PLoS ONE: Når Genome Plays Dice: Omgåelse af Spindel Assembly Checkpoint og Near-Tilfældig kromosom Segregation i multipolær Cancer Cell mitoser

Abstrakt

Baggrund

Normalt celledeling koordineres af en bipolær mitosespindelen, sikrer symmetrisk segregering af kromosomer. Cancerceller, dog lejlighedsvis opdele i tre eller flere retninger. Sådanne multipolære mitose er blevet foreslået til at generere den genetiske mangfoldighed og dermed bidrage til klonal evolution. Imidlertid har dette begreb blevet lidt valideret eksperimentelt.

vigtigste resultater

Kromosom adskillelse og DNA-indholdet i datterceller fra multipolære mitose blev vurderet ved multifoton cross sektionering og fluorescens in situ hybridisering i cancerceller og ikke neoplastiske transformerede celler. DNA fordeling som følge af multipolær celledeling viste sig at være meget varierende, med hyppige nullisomies i datterceller. Time-lapse billeddannelse af H2B /GFP-mærkede multipolære mitose afslørede, at tiden fra indledningen af ​​metafase til begyndelsen af ​​anafase blev forlænget, og at metafase pladerne ofte skiftede polaritet flere gange før metafase-anafase overgang. Den multipolær metafase-anafase overgang var ledsaget af en normal reduktion af cellulær cyclin B-niveauer, men forekom typisk før afslutningen af ​​den normale separase aktivitet cyklus. Centromerregionen AURKB og MAD2 foci blev observeret hyppigt at forblive på centromerer af multipolære ana-telofase kromosomer, hvilket indikerer, at multipolære mitose kunne omgå spindel forsamling checkpoint med nogle søsterchromatider resterende usorteret efter anafase. Derfor scorer fordelingen af ​​de enkelte kromosomer i multipolære datter kerner afslørede en høj frekvens af nondisjunction begivenheder, hvilket resulterer i en næsten binomial tildeling af søster kromatider til datterceller.

Konklusion

Evnen af multipolære mitoser at omgå spindelkonstruktion checkpoint system, typisk resulterer i en næsten tilfældig fordeling af kromosomer til datterceller. Spindel multipolaritet kunne således være en yderst effektiv generator af genetisk forskellige mindretal kloner i transformerede cellepopulationer

Henvisning:. Gisselsson D, Håkanson U, Stoller P, Marti D, Jin Y, Rosengren AH, et al. (2008) Når Genome Plays Dice: Omgåelse af Spindel Assembly Checkpoint og Near-Tilfældig kromosom Segregation i multipolær kræftcelle Mitoser. PLoS ONE 3 (4): e1871. doi: 10,1371 /journal.pone.0001871

Redaktør: Cayetano Gonzalez, Institut for Forskning i biomedicin, Spanien

Modtaget: 22 oktober, 2007; Accepteret: 22 februar 2008; Udgivet: 2 April, 2008

Copyright: © 2008 Gisselsson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den svenske Børnecancerfonden, den svenske Cancer Society, det svenske Forskningsråd, den svenske Medicinsk Selskab, den schweiziske National Science Foundation (Grant 3152A0-100431), de Lunds Universitetshospital Donation fondene, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, medicinske Fakultet Lunds Universitet, Crafoord Foundation, Erik-Philip Sörensen Foundation, Lundgren Foundation, og grønsværen Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i udførelsen af ​​undersøgelsen, eller i indsamling, analyse, fortolkning af dataene, eller i forberedelsen, anmeldelser, eller godkendelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Introduktion

