PLoS ONE: Sox2 Er en Androgen receptor-Fortrængning gen, Fremmer kastrationsresistent prostatakræft

Abstrakt

På trods af fremskridt i detektion og terapi, kastrationsresistent prostatacancer fortsætter med at være et stort klinisk problem. Den afvigende aktivitet af stamceller veje, og deres regulering af Androgen receptor (AR), har potentialet til at give indsigt i nye mekanismer og veje til at forebygge og behandle avancerede, kastrere-resistente prostatakræft. Til dette formål undersøgte vi rollen som den embryonale stamceller regulator Sox2 [SRY (sex bestemmende region Y) -boks 2] i normale og maligne prostata-epitelceller. I den normale prostata, er Sox2 udtrykkes i en portion af basale epitelceller. Prostata tumorer var enten Sox2-positive eller Sox2-negative, med den procentdel af Sox2-positive tumorer stigende med Gleason Score og metastaser. I kastrationsresistent prostatacancer-cellelinie CWR-R1, blev endogen ekspression af Sox2 undertrykkes af AR signalering, og AR chromatin-IP viser, at AR binder enhancer element i det Sox2 promotoren. Ligeledes i normale prostata epitelceller og humane embryonale stamceller, øget AR signalering også nedsætter Sox2 udtryk. Resistens over for de anti-androgen MDV3100 resulterer i en markant stigning i Sox2 ekspression i løbet af tre prostatacancercellelinjer, og i kastration-sensitive LAPC-4 prostatacancer-cellelinie ektopisk ekspression af Sox2 var tilstrækkelige til at fremme kastrationsresistent tumordannelse. Tab af Sox2 ekspression i kastrationsresistent CWR-R1 prostatacancer-cellelinie inhiberede cellevækst. Opregulering af Sox2 var ikke forbundet med øget CD133 udtryk, men var forbundet med øget FGF5 (fibroblast vækstfaktor 5) udtryk. Disse data foreslår en model af forhøjet Sox2 udtryk grund af tab af AR-medierede repression under kastration, og deraf følgende kastration-modstand via mekanismer, der ikke indebærer induktion af kanoniske embryonale stamcellelinjer veje

Henvisning:. Kregel S, Kiriluk KJ , Rosen AM, Cai Y, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) Sox2 Er en Androgen receptor-Fortrængning gen, Fremmer kastrationsresistent prostatakræft. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10,1371 /journal.pone.0053701

Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA

Modtaget: 13 august, 2012; Accepteret: December 3, 2012; Udgivet: 11 Jan 2013

Copyright: © 2013 Kregel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering af dette arbejde blev generøst leveret af: The University of Chicago Institut for Kirurgi, afdeling for Urologi; University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC); en Pilot Award fra National Cancer Institute (NCI) P50 CA090386 SPORE i prostatakræft på Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center i Northwestern University og Cancer Research Center ved University of Chicago; en American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004); en Cancer Center Support Grant (P30 CA14599); Den Brinson Foundation; Alvin Baum Family Fund; og The University of Chicago Cancer Research Foundation Kvinders Board. S. Kregel understøttes af et HHMI: Med-i-Grad Fellowship (56006772) og en Cancer Biology Training Grant (T32-CA09594); E. Reyes er understøttet af en Immunologi Training Grant (AI07090-31). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Relapse af ondartet prostatakræft efter hormonbehandling er et væsentligt klinisk problem og er behov for nye strategier for at forebygge og behandle kastrationsresistent prostatakræft. Androgen afsavn terapi (ADT) har været grundpillen i prostatakræft behandling siden opdagelsen af ​​Charles Huggins og Clarence Hodges i 1941, at kastration væsentligt hjulpet patienter med fremskreden prostatacancer [1]. Der er imidlertid uundgåelig sygdomsprogression på grund af væksten af ​​kastrationsniveauer-resistente prostatacancerceller. Der er en række mekanismer til udvikling af kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), hvoraf de fleste centreret om Androgen receptor (AR) [2]. Således inhiberer intracellulær signalering AR inden prostatacancerceller har været et vigtigt mål for prostatakræft forskning, hvilket resulterer i en række kemiske inhibitorer er målrettet AR signalering som anvendes i [3] klinik. Desværre, mens alle disse inhibitorer producere en initial terapeutisk respons, dette er almindeligt efterfulgt af tilbagefald og sygdomsprogression.

