PLoS ONE: 3-Dimensional kultur systemer for Anti-Cancer Compound Profilering og high-throughput screening Reveal Stigninger i EGFR Inhibitor cytotoksicitet Sammenlignet med monolagskultur Systems

Abstrakt

3-dimensional (3D) kultur modeller har potentiale til at bygge bro mellem monolag cellekultur og

in vivo

undersøgelser. For at drage fordel anti-cancer drug discovery fra 3D-modeller, er der behov for nye teknikker, der gør det muligt at anvende dem i high-throughput (HT) screening medgørlige formater. Vi har etableret miniature 3D dyrkningsmetoder robuste nok til automatiserede HT-skærme. Vi har anvendt disse metoder til at vurdere følsomheden af ​​normale og tumorgene bryst epiteliale cellelinjer mod et panel af onkologiske lægemidler, når de dyrkes som monolag (2D) og sfæroider (3D). Vi har identificeret to klasser af forbindelser, som udviser præferentiel cytotoksicitet over kræftceller normale celler ved dyrkning som 3D sfæroider: mikrotubulus-målrettede midler og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere. Yderligere forbedring på vores 3D-model, var overlegne differentiering af EC50-værdier i proof-of-concept-skærme opnået ved co-dyrkning af brystkræftceller med normale humane fibroblaster og endotelceller. Endvidere blev den selektive følsomhed kræftcellerne mod kemoterapeutiske observeret i 3D co-dyrkningsbetingelser, snarere end som 2D co-kultur monolag, fremhæver betydningen af ​​3D kulturer. Endelig undersøgte vi de putative mekanismer, der driver forskellige potens vises af EGFR-hæmmere. Sammenfattende vores studier etablere robuste 3D kultur modeller for humane celler til HT vurdering af tumorcelle-selektive midler. Denne metode forventes at være et nyttigt redskab for studiet af biologiske forskelle inden 2D og 3D dyrkningsbetingelser i HT-format, og en vigtig platform for nye anti-cancer drug discovery

Henvisning:. Howes AL, Richardson RD , Finlay D, Vuori K (2014) 3-Dimensional kultur systemer for Anti-Cancer Compound Profilering og high-throughput screening Reveal Stigninger i EGFR Inhibitor cytotoksicitet Sammenlignet med monolagskultur Systems. PLoS ONE 9 (9): e108283. doi: 10,1371 /journal.pone.0108283

Redaktør: Chryso Kanthou, University of Sheffield, England

Modtaget: November 1, 2013; Accepteret: August 27, 2014; Udgivet: 23 September, 2014

Copyright: © 2014 Howes et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af arra tilskud (1 RC1 EB011780-01) “High throughput screening i humane 3D sfæroider af epitel, endotel, og stromale celler” (Vuori, PI) fra HHS-National Institutes of Health-National Institute of Bioimaging og Bioengineering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne bemærker, at en eller flere af forfatterne er i øjeblikket ansat i en kommerciel virksomhed (Tanabe Research Laboratories). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

udvikling og udnyttelse af modelsystemer, der rekapitulere menneske solid tumor arkitektur og biologi er afgørende for bedre forstå patofysiologien af ​​tumorceller, og for at hjælpe til opdagelsen af ​​hidtil ukendte anticancer- behandling. Som følge heraf blevet udviklet modeller til at afspejle mikromiljøet af faste tumorer. 3D sfæroide kulturer kan rekapitulere celle-celle interaktioner, celle-matrix interaktioner, næringsstoffer og ilt gradienter, og cellepolaritet, der mangler i traditionel 2D monolagskultur [1], [2]. 3D kulturer indeholder også heterogene zoner af prolifererende, hvilende og døende celler, som ligeledes findes i humant tumorvæv og udviser forskellig følsomhed over for anti-tumor-behandlinger [1], [3]. Således 3D cellekultur-modeller bringer betydelig værdi til lægemiddelforskning og udviklingsproces som en potentiel praktisk bro mellem traditionel

in vitro

monolagskulturer og dyre

in vivo

dyreforsøg [4], [ ,,,0],5], [6].