i normale celler, mitotisk celledeling sker typisk i en bipolær måde, hvilket resulterer i to datterceller med identiske nukleare genomer. Denne begrænsede polaritet er baseret på stram styring af centrosom cyklussen, således at ikke mere end to centrosomer er samtidigt aktive under mitose [1], [2]. Men i cancerceller, kan et for stort antal centrosomer give anledning til overskydende spindel poler, kan orkestrerer en flerpolet mitose (MM), hvor kromosomet komplement trækkes i tre eller flere retninger på anafase [3], [4]. Siden de første observationer af MM i karcinomer ved HANSEMANN i 1890 [5] multipolære spindler og centrosomal abnormiteter er blevet rapporteret i de mest almindelige kræftformer [6] – [8]. Nogle undersøgelser har også vist, at MM kan være en stærk markør for negative prognose i tumor sygdom [9] – [11]. Endvidere har forstyrrelser i centrosom antal og struktur blevet forbundet med forstyrret funktion af adskillige cellecyklus signalveje, såsom inaktivering af TP53-, RB1- [12], [13], BRCA1- [14], [15], BRCA2 – [16], og CDKN1A-proteiner [17], samt AURKA overekspression [18]. Gennem CCNE og PLK4 har centrosomal forstyrrelser også blevet forbundet med udsættelse for virale kræftfremkaldende stoffer, især høj risiko papillomvirus [19], [20].

I betragtning af den omfattende foreliggende oplysninger om de molekylære forandringer forårsager spindel multipolaritet i kræftceller, har overraskende små eksperimentelle data blevet præsenteret på konsekvenserne af spindel multipolaritet i transformerede humane celler. Tidligere undersøgelser har været begrænset til

in vitro

modeller for ikke-neoplastiske celler fra vole, mink, okse, og Rhesusabe hvor polyploidized celler skred gennem multipolær celledeling [21] – [24]. I disse modeller, søster kromatider typisk adskilt gennem MM haploide sæt, hvilket resulterer i euploid kromosom tallene i datterceller. Denne euploid adskillelse mønster har dannet grundlag for drøftelser om den rolle, MM i humane tumorer [25]. Vi viser nu, at kromosom segregering i MM i humane aneuploide transformerede celler sjældent, om nogensinde, fører til segregering i forholdene forventes af principperne for euploid adskillelse. Snarere en kombination af en samlet asymmetrisk DNA distribution og omgåelse af spindlen samling checkpoint resulterer i en næsten tilfældig omrokering af kromosomet supplement.

Resultater

Eksperimentel setup

principperne i euploid adskillelse modellen indebærer, at der findes en ordning, som strengt regulerer bevægelse af en haploid sæt kromosomer i datterceller ved mitose [24]. Ekstrapolation af denne teori til de typisk aneuploide karyotyper observeret i cancerceller betyder, at hvert sæt af homologe kromosomer segregerer som hvis det samlede kromosom nummer ville kunne opdele i distinkte heltalsbit nøgletal. Således vil mindst én kopi af hver kromosom være til stede i hver datter celle, med undtagelse af kønskromosomerne. I en celledeling med to kopier af et bestemt kromosom (disomic) dividere i tre retninger (trepolet), ville dette udlede en segregationsmønster hvorigennem to datterceller kromosomer adskilt til en af ​​datterceller, mens en datter kromosom adskilt til hver af de andre to datterceller (

dvs.

en 2-1-1 adskillelse). De andre mulige disomic /tripolær adskillelse mønstre (4-0-0, 3-1-0, og 2-2-0) ville alle resultat i mindst én nullisomic datter celle og vil således ikke være i overensstemmelse med adskillelse i haploide sæt.

for at teste, om adskillelse mønstre af individuelle kromosomer på humane multipolære celledelinger tilpasset til principperne for euploid adskillelse, vi brugte to velundersøgte kræft cellelinjer, hvor mitotisk multipolaritet er blevet forbundet med kromosomal ustabilitet (CIN),

dvs.

WiT49 fra en anaplastisk Wilms tumor med 7% MM [10], [26] og SW480 fra en kolorektal carcinom med 4% MM [27], [28]. For at sammenligne cancercellelinier til ikke neoplastiske immortaliserede celler, vi omfattede også adenovirus-transformerede humane embryonale cellelinie HEK293 med en kompleks karyotype og 1% MM [29]. I disse cellelinjer, cross-mærkning af DNA og spindel poler af beta-tubulin antistoffer viste, at det store flertal af multipolære celledelinger var enten trepolet eller tetrapolar, mens 10% af MM havde en højere polaritet nummer (Figur 1A-D ). I hver cellelinje, de centromerer i to kromosomer, der var viste lidt intercellulær strukturel heterogenitet [10], [28] blev mærket ved fluorescens in situ hybridisering (FISH): kromosomer 12 og 17 i WiT49, X og 18 i SW480 og 3 og 4 i HEK293 hhv. Dette valg blev gjort for at minimere confounding fra anafase bridging og andre mitotiske abnormiteter primært fører til abnormiteter i kromosom struktur. Vi derefter screenet for fordelingen af ​​disse kromosomer på anafase i bipolar mitose og MM.