De seneste opdagelser af somatiske celler omprogrammering hjælp definerede gener for at skabe inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) dybt demonstrerer at ekspressionen af ​​et par stamcelle gener er i stand til at fremprovokere omfattende forandringer i genekspression og celle adfærd, hvoraf mange er egenskaber ved maligne celler [4]. Faktisk er sådanne stamceller omprogrammering faktorer etablerede onkogener (c-myc og Klf4) eller dukker op som onkogener (Sox2, Oct4, og NANOG) i en række forskellige kræftformer [5], [6], [7]. De Sox2, Oct4, og NANOG transskriptionsfaktorer omfatter kernen embryonale stamceller transkriptionsfaktor maskiner og er væsentlige mod opretholdelse pluripotens og forebyggelse differentiering [8]. I undersøgelser med anvendelse af cellelinjer, disse gener ikke kun fremmer celledeling og overlevelse, men også forringer normale differentieringsprocesser; som begge er kendetegnende for tumorigenese og sygdomsprogression [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. I nogle tilfælde er ekspression af sådanne gener menes at markere sjældne cancer stamceller /initierende celler [12], [16]. Således er funktionen af ​​disse transkriptionsfaktorer hos voksne cancerceller menes at inhibere differentiering og fremme stamcelle pluripotens og overlevelse mekanismer magen til deres grundlæggende funktion i embryonale stamceller.

Sox2 [SRY (sex bestemmende region Y) -boks 2] er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for at opretholde overlevelse og pluripotens af udifferentierede embryonale stamceller, og har en ny rolle som en epigenetisk omprogrammering faktor og onkogen [5], [17], [18], [19] , [20]. I humane embryonale stamceller regulerer Sox2 udtryk for 1259 gener, hvoraf mange er co-reguleret med Oct4 og /eller Nanog [21]. I prostata, er Sox2 ekspression observeret i celler i det basale-epitelcelle lag af normale glandulære epithel [22], og i prostatatumorer [22], [23]. Udtrykket af Sox2 i prostata tumorer er blevet anset for at fremme en mere aggressiv tumor fænotype ved at fremme en “stamcelle som” tumor fænotype. Faktisk analyser gen-array ekspression viste, at et IPS celle-lignende signatur er til stede i en del af godartede og aggressive prostatatumorer, og denne signatur giver en dårligere prognose sygdom [24]. Vores gruppe har tidligere identificeret Sox2 som værende stærkt udtrykt i normale prostata-epitelceller sammenlignet med epitelceller fra sædblærer: et organ med lignende funktion og udviklingsmæssig oprindelse, som, i modsætning til prostata, er sjældent en lokalitet af tumorigenese [25]. Kollektivt disse data låner til den hypotese, at Sox2 funktioner i voksne normale og maligne epitelceller til at regulere ekspressionen af ​​mange af de samme genmål reguleres af Sox2 inden humane ES-celler og dermed fremme en mindre differentieret embryonale stamceller tumor fænotype; desuden Sox2 udtryk kunne være begrænset til sjældne stilk cancer /initierende celler, der giver et dårligere sygdom prognose. Alternativt Sox2 kunne have en helt anden funktion i voksne epitelceller. Disse data antyder også, at Sox2 kan fremme kastration-resistens ved at reducere afhængigheden af ​​prostatacancerceller på AR signalering for deres vækst og overlevelse.