Aktuel behandling for de fleste menneskelige kræftformer omfatter kemoterapeutiske stoffer, som er giftige over for delende celler, ofte resulterer i mange bivirkninger. Godkendelsen af ​​molekylært målrettede behandlinger, såsom proteinkinaseinhibitorer imatinib, gefitinib, og lapatinib, har bekræftet løftet om, at midler, der specifikt retter sig mod kræftceller snarere end alle delende celler resultere i færre bivirkninger.

Når der udføres Cytotoksicitetsstudier mod kræftceller, celler typisk dyrket som et monolag, hvor celle-celle-kontakter og microenvironment signaler mangler og dyrkningsbetingelserne kan derfor ikke afspejler den

in vivo

situation for cytotoksicitet og /eller lægemiddelresistens. For at omgå disse tekniske spørgsmål, er 3D-kulturer blive dannet og analyseret i en lang række interessante formater [7], [8], [9], og co-kulturer bliver anerkendt som værdifulde systemer til forudsigelse af narkotika reaktioner

in vivo

for en række forskellige sygdomme [10], [11], [12]. En opfordring til komplekse 3D kultur modeller specielt til brystkræft [13] fremhæver vigtigheden af ​​det arbejde, som Reid

et al.

At måle transkriptionelle ændringer i 3D monotypic kulturer ved hjælp af høj indhold imaging [14], samt af vores undersøgelse her, hvor vi måler cellelevedygtighed i high-throughput (HT), som kan underkastes 3D co-kulturer, der demonstrerer nytten af ​​3D co-kulturer til identifikation antitumormidler med robust selektivitet for tumorceller end normale celler.

Her har vi udnyttet en modificeret version af multi-cellulære kugleformet “hængende dråbe” teknik [15] og har optimeret det i high-density rundbundede plader, der er blevet behandlet med hydrogeler at hæmme celle vedhæftet fil, så dannelse af enkelt sfæroider af reproducerbar størrelse på tværs af flere forskellige celletyper menneskelige. Behovet for HT-medgørlige modeller for cancerforskning er for nylig blevet revideret [16]. Af de fem mest fremtrædende metoder til at generere ensartet størrelse sfæroider; det er, chitosan hydrogel co-kultur, PDMS V-bundede mikrobrønde, mikrovæskeanordninger, to-lags embryoide legemer, og multi-brønd hængende dråbe (revideret i [3] og [17]), vi ræsonnerede, at multi-brønd hængende drop model er den mest HT-modtagelig på grund af omkostningerne, møde krav væskehåndtering, og resulterer i mindre krydsreaktivitet med administrerede forbindelser. I vores undersøgelser, genereret vi 3D kulturer af normale og tumorigene bryst epitelceller egnede til robuste levedygtighed celle udlæsninger i ubearbejdet skærme og sekundær hit bekræftelse. Sfæroiderne viste sig også at være modtagelige for traditionelle biokemiske og cellebiologiske teknikker (fx immunoblotting og Immunofarvning), der tillader mekanistiske undersøgelser. Ved anvendelse af samme eksperimentelle format, er vi nu i stand til direkte at sammenligne de normale celler til tumorceller i 3D kultur.

I den foreliggende undersøgelse sammenlignede vi følsomheden af ​​normale og tumor bryst epiteliale cellelinier til 89 klinisk-relevante forbindelser i National Cancer Institute (NCI) Godkendt onkologi Drug Collection (ADC) [18]. Som forventet, observerede vi signifikant cytotoksicitet mod både normale og tumorcellelinier med en række af de stoffer, men også identificeret mikrotubulus-målrettede midler og inhibitorer epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) som vigtige klasser af forbindelser, som udviste præferentiel cytotoksicitet mod tumorceller i løbet normale celler, når de dyrkes i 3D. Vi genererede også 3D co-kulturer af humane bryst- tumor epitelceller med stromale og endotelceller og sammenlignet dem til 3D co-kulturer af stromale og endotelceller. ADC-biblioteket blev igen screenet under anvendelse af disse co-kulturer, denne gang i løbet af fire koncentrationer og med forbedret robusthed af assayet. Resultaterne af disse proof-of-concept-skærme viste, at 3D-kulturer og co-kulturer kan være værdifulde værktøjer til at identificere klinisk nyttige lægemidler, herunder molekylært målrettede midler med selektivitet for tumorceller end normale celler, der har potentiale til at reducere skadelig side -effects hyppigt observeret med cytostatika.