Et kromosom 12 specifikke alfa-satellit-sonde (grøn) kombineret med immunofluorescens for beta tubulin (rød) og DNA-kontrastfarvning af DAPI ( blå) viser tetrasomic /bipolare celledeling ved metafase /tidlig anafase (a) og sen anafase (B) og en disomic /trepolet celledeling ved metafase (C) og telofase (D); segregationsmønsteret er 4-4 i (B) og 3-1-0 i (D). Time-lapse mikroskopi af

H2B /GFP

transficerede HEK293 celler viser rækkefølge af en tripolær metafase konfiguration (E; poler betegnet ac) gennem to på hinanden følgende kromosom segregation begivenheder til fire datter kerner og fra en tetrapolar metafase konfiguration (F) gennem en tripolær ana-telofase til tre datter kerner vist ved tredimensionel rekonstruktion af en konfokal billedstak ved T = 40 min (T, tid fra første billede).

Den euploid adskillelse model kan være modbevist

i alt 15 490, 9 000, og 36 667 mitose blev screenet i SW480, WiT49, og HEK293 henholdsvis og ana-telofase celler blev udvalgt til analyse af kromosom adskillelse (tabel 1). For at teste nøjagtigheden af ​​sonden system, vi først screenet morfologisk normale bipolære ana-telophases, hvor 01:01 segregation kunne forventes. Alle disse celledelinger (2 323, 1 350 og 5 500 celler i WiT49, SW480 og HEK293) viste et lige antal kromosomer i de to datterceller poler (Figur 1B). Sampling af multipolære anaphases blev derefter udført, herunder disomic celler i SW480 og disomic samt tetrasomic celler i WiT49 og HEK293. Årsagen til dette valg var, at i SW480 10% af celler viste et kopiantal anderledes end 2, men i WiT49 og HEK293 ca. 20% af cellerne var tetrasomic for de valgte kromosomer. I alt 158, 54, og 49 analyserede multipolære anafase celler i WiT49, SW480, og HEK293 henholdsvis blev scoret. Med få undtagelser resulterede de multipolære celledelinger i en ulige segregering af kromosomer blandt datterceller (Figur 1D). Sammenfatter data til disomic /tripolær divisioner, 2-1-1 adskillelse var mest almindelige (43%), efterfulgt af 3-1-0 (28%), 2-2-0 (23%), og 4-0- 0 (6%) segregations. Blandt tetrasomic /trepolet celledelinger, den 3-3-2 adskillelse var den mest hyppige (22%), efterfulgt af 4-3-1 (20%), og 4-2-2 (18%), mens de øvrige sammensætninger havde frekvenser 10%. Endelig for disomic /tetrapolar konfigurationer, den 2-1-1-0 konfiguration (42%) var den mest almindelige, mens der i de tetrasomic /tetrapolar celler den 4-2-2-0, 3-2-2-1 og 2-2-2-2 konfigurationer (hver på 19%) var de mest almindelige.

således i modsætning til normal bipolar mitose, MM resulterede typisk i et ulige kopi-nummer studerede kromosomer i datterceller. Desuden har de fleste multipolære Mitoser førte til en betydelig del af celler med nullisomy i mindst én af de datterceller: 55% (78/143) af disomic /trepolet, 31% (26/85) af tetrasomic /trepolet, 92% ( 11/12) af disomic /tetrapolar, og 48% (10/21) af tetrasomic /tetrapolar mitoser hhv. Dette afviser hypotesen om, at multipolære celledelinger i transformerede celledelinger kan modelleres efter euploid kromosom adskillelse mønstre findes i ikke-transformerede celler [25].