Her viser vi, at Sox2 udtrykkes i de fleste normale prostata basale epitelceller og udtrykkes ensartet i en delmængde af prostatatumorer. Desuden er Sox2 udtrykkes i langt de fleste kastrationsresistent metastatiske prostata læsioner. I normale prostata-epitelceller, humane embryonale stamceller og kastrationsresistent prostatacancerceller, ligandaktivering af AR fremmer et fald i Sox2 ekspression, som er et resultat af direkte binding af AR til Sox2 cis-enhancer region. Ekspression af Sox2 forøges også inden prostatacancerceller som er resistente over for anti-androgen MDV3100. I kastration-sensitive prostatacancerceller, Sox2 ekspression er tilstrækkelige til at fremme kastrationsresistent tumordannelse. Udtrykket af Sox2 i prostata kræftceller, dog ikke resultere i ændringer i differentiering-specifikke PSA udtryk, en stigning i CD133-positive formodede stamceller kræft /initierende celler, eller udtryk for kendte humane embryonale stamceller (embryonale) associeret Sox2 målgener. Synes således Sox2 at fremme kastration modstand via mekanismer, der ikke indebærer re-ekspressionen af ​​embryonale stamceller Sox2 målgruppen gener eller stigninger i sjældne tumor stamceller /initierende cellepopulationer.

Materialer og Metoder

cellelinier og Materialer

R1881 og Actinomycin D blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og MDV3100 blev indkøbt fra Selleck Chemicals (Houston, TX) og opbevaret ved -20 i Ethanol . Alle human prostatacancer-cellelinier blev dyrket som tidligere beskrevet [26], [27]. Alle kulturer blev rutinemæssigt screenet for fravær af forurening med mycoplasma under anvendelse af ATCC Universal Mycoplasma Detection Kit (Manassas, VA). PC-3 blev VCAP, og NCCIT cellelinier købt fra ATCC, og DU145, LNCaP, LAPC-4, c4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2B, og E006AA cellelinier blev generøst leveret af Dr. John Isaacs på The Johns Hopkins University og tidligere har været karakteriseret [28]. Den humane embryonale stamceller linje WA01 (H1) blev erhvervet fra WiCell (Madison, WI) og dyrket under anvendelse af feeder-uafhængige protokol hjælp mTeSR1 medier (Stem Cell Technologies, Vancouver, B.C.). ES-celler blev anvendt inden for ti passager af optøning. Secerneret samlede PSA og Testosteron blev målt under anvendelse Roche Elecsys Total prostataspecifikt antigen (PSA) og testosteron (T) assays. Cellevækst blev målt ved anvendelse af Vybrant MTT celleproliferationsassay (Invitrogen /Molecular Probes, Eugene, OR).

Lentiviral Sox2, AR, og ctrl vektorer (Preceiver-Lv105) blev indkøbt fra GeneCopoeia (Rockville, MD ). Lentivirale tetracyclin transaktivator (LV-rtTA) og inducerbare lentiviral Sox2 vektor fra Hochedlinger lab blev købt via Addgene [29]. Når det er nødvendigt, Sox2 blev induceret ved anvendelse af 1 ug /ml Doxycyclin (Sigma). Knockdown af Sox2 ekspression under anvendelse shRNA ekspression blev opnået ved anvendelse af anti-human Sox2 shRNA gensæt, som består af 4 forskellige lentivirale targeting sekvenser mod Sox2 og en ikke-silencing kontrol [HSH017628-HIVH1 (Sox2) og CSHCTR001-HIVH1 (kontrol) vektorer indeholdende nogle GFP og puromycin-resistens komponenter; Genecopoeia]. Høj titer lentivirus blev lavet af co-transfektion med ViraPower Lentivrial emballagemix (Invitrogen, Grand Island, NY) og Lenti-X Concentrator. (Clontech, Mountain View, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger

