt af dutasterid blev opretholdt, selv efter seponering af terapi for tumorer 250 mm

3 ved indskrivning (figur 3C). I modsætning hertil blev tumorvækst undertrykt i forhold til kastration i tumorer 250 mm

3 ved indskrivning (figur 3D, 3E), men kun mens tumorer var under behandling. Efter ophør, tumorstørrelse i disse kohorter fanget op til tumorer behandlet med kastration alene, sådan at i sidste ende ingen forskel i overlevelse blev observeret. Den begyndende tumor volumen var ikke forbundet med overlevelse i LuCaP96 tumorer behandlet med dutasterid (ikke vist).

Systemisk androgen suppression plus SRD5A hæmning signifikant nedsætter tumor DHT niveauer i forhold til androgen suppression alene

For at bestemme hvorvidt forskellige indvirkning SRD5A inhibering på tumorvækst afspejlede en forskel i suppression af intratumorale androgener, målte vi T og DHT-niveauer i tumorer reseceret efter behandling. I begge LuCaP35 og LuCaP96 tumortyper, betyde tumor DHT niveauer målt ved 3-21 dage (angivet med to hoveder pile i figur 4A og 4B) var væsentligt lavere i kastration plus dutasterid vs kastration alene grupper, med værdier i LuCaP35 undertrykt fra 0,40 ± 0,56 ng /g til 0,02 ± 0,04, p = 0,007, og i LuCaP96 fra 0,10 ± 0,08 ng /g til 0,02 ± 0,01, p = 0,005 (opsummeret i tabel S1).

Tissue testosteron (T , sorte søjler) og DHT (grå søjler) niveauer blev målt ved massespektrometri i LuCaP35 (A) og LuCap96 (B) tumorer reseceret fra intakt mus (nr Cx) og fra mus behandlet med kastration alene (Cx) eller kastration + dutasteride (Cx + Dut) på tidlige tidspunkter (d3-21, mens du stadig i behandling, er angivet med dobbelt-ledes pile), eller ved kastrationsresistent genvækst (defineret som 750 mm

3). P-værdier beregnet fra Welch s to prøve t-test (p 0,05 blev anset for signifikant). Enkelte stjerner indikerer en statistisk signifikant forskel i DHT niveauer mellem Cx vs. Cx + Dut behandlede prøver på d3-21 behandling. Dobbelte stjerner angiver en signifikant forskel i DHT niveauer mellem Cx vs. Cx + Dut behandlede prøver, selv efter kastration-tilbagevendende genvækst. Ingen andre sammenligninger mellem Cx vs. Cx + DUT behandlede grupper var signifikante. Ekspression af fuld længde (FL) AR og AR variant 7 (ARV7) trunkerede splejsningsvariant blev målt i LuCaP35 (C) og LuCaP96 (D) på tidspunktet for tumorgenvækst til 750 mm

3. Transcript ekspression blev målt ved QRT-PCR og normaliseret til ekspression af housekeeping-genet RPL13A inden hver prøve til opnåelse tærskel delta cyklus (DCT). Den relative forskel i ekspression mellem de angivne behandlingsgrupper blev beregnet under anvendelse af delta DCT-metoden (fold ændring = 2∧ddCt). P-værdier beregnet ud fra Welch s to prøve t-test (p 0,05 blev anset for signifikant)

Det er interessant, mens T niveauer i LuCaP35 tumorer forblev undertrykt i enten behandlingsgruppe (figur 4A, sorte søjler), DHT. niveauer i LuCaP35 tumorer tilbagevendende efter kombineret behandling (gennemsnit 211 dage efter seponering af dutasterid) lignede tumorer tilbagevendende efter kastration alene (0,54 ± 0,46 ng /g og 0,61 ± 0,63 ng /g, henholdsvis; grå søjler). I modsætning hertil DHT niveauer i LuCaP 96 tumorer tilbagevendende efter kombineret behandling (gennemsnit 96 dage efter seponering af dutasterid) forblev undertrykt måneder efter ophør af dutasterid (figur 4B, 0,04 ± 0,04 ng /g i forhold til 0,53 ± 0,46 ng /g for kastration alene ), viste mens T-niveauer betydeligt rekonstituering efter enten kastration alene eller efter kombineret behandling (1,34 ± 0,89 ng /g og 0,79 ± 0,71 ng /g, henholdsvis, og tabel S1). Af note, halveringstid dutasterid hos mus er mindre end 2 dage, [33] til hinder for en residual effekt af SRD5A hæmning på steroid koncentrationer i 96 versus 35 tumorer ved resektion. Tumor androgen niveauer i LuCaP35 tumorer på tidspunktet for genvækst var ikke forbundet med tumorstørrelse på indskrivning (data ikke vist).

Tendensen til rekonstituering af DHT-niveauer i LuCaP35 og T i LuCaP96 er i overensstemmelse med den iboende variation i androgen metaboliske programmer favoriserer DHT vs. T identificeret i de ubehandlede tumorer (figur 1E). Yderligere er den relative ekspression af steroidogene gener i LuCaP35 vs. LuCaP96 tumorer tilbagevendende efter kastration vs. kastration plus dutasterid var meget lig de ekspressionsmønstre observeret i ubehandlede tumorer (Figur S2). Kollektivt, disse data viser, at dutasterid effektivt hæmmede DHT produktion i begge tumortyper, og at LuCaP35 tumorvækst er modtagelige for den styrkede førtiltrædelsesstrategi receptor undertrykkelse af DHT opnået med kombinationen af ​​kastration plus SRD5A hæmning, mens LuCaP96 ikke.

Systemisk androgen suppression plus SRD5A inhibering er forbundet med tumor typespecifikke forskelle i induktionen af ​​fuld længde AR og AR splejsningsvarianter

kastrationsresistent prostatatumorer ofte karakteriseret ved forøget ekspression af fuldlængde AR ( AR

FL), og som for nylig rapporteret, ved forøget ekspression af AR

sv der mangler LBD og dermed også giver konstitutiv ligand-uafhængig AR-aktivitet. Forskelle i AR

FL og AR

sv niveauer kan bidrage til variationen i tumorvækst responser efter præ-receptorligand suppression. Derfor evalueret vi ekspressionen af ​​AR

FL og den fremherskende AR

sv identificeret i humane CRPC prøver, AR

V7 (som koder for det samme protein som AR

V3) i LuCaP35 og LuCaP96 tumorer tilbagevendende efter ADT og dutasterid [13], [14], [16], [17], [34].

i forhold til tumorer reseceret fra intakte mus, LuCaP35 tumorer tilbagevendende efter kastration eller efter kastration plus dutasterid viste en 2,0-fold stigning i ekspression af AR

FL, og ingen stigning i AR

V7 (figur 4C, og tabel S3). I modsætning hertil mens LuCaP96 tumorer tilbagevendende efter kastration alene viste en lignende 1,9 gange forøget ekspression af AR

FL, de også udviste en betydelig vækst på 10 gange i ekspressionen af ​​AR

V7 (figur 4D).