DNA-indholdet i multipolære datterceller er meget varierende

for at bestemme den samlede fordeling af DNA i multipolære ANA-telophases blev WiT49 udvalgt til videre analyse, fordi denne cellelinie indeholdt den højeste frekvens af MM. Tidligere undersøgelser af DNA-indhold i tumorcellelinier mitose er blevet udført af Feulgen farvning i en todimensional indstilling [30]. Men MM ofte har en større chromatin volumen end normale Mitoser med en diameter på op til 100 um og en kompleks tredimensionel struktur [31]. At være i stand til at kvantificere den relative DNA-indhold i datter ana-telophases under disse betingelser, vi anvendte fluorescens kvantificering af DAPI-mærket DNA ved multifoton cross sektionering mikroskopi. Denne teknik tilvejebringer høj rumlig opløsning billeddannelse i et tredimensionelt indstilling på grund af den ulineære signal generation på laserfokus [32]. Den lokaliserede excitation reducerer ude af fokus fluorescens og foto-blegning. At objektivere analysen yderligere blev en række forskellige tærskler for DAPI-intensitet valgt, strækker sig fra nær støjbunden. For hver tærskelværdi, blev forholdet mellem mængden af ​​fluorescens i hver region med den i det første område beregnet. En gennemsnitlig relativ DNA-indhold for hver ana-telofase pole blev derefter beregnet ved at tage gennemsnittet af resultaterne for alle tærskelværdier (figur 2A-C).

Rekonstrueret tredimensionale multifoton pasning sektionering billeder af en bipolar (A) og en multipolær (B) telofase celle i WiT49 viser asymmetrisk DNA-fordeling i sidstnævnte konfiguration. Kvantificering af den relative mængde af kromatin (C) i bipolar (sort), tripolær (rød) og tetrapolar (grøn) ana-telofase celler bekræfter en bred variation i DNA-indholdet af multipolære datterceller (X-aksen viser rangorden efter DNA tilfreds). Måling af andelen af ​​BrdU-positive bipolar (blå) og multipolær (rød) mitotiske celler på forskellige tidspunkter efter mærkning (D) angiver forsinket udgang fra mitose for multipolære celledelinger i WiT49 og HEK293 (fejl søjler indikerer standardafvigelse). Time lapse billeddannelse af H2B /GFP HEK293 celler viser en forlænget metafase-anafase interval, og en reduceret anafase-interfase interval i multipolær forhold til bipolare celledelinger (E); enkelt og dobbelt stjerner angiver signifikans på 0,05 og 0,01 niveauer henholdsvis (Mann-Whitney U-test). One-per-minut tid bortfalder billeddannelse (F) på 12 multipolære Mitoser, der hver svarer til en strøm af identisk farvede pile, viser hyppige polaritet transformationer (I = interfase, PM = prometafasen, M2 = bipolar metafase, M3 = tripolær metafase, M4 = tetrapolar metafase, A = anafase, T = telofase). Kvantificering af den samlede intensitet i arbitrære fluorescensenheder forhold til centrosomal gamma tubulin fluorescens (G) viser en stærk reduktion af separase niveauer i telofase sammenlignet med metafase i bipolar, men ikke i multipolære celledelinger (fejl søjler viser standardafvigelse). Diplochromosomes (H, pile) i G-banded delvis metafase spreder sig fra WiT49.

Metoden blev først testet på 20 methanol-fikseret morfologisk normale datter ana-telophases fra bipolære celledelinger. I disse er det relative DNA-indhold af de enkelte poler i forhold til den samlede mængde af kromosomal DNA i hver celledeling var ca. 50%, svarende godt til den forventede 01:01 segregation. Vi derefter evalueres datter poler i tripolær og tetrapolar ana-telophases hhv. Her det relative DNA-indhold af datter ANA-telophases viste omfattende variabilitet fra 18-46% af det totale cellulære DNA-indhold i trepolet divisioner og fra 16-34% i tetrapolar divisioner. Den omstændighed, at DNA’et ikke segregerer til stabile, tilbagevendende forhold understøttes yderligere en ikke-euploid model af kromosom segregering og viste en høj grad af desorganisering i disse celledelinger.