Ikke-maligne epiteliale kulturer blev etableret fra friske humane prostatavæv erhvervet fra kirurgiske prøver som tidligere beskrevet [25]. Disse væv blev erhvervet efter en fremskyndet protokol godkendt af University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Vævsprøver blev forvaltet af University of Chicago humant væv Resource Center core facilitet; behovet for patienten samtykke blev givet afkald som erhvervede prøver blev de-identificeret. 4 mm biopsi slag af ikke-tumorvæv blev taget fra prostata og sædblære væv af patienter, der undergår radikal prostatektomi; halvdelen af ​​dette væv blev fikseret og analyseret af en patolog at bekræfte fravær af tumoren. Dissociation af prostatavæv og vækst af epitelceller er tidligere blevet beskrevet [30], [31], og de samme fremgangsmåder blev anvendt til at etablere matchet prostata (Prec) og sædblæren (SVEC) epitelcellekulturer. Kulturer blev dyrket ved hjælp Keratinoctye Serum-Free definerede medier suppleret med vækstfaktorer (GFS) (standard K-SFM, Invitrogen Life Technologies) og kan dyrkes op til 8 passager før bemærkelsesværdige cellulære aldring [32]. For vores eksperimenter blev alle kulturer analyseret ved eller før deres fjerde passage.

Western blotting, immunhistokemi og Immunofluorescens

helcellelysater indsamlet fra 100.000 celler blev anvendt per bane. Anvendte antistoffer var: anti-AR (N-20, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); anti-Beta Actin (Sigma-Aldrich); anti-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz); anti-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Nanog (D73G4 XP, Cell Signaling Technology); anti-Oct4 (C30A3, Cell Signaling Technology); og anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH, Cell Signaling Technology). Sekundær peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer var fra Cell Signaling Technologies, og HRP detekteres ved anvendelse SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Peirce /Thermo Scientific, Rockford, IL). Alternativt blev sekundære antistoffer fra Rockland (Gilbertsville, PA), der anvendes og data taget med et Licor Odyssey-system (Lincoln, NE)

Immunfarvning for Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, kanin monoklonalt). Blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) sektioner administreres enten af ​​University of Chicago humant væv Resource Core facilitet eller Northwestern University /University of Chicago Prostata SPORE programmet og deres program Specimen indkøb. Efter afparaffinering og rehydrering, blev væv behandlet med antigen hentning buffer (S1699 fra DAKO, Glostrup, Danmark) i en damper i 20 minutter. Anti-Sox2 antistof (1:25 fortynding) blev påført i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Efter TBS vask blev antigen-antistof-binding detekteret med Envision + systemet (DAKO, K4001 for muse primære antistoffer) og DAB + kromogen (DAKO, K3468). Vævssnit blev kortvarigt nedsænket i hæmatoxylin for modfarvning og var cover-gled. Væv blev analyseret af en uddannet Urogenitale patolog og scorede på procentdelen af ​​celler med positiv nukleare farvning (0 = ingen farvning; 1 = 1-10% positive celler, 2 = 11-50% positive celler, og 3 = 50% positive celler); samt intensiteten af ​​farvning (0 = ingen farvning; 1 = svag farvning, 2 = moderat farvning; 3 = stærk farvning). For billeder, blev dias digitaliseret ved hjælp af en Pannoramic Scan hele Slide Scanner (Cambridge Research og instrumentering, Hopkinton, MA) og billeder taget med Pannoramic Viewer softwareversion 1.14.50. (3DHistech, Budapest, Ungarn)

For immunofluorescens blev vævene deparaffineret, rehydreret, og behandlet med antigen hentning buffer. Antistof binding af Sox2 (D6D9, Cell Signaling Technology, Alexa-Fluor 555-konjugeret, 01:50 fortynding i TBST) og P63 (4A4, Santa Cruz Biotechnology, Alexa-Fluor 647 konjugeret, 01:50 fortynding i TBST) blev gennemført for 1 time ved stuetemperatur. Væv var counter-farvet med DAPI og monteres ved hjælp Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL). Fluorescerende billeder blev taget med et Leica TCS SP2 AOB’er Laser konfokalt.