Materialer og metoder

pasta og reagenser

Godkendt onkologi Drug Collection (ADC) blev opnået fra National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program . Samlingen omfatter 89 stoffer, der alle fastholdes på 10 mM i 100% DMSO. For mere information, se: https://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/oncology_drugset_explanation.html [18]. Hoechst 33342 blev købt fra Invitrogen (H3570), vinblastin og vinorelbin fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og lapatinib, gefitinib, dasatinib, og Tyrphostin AG1478 fra LC Labs (Woburn, MA).

celler og antistoffer Salg

MCF-10A-celler, BT-474-celler og humane forhudsfibroblaster (Hs.58) blev opnået fra ATCC. MCF-10A-celler blev dyrket i 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 ug /ml hydrocortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /ml rhEGF, og penicillin, streptomycin og glutamin (PSG) kosttilskud. BT-474-celler blev dyrket i RPMI med 10% FCS og humane fibroblaster (HF) blev dyrket i DMEM med 10% FCS og PSG. Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC’er) blev opnået fra Lonza (Walkersville, MD) og dyrket i Lonzas endotel basalcelle Medium (EBM-2) suppleret med EGM-2 singlequots (CC-3124). Den CD31-antistof (klon JC70A) blev opnået fra Dako North America, Inc. (Carpinteria, CA) (# M0823) og anvendt i en fortynding på 1:50, det vimentin antistof (V2122-11E) fra US Biological (1:200 fortynding ), den β-actin-antistof (klon AC-40) fra Sigma (1:5000 fortynding for IB) og HER2-antistof (554.299) fra BD Biosciences (1:1000 fortynding). Den phospho-HER2-antistof (klon 6B12) (1:100 fortynding for IF, 1:1000 for IB), phospho-EGFR-antistof (klon D7A5) (1:100 fortynding for IF, 1:1000 for IB), og total EGFR antistof (klon C74B9) (1:1000 for IB) blev alle købt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

Cell dyrkningsbetingelser i 2D eller 3D

MCF-10A, BT 474, humane fibroblaster eller HUVEC’er blev opretholdt som monolagskulturer i medierne beskrevet ovenfor. For at generere 3D miniature kulturer til HTS blev celler podet ved en celleantal observeret at konsekvent danne et enkelt, ensartet rund sfæroid. BT-474-celler blev podet ved 3000 celler /brønd (i RPMI + 10% FBS + PSG medium) og MCF-10A-celler ved 1000 celler per brønd (i 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 ug /ml hydrocortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /mL rhEGF, PSG) i 96-brønds rundbundede ultralav montagepladerne (Corning # 7007). Over en fyrre-otte timers periode sfæroider selv-samlet fra de udsåede celler, en sfæroid (af -250 um i diameter) per brønd. Sfæroider overstiger 200 mikron i diameter viste sig at have hypoksiske celler placeret på det indre af sfæroid [hjælp af påvisningsreagens hypoxyprobe, NPI Inc. (data ikke vist)]. Levedygtigheden af ​​cellerne, der udgør sfæroiderne blev kontrolleret under anvendelse af ATP som udlæsning og celler viste sig at opretholde levedygtigheden i mindst fem dage efter udpladning uden at skulle skifte mediet eller tilføje kosttilskud. For HTS kulturer i 2D, fælles vævskultur-coatede, fladbundede plader med 96 brønde (Corning # 3595) blev anvendt til at dyrke celler, i mediet og ved samme celle koncentrationer som bemærket ovenfor.

I co-kulturer i 3D, blev trypsinbehandlet celler talt og blandet sammen for at blive podet i 96-brønds rundbundede ultralav montagepladerne (Corning # 7007). Som anført i legenderne, blev enten det samlede antal celler holdt ved 3000 celler per brønd eller 3000 BT-474 celler blev podet sammen med 1500 HF og /eller HUVEC’er. Som vi observeret med de monotypic sphæroider, co-kulturer også spontant dannede en klumpformet pr godt under 48-timers inkubationstid. Ved analyse af ATP niveauer, co-kultur sfæroider var rentabelt for 5 dage uden et medium ændring eller tilføjelse af kosttilskud. Alle co-kulturer blev opretholdt i en 01:01:01 blanding af RPMI: DMEM: EGM-2 komplette medier. 2D co-kulturer blev udpladet ved det samme forhold af celler i samme blandede medium, men i fladbundede 96-brønds vævskulturplader (Corning # 3595). Otteogfyrre timer efter udpladning blev 2D eller 3D celler anvendt til cytotoksicitet assays, screening eller immunfarvning som beskrevet i de efterfølgende metoder sektioner.