multipolær metafase er forlænget og undergår polaritet skifter

den tilsyneladende komplekse opførsel af kromosomer i MM fik os til at undersøge tidsforløbet i multipolær forhold til bipolære mitoser. For at evaluere den samlede tid tilbragt i mitose, vi først mærkede kromosomer i WiT49 og HEK293 celler med bromdeoxyuridin (BrdU). Efter standsning af cellecyklus ved serum-udsultning, blev BrdU inkorporeret i 1 time i serum-rigt medium, hvorefter cellerne blev høstet hver anden time. Den mitotiske celle pulje, der havde været i S-fase i perioden mærkning blev derefter detekteret ved anti-BrdU-antistoffer. Blandt de bipolære Mitoser i begge cellelinier, den mærkede celle pool består størstedelen af ​​delende celler efter 4 timer, mens meget få mærkede mitotiske celler forblev efter 8 timer (Figur 2D). Blandt MM, det mærkede cellepopulation også toppede efter 4 h, men så manglede at gøre en stor del af delende celler, selv efter 8 timer. Dette indikerede, at MMS tog væsentligt længere tid end bipolare celledelinger at forlade mitose.

For at validere dette fund vi skabt en stabil HEK293 transfektant udtrykker en histon-2B /grøn fluorescerende fusionsprotein, så real-time overvågning af kromosomer under celledeling (film S1) [33]. Vi fulgte derefter 10 bipolar og 12 multipolære celledelinger fra prometafasen til den efterfølgende interfase og målte intervallerne fra indledningen af ​​metafase til metafase-anafase overgang og fra metafase-anafase overgang til telofase-interfase overgang. I bipolære divisioner, den gennemsnitlige tid fra påbegyndelse af metafase til begyndelsen af ​​anafase var 34 min (interval 23-49), mens det i MM det var meget varierende, men generelt betydeligt udvidet (P 0,05; Mann-Whitney U-test) med en gennemsnit af 91 min (interval 16-220 min; Figur 2E). I modsætning hertil tiden fra indledningen af ​​anafase indtil interfase var lidt kortere i MM end i bipolære mitose (gennemsnitlig 23 minutter i forhold til 32 min; P 0,01).

Af de 12 multipolære mitose, der blev overvåget, man ikke adskille i datterceller, men anholdt i tripolær metafase og derefter vendte tilbage til interfase (figur 2F). Af de resterende 11 celler, fire undergik enten tripolær eller tetrapolar mitose uden skift i konfigurationen. De øvrige syv celler viste en eller flere polaritet switche. Én celle undergik kromosom segregering i to adskilte trin, først går fra trepolet metafase til trepolet anafase, hvori en af ​​de tre poler igen inddelt, i alt producerer fire datterceller kerner (figur 1E, Movie S2). De andre seks celler flyttet mellem forskellige metafase konfigurationer før du fortsætter til anafase (figur 1F, Film S3 og S4). Af de 11 celler, der blev fulgt fra prometafasen gennem telofase, har tre ikke viser en klar adskillelse af anafase poler, tilsyneladende går fra en kompleks metafase konfiguration direkte to telofase (Film S5), med tiden mellem disse faser bliver 10 minutter eller mindre. Fordi time-lapse billeddannelse kun blev udført i to dimensioner, kan det ikke udelukkes, at i det mindste nogle af de observerede polaritet forskydninger skyldtes rotationer af mitotiske figurer i Z-plan, omend ikke sådanne rotationer var tydelige. Ikke desto mindre viste vores data, at dynamikken i MM var tydeligt adskiller sig fra bipolar mitose, typisk med længere metafase varighed, hvor polaritet switche kan forekomme.