Kvantitative Real Time PCR (Q-RT-PCR) og PCR Array Analyser

RNA blev oprenset ved hjælp af Qiagen RNeasy Mini kit med den valgfrie DNAse fordøjelse (Qiagen, Valencia, CA) og kvalitet testet under anvendelse af en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For standard Q-RT-PCR, blev ekstraheret RNA omdannes til cDNA ved revers transkription under anvendelse SuperScript® III revers transkriptase (Invitrogen). Niveauer af Sox2, PSA, FGF5 og GAPDH udskrift blev kvantificeret ved hjælp af

Strøm

SYBR® Green Master Mix (Invitrogen) ved hjælp af brugerdefinerede primere for Sox2 [5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ‘(fremad), 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC- 3 (tilbage)]; PSA [5’-TCATCCTGTCTCGGATTGTG-3 ‘(fremad), 5′-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3′ (tilbage)]; FGF5 [5’-AGTCAATGGATCCCACGAAGC-3 ‘(fremad), 5′-TGAACTTGGCAG TTGCATGGA-3′ (tilbage)]; og GAPDH [5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘(fremad), 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’ (tilbage)]. Standardkurver blev anvendt til at vurdere primer effektivitet og gennemsnitlige ændring i tærskelcyklus (ACt) værdier blev bestemt for hver af prøverne i forhold til endogene GAPDH niveauer og sammenlignet med vehikelkontrol (ΔΔCT). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer til at bestemme middelværdien standard fejl, og studerendes t-tests udført med normalisering for at styre for at få p-værdier.

For humane embryonale stamceller PCR Arrays, RT

2 First Strand kit (SA Biosciences; Valencia, CA) blev anvendt til revers transkribere RNA til cDNA. RT

2 qPCR Master Mix (SA Biosciences) og humane embryonale stamceller RT

2 Profiler ™ PCR Arrays (Cat # PAH’er-081, SA Biosciences) blev anvendt til at undersøge de udskrifter af 84 vigtige gener involveret i vedligeholdelse af pluripotens og selvfornyelse status af embryonale stamceller. Arrays blev udført med biologiske replikater i tre eksemplarer for hver tilstand. RT

2 Profiler ™ PCR Array Data Analysis software blev anvendt til at vurdere gennemsnitlige ændring i tærskel cyklus (ACt) værdier for hver af prøverne i forhold til køretøjets kontrol (ΔΔCT), fastlægge standard fejl og få p-værdier via studerendes t -test.

AR chromatin Immunoprecipication

kromatin-IP-protokoller blev tilpasset fra tidligere rapporterede metoder [33]. Cellerne blev dyrket til 70-90% konfluens og behandlet i 24 timer med 1 nM R1881. Celler blev fikseret med 1% formaldehyd ved stuetemperatur i 15 minutter; tværbindingen blev standset med 0,125 M glycin i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur og vasket med iskoldt PBS. Efter cellerne blev skrabet i PBS plus 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche Molecular Biochemicals; Penzberg, Tyskland), blev cellepellets opsamlet ved centrifugering og cellekerner ekstraheret ved centrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter. Cellekerner blev resuspenderet og vasket i micrococcal nuclease (Tris [pH 7,4] 10 mM, NaCI 15 mM, KCI 60 mM, spermin 0,15 mM, Spermidine 0,5 mM, CaCI2 1 mM) og derefter inkuberet med 10.000 E micrococcal nuclease for 20 minutter ved 37 ° C med forsigtig thermomixing. Kerner blev derefter opsamlet og resuspenderet i RIPA-PIC puffer [150 mM natriumchlorid, 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0 /1 × protease inhibitor cocktail (Roche)] og sonikeret (Fisher Scientific, Hampton, NH; model FB-120 Sonic Dismembrator). Sonikerede kromatin ekstrakter blev derefter præ-blokerede natten over ved 4 ° C ved inkubering med protein G-agaroseperler behandlet med normalt kanin IgG (Cell Signaling Technology), og kromatin-fragmenter blev immunpræcipiteret med specifikke antistoffer natten over ved 4 ° C. For en 1-ml fortyndet chromatin opløsning blev 50 ug af følgende antistoffer anvendes: Normal kanin IgG (Cell Signaling Technology) som en negativ kontrol; Histone H3 (Abcam, Cambridge, MA) som en positiv kontrol; og AR (N-20, Santa Cruz,) for de eksperimentelle betingelser. Perlerne blev derefter opsamlet og vasket i TSE I buffer [0,1% Triton X-100, 2 nM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH 8,1)], TSE II buffer [0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH 8,1)], Brown Buffer III [0,25 LiCI, 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), 1% deoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI (pH 8,1)], og to gange med TE-buffer [1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI (pH 8,1)]. De immunopræcipiterede kromatin-fragmenter blev elueret off af agaroseperler under anvendelse Brown Elution Buffer [1% SDS, 0,1 M NaHCO3, 1 mM DTT, 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche)] og inkuberet i 10 minutter ved 95 ° C under kraftig thermomixing. Elueret kromatin og inputs blev derefter inkuberet natten over ved 65 ° C med forsigtig thermomixing at vende tværbindinger. Prøver blev derefter behandlet med 2 ug RNaseA (Novagen, Darmstadt, Tyskland) ved 37 ° C i 15 minutter, derefter med 2 ug proteinase K ved 55 ° C i 30 minutter (Cell Signaling Technology). Endelig blev immunoprecipiated DNA-fragmenter udvundet ved phenol-chloroform (Sigma-Aldrich) ekstraktion og underkastet Q-RT-PCR anvendelse af kommercielt tilgængelige SimpleChIP ™ Menneskelig Sox2 cis-forstærker promoter primere (Cell Signaling Technology).