cytotoksicitet assay

Celler blev udsået som beskrevet for 2D eller 3D kultur, og derefter behandlet med forbindelser ved den angivne koncentration i 48 timer. At kvantificere cellulær ATP som et mål for levedygtighed, 50 pi CellTiter GLO reagens (Promega) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev orbitalt rystet i 15 minutter ved stuetemperatur for at lette lysis. Desuden blev sfæroider findelt seks gange for at fremme fuldstændig lyse. Brøndindholdet blev overført til en hvid-bottom 96-brønds plade og aflæst på en Bio-Tek luminescens pladelæser.

Immunfluorescerende analyse af kugleformede afsnit

Sfæroider blev fikseret i 1 time i zink formalin , vasket i PBS, og derefter frosset i OCT (Takeda) for kryostat sektionering. Ti mikrometer sektioner blev monteret på objektglas og farvet med passende primære antistoffer i 1 time ved 37 ° C. Efter tre grundige vaske i 1 x TBS + 0,2% Tween-20 blev objektglassene inkuberet med anti-muse Alexa 488 (Invitrogen) ved 1:500 fortynding, anti-kanin-Alexa 594 (Invitrogen) ved 1:750 fortynding og Hoechst 33342 ved en 1:10,000 fortynding i 1 time ved 37 ° C. Glassene blev vasket og monteret med Vectashield (Vector Laboratories).

Mikroskopi og 3D rendering

Lysfelt eller fluorescerende billeder (10X) blev opnået ved en AI Observer Zeiss mikroskop med Photometrics Coolsnap HQ

2camera. Konfokal (BD CARVII) optisk sektionering blev udført på z-serien fanget i 4 micron trin, og derefter udsat for 3D udfoldning via Autoquant (Media Kybernetik) software, og visualiseres i Metamorph s 4D viewer (MDS Analytical Tech).

Screening protokoller

Godkendt onkologi Drug Collection fås fra National Cancer Institute blev brugt i skærmene. For enkelt koncentration punkt primære skærme blev BT-474-celler podet ved 3000 celler /brønd (i RPMI + 10% FBS + PSG medium) og MCF-10A-celler ved 1000 celler per brønd (i 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 0,5 ug /ml hydrocortison, 5 ug /ml insulin, 5 ng /ml rhEGF, PSG) i 96-brønds Corning # 3595 (for 2D) eller Corning # 7007 (for 3D) plader. Fortyndingsforhold plader blev fremstillet ved fortynding af forbindelserne 01:01 med 50% medium /50% DMSO for at give en slutkoncentration på 5 uM per brønd. Otteogfyrre timer efter udpladning blev cellerne behandlet med biblioteket af forbindelser. Efter 48 timer af forbindelse inkubation blev cellerne lyseret med 50 pi CellTiterGLO (Promega) reagens med 15 minutters orbital omrystning ved stuetemperatur. 75 pi opløsning blev overført til Greiner Lumitrac plader og læse på en BioTek luminescens pladelæser.