Søster-kromatid adskillelse er usynkroniseret i multipolær mitose

den uregelmæssige og hurtig overgang fra metafase til telofase-interfase i MM, og fraværet af klare anafase konfigurationer i nogle celler viste, at søster-kromatid adskillelse ikke kan opstå i en almindelig måde. Til overvågning søsterchromatidadskillelse nærmere i MM anvendte vi beskrevet centromerregionen sondesystem ovenfor og udvalgte sene metafase /tidlig anafase celler til analyse, hvor i det mindste et par af søster centromerer i metafase /tidlig anafase plade havde skilt, som det fremgår ved split FISH-signaler i en dobbelt-prik formation. I både WiT49 og HEK293, at langt størstedelen (97% og 98%, henholdsvis; tabel 2) af cellerne med en bipolær konfiguration, i hvilken en centromer havde adskilt viste adskillelse også på den anden centromer (s), hvilket indikerer en velkoordineret metafase -anaphase overgang i disse celler. I multipolære celler i WiT49 og HEK293, udvalgt af de samme kriterier, blev mindre end halvdelen af ​​de analyserede celledelinger tilsvarende koordineret. Faktisk 59% og 55%, henholdsvis af disse celler udviste adskillelse af kun nogle af probed søster centromerer mens de andre forblev useparerede (figur 3A). Søsterkromatid i MM var således ofte usynkroniseret, sammenlignet med normale celledelinger.

FISH-detektion (A) af kromosom 17 centromer (grøn) kombineret med immunofluorescens for beta tubulin (rød) viser separation af søster centromerer on (pil), men ikke på den anden homolog (pilespids). Immunfluorescenspåvisningen af ​​separase (orange) og beta tubulin (grøn) viser lokaliseringen af ​​separase til spindel poler på metafase (B) og tidlig anafase (C) og svag intensitet farvning i midterskrog ved telofase (D). observeres co-lokalisering af separase (rød) og centrosomer (gamma tubulin i grøn) ved begyndelsen bipolar anafase (E, øverst til venstre), mens adskillige yderligere separase foci er til stede i en tilstødende tetrapolar tidlig anafase celle (E, nederst til højre). Co-mærkning af separase (orange) og beta-tubulin (grøn), bekræfter dette fund (F, tetrapolar øverst til venstre og bipolar nederst til højre), og viser udtynding af separase i en bipolar telofase celle (G, højre), mens flere foci forblive i en tetrapolar telofase celle (G, venstre). Immunofluorescens for CCNB1 (grøn) og AURKA (rød) giver cytoplasmatisk farvning i bipolar (H) og multipolære (J) celler i metafase mens der ikke observeres nogen farvning i bipolar (I) og multipolære (K) anafase celler; AURKA pletter de pericentrosomal regioner på både metafase og anafase. Immunofluorescens for beta tubulin (grøn) og AURKB (rød) viser lokaliseringen af ​​AURKB udelukkende centromerer ved bipolar (L) og multipolær (M) metafase, og udelukkende til spindelen Mellemzone ved bipolar anafase (N); i modsætning hertil multipolære ana-telofase celler (O, P) udviser AURKB i mellemzonen samt på flere kromosomer, hvilket indikerer manglende adskille søsterchromatider af nogle kromosomer (O, pil). Immunofluorescens for beta tubulin (grøn) og MAD2L1 (rød) viser MAD2L1 lokalisering til centromerer ved bipolar prometafasen (Q); ved bipolar ana-telofase MAD2L1 foci er kun til stede i kromosomer ikke er indarbejdet i den mitotiske proces (R, pil), henviser til, at multipolær ana-telofase, flere MAD2L1 foci er til stede på kromosomer (S).