I Vivo tumordannelse

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af University of Chicago Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, protokol numre 72.066 og 72.231). Alle operation blev udført under Ketamin /Xylazin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

In vivo

tumordannelse af LAPC-4 og CWR-R1-celler blev udført via en subkutan podning af en million celler i 4-6 uger gamle mandlige athymiske nøgne mus (Harlan, Indianapolis, IN) under anvendelse af en 75% Matrigel og 25% HBSS opløsning (BD Biosciences). For at måle tumor tage i en kastreret vært, blev vært mus kirurgisk kastreret en uge før til celle podning. For at måle progression til kastration modstand, blev dyr værter kastreret når tumorer nåede 0,5 cm

3. At analysere cirkulerende total PSA fra tumoren implantatet og bekræfte testosteron udtømning hos kastrerede værter blev blod udtaget via hjertepunktur på forsøgsstadiet endepunkt.

Flowcytometri

Alle antistofinkubationer, vask, og flowcytometrisk analyse blev udført ved anvendelse iskold cellesortering puffer (1 x PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 2 mmol /l EDTA) i minimal lys ved hjælp tidligere rapporterede protokoller [26], [31]. Celler blev farvet hos Live /Dead Fixable Green Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Efter vask blev cellerne inkuberet med FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec, Köln, Tyskland, fortyndet 1:20 i 10 minutter), og derefter mærket med CD133 /2 (293C3) APC-konjugeret humant monoklonalt antistof (Miltenyi Biotec) eller isotype kontrol muse IgG2b-APC (Miltenyi Biotec) ved en 1:10 fortynding i 30-min. Cellerne blev derefter vasket og fikseret i 15 minutter med 3,2% Ultra Pure EM Grade Formaldehyd (Polysciences, Inc .; Warrington, PA). Efter fiksering blev cellerne vasket og farvet med FXCycle Violet (Invitrogen, 1:1000 fortynding). Analyse blev udført på en Becton Dickinson LSR II, og mindst 250.000 tællinger blev erhvervet for hver eksperimentel betingelse. FACSDiVa Software blev anvendt til dataopsamling, og FlowJo software blev anvendt til analyse.

Floating Sfæroide Kultur Assay

In vitro

flydende sfæroider blev dyrket fra 1 × 10

5 LAPC-4 og LNCaP celler transduceret med enten lentivirale Sox og GFP ConFtrol vektorer [preceiver-Lv105; GeneCopoeia (Rockville, MD)]. Celler blev dyrket på Ultra-Low vedhæftede 25 cm

2 celledyrkningskolber (Corning, Corning, NY) og dyrkes i suspension i 5 dage. Sfæroider dannet efter 5 dage blev overført til 10 cm

2 retter (Corning, Corning, NY) i 24 timer for at tillade binding. Sfæroider blev derefter farvet med krystalviolet-opløsning (Sigma-Aldrich), skyllet og talt. Sphere dannelse blev udført tre gange.