multipolær metafase-anafase overgang sker ved spindel samling checkpoint skred

for yderligere at undersøge metafase-anafase overgang i MM, vi har registreret den intracellulære lokalisering af ESPL1 (separase) protein under forskellige stadier af celledeling . I mammale celler, er denne protease er nødvendig for normal søsterchromatidadskillelse ved spaltning af cohesin s kleisin underenhed, men det er ikke nødvendigt for andre aspekter af mitotisk progression såsom cytokinese [34]. Human separase findes fortrinsvis omkring centrioler indtil sent anafase når det nedbrydes af en autokatalytisk proces udløst af sin egen aktivering af anafase-fremmende kompleks [35] – [38]. Immunofluorescens (IF) påvisning med et antistof mod den centrale del af separase (aminosyrerne 1200-1300) i bipolære Mitoser fra WiT49, HEK293, og kontrol-cellelinier uden mM (fibroblaster og CHP212 neuroblastomceller) resulterede derfor i fluorescens begrænset til spindlen poler på metafase og tidlig anafase (figur 3B og C). I bipolar metafase, var der også lejlighedsvis ekstra separase foci placeret til mitosespindelen og overlapning med placeringen af ​​kromosomer, der ligner fordelingen tidligere rapporteret i gærceller, der udtrykker en separase-GFP-fusionsproteinet [39]. I bipolære telofase celler, var separase forsvundet fra disse steder, og kunne kun observeres i et mindretal (1-10%) af celler, der viser et svagt signal på midterskrog (figur 3D). Yderligere kvantificering af det totale cellulære separase fluorescens i 30 bipolære celledelinger fra hver cellelinje viste en betydelig reduktion ved telofase, som forventet fra normal separase aktivering efterfulgt af autokatalytisk nedbrydning (P 3 × 10

-5 i alle cellelinjer, t-test, figur 2G). Separase blev derefter påvises og kvantificeres i multipolære metafase og tidlig anafase celler fra WiT49 og HEK293 (21 og 15 celler kvantificeret, henholdsvis). Svarende til bipolære divisioner, separase placeret til centrosomer i disse divisioner, men den ekstra-centrosomal fluorescens var mere udtalt end i bipolære divisioner (Figur 3E og F). I stærk kontrast til bipolære celler, multipolære telofase celler bevaret både centrosomal og spindel-placeret separase, og den samlede separase fluorescens blev ikke reduceret i denne fase i forhold til metafase (figur 2G, og 3G; P = 0,83 og 0,37 i WiT49 og HEK293 henholdsvis ).

den ufuldstændige nedbrydning af separase i telofase celler viste, at multipolære celledelinger var i stand til at omgå spindlen samling checkpoint (SAC), der normalt forhindrer metafase-anafase overgang før alle kinetochores er knyttet til modsatte spindel poler. Det er blevet rapporteret, at SAC i hvirveldyrceller ikke standse det mitotiske proces permanent. Faktisk kan celler i sidste ende blive drevet gennem mitose af en af ​​en proteasom-afhængig nedbrydning af cyclin B (CCNB) [40]. For at vurdere, om dette fænomen kunne forklare, hvorfor multipolære mitose skred gennem anafase trods en ufuldstændig separase cyklus blev CCNB1 og CCNB2 opdaget af monoklonale antistoffer i bipolære og multipolære mitose i WiT49 og HEK293. Cellerne blev cross-mærket med aurora kinase A (AURKA) antistoffer for at nemt at identificere delende celler. AURKA er lokaliseret overvejende pericentriolar region og udtrykt fra tidspunktet for centrosom overlapning på G2 indtil mitotisk exit [41]. Som forventet, at langt størstedelen af ​​bipolære prometafasen og metafasecellerne var stærkt positiv for CCNB1 og CCNB2, mens bipolære anafase-celler var negative i begge cellelinier (figur 2H og I, P 7 × 10

-15 til pro /metafase versus anafase; Fishers eksakte test; 69-197 bedømte celler i hver cellelinie). Ligeledes multipolære prometafasen og metafasecellerne var positive, mens alle anafase celler var negative for både CCNB1 og CCNB1 (figur 3J og K; P 2 × 10

-4; 20-55 celle scoret).

for yderligere at teste hypotesen om, at MMS kunne passere fra metafase til anafase af CCNB nedbrydning trods manglende helt tilfredsstille SAC, aurora kinase B (AURKB) og MAD2L1 blev påvist ved immunfluorescens i WiT49 bipolar og multipolære mitoser. Ved normal metafase, AURKB lokaliseres til centromerer indtil bi-orienteret vedhæftning af kinetochores opnås, hvorefter den flytter til spindlen Mellemzone i analy- og telofase [41]. Det vides ikke præcist, hvordan denne flytning reguleres, men det er blevet foreslået, at spændinger mellem biorienterede søsterchromatider afsondrer AURKB i den indre centromeren og dermed begrænse adgangen til denne kinase til sine substrater og lindre spindlen samling kontrolpunkt [42] . MAD2L1 lokaliserer til kinetochores kromosomer, der endnu har ikke bi-orienteret, og forsinkelser anafase debut ved at binde til og hæmme CDC20 indtil alle kromosomer er justeret på metafaseplade; efter normal metafase-anafase overgang, MAD2L1 ikke længere påvises ved centromerer [43]. Følgelig immunofluorescens for AURKB farves centromerregionen regioner af alle kromosomerne i bipolære og multipolære WiT49 prometafasen og celler i metafase (Figur 3L og M) og spindlen Mellemzone i langt de fleste (97%) af bipolære anafase celler (Figur 3N). I modsætning hertil hovedparten (76%) af multipolære ana-telofase celler udviste AURKB foci ikke kun på Mellemzone men bevarede farvning på nogle kromosomer (Figur 3 O og P; P 1,1 × 10

-16 for bipolar vs. multipolær ; 189 ana-telophases scoret). I nogle anafase celler, AURKB foci var klart synlig på kromosomer med adskilte søster kromatider (Figur 3O). Som forventet blev der påvist MAD2L1 foci på centromerer i bipolære og multipolære prometafasen celler (Figur 3. kvartal). I bipolar ana-telofase celler blev observeret MAD2L1 foci kun i sjældne celledelinger med kromosom halter (figur 3R) og størstedelen (97%) af morfologisk normale bipolære ana-telophases var MAD2L1-negative. I modsætning hertil hovedparten (92%) af multipolære ANA-telophases viste to eller flere MAD2L1 foci (figur 3S; P 2 × 10

-17 for bipolar vs. multipolær; 168 ANA-telophases scoret). Således MMS kunne nedbryde CCNB og exit mitose uden globalt opfylder SAC, som det fremgår af tilbageholdelse af AURKB og MAD2L1 brændpunkter på nogle ana-telofase kromosomer.

Funktion for spindel samling checkpoint skred er ikke begrænset til multipolær mitose

for at løse, om evnen til at omgå SAC var begrænset til multipolære celledelinger, vi udsat normale fibroblaster og WiT49 celler til spindlen forstyrrelser middel Colcemid i 18 timer, hvorefter cellerne blev farvet med antistoffer mod AURKA og CCNB1. Efter Colcemid eksponering af fibroblaster, forholdet mellem CCNB-positive celler i metafase til CCNB-negative ana-telofase celler (M /A) skiftet dramatisk fra 1,8 (133/74) til 15,2 (214/14). I eksponerede WiT49 M /A-forholdet var 2,0 (528/258) for bipolar mitose, mens det var 5,9 (100/17) for MM (P 2 × 10

-5 for bipolar vs. multipolær). Den lavere frekvens af ana-telofase konfigurationer blandt multipolære mitose er i overensstemmelse med metafase bliver forlænget i forhold til anafase i MM. Efter Colcemid eksponering, M /A-forholdet steg i både bipolar og multipolære WiT49 mitose, til 50,3 (302/6) og 27,5 (110/4), henholdsvis med ingen signifikant forskel mellem dem (P = 0,47). Således er en lille fraktion (2-6%) af mitose i både fibroblaster og WiT49 celler var i stand til at omgå spindelkonstruktion checkpoint uanset polaritet, hvilket indikerer, at dette kontrolpunkt glidning mekanisme er ikke enestående for multipolære Mitoser.

Checkpoint skred fører til hyppige nondisjunction i multipolær mitose

konstateringen af, at multipolære mitose forlades mitose uden fuldstændig separase aktivering og med tilbageholdt kromosomal MAD2L1- og AURKB foci forudsagde, at i det mindste nogle kromosomer i de resulterende datterceller ville bestå af søster kromatider der forblev fæstnet ved deres centromerer. Sådanne diplochromosomes er blevet beskrevet som en egenskab ved separase-slettede celler og er blevet taget som bevis på, at separase er nødvendig for søsterchromatidadskillelse [34]. [9].