Statistiske Analyser

I alle tilfælde data gengives ved hjælp af flere biologiske og tekniske gentagelser. Dataene blev analyseret ved hjælp SigmaPlot 11.0 software ved hjælp af en enkeltbillet ANOVA med Pair-kloge Flere Sammenligning Procedurer (Holm-Sidak metode).

Resultater

Sox2 udtrykkes i Normal Prostata Basal epitelceller og i en delmængde af prostata tumorer

for at evaluere forekomsten og mønstret af Sox2 proteinekspression i prostata, vi gennemførte en immunhistokemisk evaluering af en række humane prostata væv og tumorer. Disse analyser viser, at Sox2 ekspression i normale og godartet hyperplastiske (BPH) prostatavæv er begrænset til basale epitelceller (figur 1A). Analyser af prostatatumorer viser, at Sox2 er enten udtrykkes ensartet eller ensartet fraværende (figur 1A). Størstedelen (12 af 14) af kastrationsresistent metastaser analyserede også udtrykke Sox2 (figur 1B og C). Procentdelen af ​​Sox2-positive tumorer stiger med Gleason Score, med en lille delmængde af gunstige-prognose Gleason Score 6 tumorer og størstedelen af ​​dårlig prognose Gleason Score 10 og kastrationsresistent metastaser positive (figur 1C). Interessant analyser af præmaligne prostata intra-neoplasi (PIN) læsioner dokumenteret en blandet basal og luminal epitelcelle-farvning (figur 1C). Disse tumor data er i overensstemmelse med den observation foretaget af Jia et al. anvendelse af en anden Sox2 antistof viser at ekspression korrelerer med Gleason Grade [23]. Vores data kontrast til denne rapport, men som vi observerer stærk basal-epithelial-farvning i ikke-maligne væv, samt ensartet stærk Sox2 ekspression i en lille procentdel af tumorer, snarere end en gradueret stigning i farvningsintensitet [23]. Disse data dokumenterer, at Sox2 ensartet udtryk i en delmængde af prostata tumorer, og indikerer, at Sox2 udtryk giver en unik tumor sub-type, der ikke synes at være begrænset til sjældne kræft indlede /stammer-lignende celler i prostata tumorer.

A) immunhistokemisk farvning af Sox2 demonstrerer repræsentativ nukleare basal epitelial farvning (mørkerød) i normale kirtler (Region 3) #, og to forskellige tumor regioner, der er enten ensartet Sox2-positve (Region # 2) eller Sox2-negative ( Region # 1). B) Ekspression af Sox2 i repræsentative kastrationsresistent metastatiske læsioner. Feltet i 8 ganges forstørrelse svarer til regionen vist på 40 × billede. C) Procentdel og distribution af Sox2 udtryk blandt prostata sygdomstilstande. I normal, BPH, og HGPIN væv, er Sox2 udtrykt i basal-epiteliale celler (Grå søjler). Positiv ekspression defineres med mere end 50% af cancercellerne positive med en relativ intensitet på 1 eller mere på en skala fra 0-3. I kræft væv og metastaser, er Sox2 enten ensartet udtryk eller fraværende, og procentdelen af ​​Sox2-positive tumorer stiger med Gleason score (sorte søjler). BPH: benign prostatahyperplasi; HGPIN: high-grade prostata intraepitelial neoplasi; GS: Gleason Score (N = antal individuelle prøver patient analyseret)

Sox2 er Co-Udtrykt i en del af P63-Positive Basal epitelceller

udtryk for Sox2 i. AR-negative basale-epitel celler indebærer, at Sox2 kan fungere til at fremme overlevelsen af ​​prostata stilk og basale transiente-amplifikation celler, eller at opretholde dem i en udifferentieret tilstand. I den normale prostata, den parakrin interaktion mellem stromale og epiteliale celler er androgenafhængig, hvor AR-positive stromale celler producerer en række vækstfaktorer, kollektivt betegnet “andromedins”, som signalerer til nærliggende epitelceller til at fremme proliferationen af ​​AR-negative, P63-positive basale epitelceller og overlevelsen af ​​AR-positive /prostataspecifikt antigen (PSA) -positive luminale epitelceller [34]. For at bestemme hvor stor en del af basal-epitelial celler Sox2-positive, vi gennemførte co-immunfluorescensfarvning af Sox2 og P63. Disse data viser, at 75% af prostata basal epitelceller placeret i prostata yderzone udtrykker både Sox2 og P63, mens de resterende 25% af cellerne udtrykker P63 men ikke Sox2 (figur 2A). Denne iagttagelse indebærer, at Sox2 ekspression afgrænser to potentielle populationer af basale epitelceller; disse celler kan også have unikke fænotypiske karakteristika og kan stamme særskilte tumorer [35].

A) Immunfluorescerende co-farvning af Sox2 (grøn) med den basale-specifikke markør P63 (rød), som viser, at 75% af normale basal-epitel celler er positive for både Sox2 og P63 (gul), mens de resterende 25% er Sox2-negative (rød). DAPI farvning fremhæver kerner (repræsentative billeder af normal prostata epitel erhvervet fra tre forskellige individuelle prøver patient). B) Western blotting af en række patient-afledt Prostata (Prec) og sædblæren (SVEC) epitelial sælge (Prec) -kulturer viser, at en del af disse kulturer udtrykker påviselige Sox2, mens andre Prec og alle SVEC kulturer ikke. C) Immuncytokemisk farvning af Sox2 viser ensartet nukleare Sox2 udtryk i Sox2-positive PrECs og manglende Sox2-positive celler i Sox2-negative PrECs (repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg).

Baseret på dette, vi etableret en række ikke-malign prostata epitelial celle (Prec) -kulturer fra frisk dissocierede prostatavæv og analyseret dem for Sox2 ekspression. Sådanne Prec kulturer udtrykker ikke påvises indhold af AR protein, da de består af det meste p63-positive forbigående-forstærke celler, sammen med mindre bestande af CD133-positive stamceller, PSCA-positive mellemliggende celler og Chromogranin A-positive neuroendokrine celler [ ,,,0],26], [31]. Som en ekstra kontrol, vi isoleret patient-matchede sædblæren epitelcelle (SVEC) kulturer ved hjælp af de samme metoder. Western blotting analyser dokumenteret, at Prec kulturer var enten Sox2-positive eller Sox2-negativ, og matchende SVEC kulturer var konsekvent negative (figur 2B) [25]. De heterogene cellepopulationer inden for sådanne Prec kulturer foreslog, at Sox2 kan være meget stærkt udtrykt i en lille delmængde af celler. Immuncytokemiske analyser af Sox2 udtryk, dog, dokumenter, at størstedelen af ​​celler i Sox2-positive Prec kulturer udtrykker Sox2; mens der er få, om nogen, påviselige Sox2-udtrykkende celler i Sox2-negative Prec kulturer (figur 2C). Således i ikke-maligne Prec kulturer, Sox2 ekspression er ikke begrænset til en unik cellepopulation såsom CD133-positive prostatastamceller.

Øget Androgen receptor (AR) Signaling Fald Sox2 Ekspression i Normal Prostate epithelceller ( PrECs) og humane embryonale stamceller (hESCs)

Det er tidligere blevet påvist eksperimentelt, at aktivering af AR signalering ved androgen bindende i prostata epitelceller inducerer deres vækst anholdelse og eventuel terminal differentiering i sekretoriske-luminale celler [36] [37], [38]. Ekspressionen af ​​Sox2 i basale epitelceller og manglen på Sox2 ekspression i ikke-malign AR-positive luminale epitelceller foreslog, at AR kan undertrykke Sox2 ekspression. Brug af Sox2-positive Prec kulturer, blev reaktion Sox2 udtryk til eksogen ekspression og ligand induktion af vildtype AR evalueret. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.