For co-kultur skærme, blev seriel fortynding primær screening anvendes. Cellerne blev podet i plader med 96 brønde ved 1500 HF + 1500 HUVEC-celler per brønd for human fibroblast og human endotelcelle (HF + HE) co-kulturer (i EGM-2 komplet medium), eller 750 HF + 750 HUVEC + 1500 BT-474 til BT-474 + HF + han co-kulturer (i 1:01 RPMI + 10% FBS + PSG: EGM-2 komplet medium). Celler podet i Corning # 7007 rund bund, ultra-lave vedhæftede plader dannet et enkelt 3D klumpformet pr godt, mens celler podet i Corning # 3595 flad bund, vævskultur-behandlede plader vedhæftet som en 2D monolag. Efter 48 timers inkubation for at tillade sfæroide dannelse eller cellevedhæftning blev cellerne behandlet ved en STAR væskehåndteringsudstyr med 1 pi af forbindelse. Her blev godkendt onkologi Drug Collection anvendes til fremstilling af masterplader via fortynding med DMSO ved anvendelse af et STAR væskehåndteringsudstyr til 10 mM, 1 mM, 100 uM, og 10 uM stock plader til behandling af cellerne med fire forskellige slutkoncentrationer (100 uM, 10 um, 1 um og 0,1 pm). Lapatinib blev tilsat til hver fortynding pladen til en positiv kontrol, hvilket gav de endelige i brønde koncentrationer på 10 uM, 1 uM, 0,1 pM og 0,01 pM. Otteogfyrre timer senere blev 50 pi CellTiterGLO (Promega) reagens tilsat til hver brønd med en Multidrop Combi. Pladerne blev rystet i 15 minutter for at fremme cellelyse. Sfæroid lysis blev yderligere hjulpet ved at blande 100 pi volumen under anvendelse STAR væskehåndteringsudstyr, og derefter 75 pi blev overført til en Greiner Lumitrac 96-brønds plade til luminescens aflæsning på et PE Envision pladelæser. For enkeltlagskulturerne plader, blev 75 pi overført til Greiner Lumitrac plader per brønd, og også læse på PE Envision.

Resultater og Diskussion

Screening af 3D kulturer afslører tumorceller selektivitet for visse drug klasser

for at afgøre, om humane celler dyrket i 3D kultur tilbudt en fordel i forhold til 2D kulturer til at identificere anti-tumor-forbindelser med større selektivitet for tumorceller end normale humane celler, vi optimeret betingelser for at vokse og skærm bryst epitelial celler i to forskellige multi-brønds formater. Til dannelse 3D sfæroider, 96-brønds U-bundede ultralav vedhæftede plader blev anvendt. Dette tilskyndede cellerne tilsat til hver brønd for at aggregere sammen og danner en enkelt sfæroid da de ikke kunne holde sig til brønden overflader (figur 1A). 2D monolag blev dyrket i typisk vævskultur-behandlet, fladbundede plader med 96 brønde (figur 1b). Vigtigere blev brystcancer epithelceller (BT-474) og ikke-transformerede bryst epitelceller (MCF-10A) håndteres og indstilles på samme måde i de to forskellige multi-brønds formater, minimere andre variabler som kan påvirke lægemiddel potens. Cellerne blev udpladet, behandlet 48 timer senere med en slutkoncentration på 5 uM af forbindelse (fra NCI godkendte onkologi Drug Collection bibliotek), og analyseret for ATP indhold yderligere 48 timer senere (figur 1C). Den 48 h tidspunkt efter plettering blev valgt baseret på den nødvendige tid til sphæroider at danne og opnå reproducerbar kompakthed (baseret på klumpformet diameter) i hver brønd. Den 48 timer tid point efter lægemiddelbehandling blev identificeret som den optimale tid til at observere lægemiddel-induceret celledød, som medium ændringer tilføje ekstra udgift til HT assays og længere inkubationer resulterede i ubehandlede celler udviser celledød grundet konsumption af mellemstore næringsstoffer og opbygning af affaldsprodukter.

A anvendes en sfæroid pr brønd blev dannet i 96-brønds rundbundet fastgørelsesplader ultralave. Brightfield mikrografer af typiske BT-474 og MCF-10A-sfæroider er vist 48 timer efter udpladning

bar,

200 mikron. B, blev 2D monolagskulturer indstilles med den samme celle nummer som i de rundbundede plader (3000 celler /brønd for BT-474 eller 1000 celler /brønd i MCF-10A) i fladbundede, vævskultur-coatede plader med 96 brønde . Fluorescensbilleder er vist af typiske BT-474 og MCF-10A monolag 48 timer efter udpladning, farves for actin (rød) og DNA (blå),

bar Salg, 200 mikron. C, skematisk skærmen design.

De første resultater fra denne proof-of-concept-skærm blev analyseret ved at sammenligne de forbindelser, der producerede et positivt “hit” (defineret som faldende ATP indhold med 50% eller mere i forhold til vehikelbehandlede celler) i BT-474 tumorceller sammenlignet med MCF-10A-celler. Som man kunne forvente for forbindelser med kendte cytotoksiciteter, hitraten var høj for begge cellelinier, med 29% og 25% af forbindelser vist sig at være hits i BT-474 og MCF-10A-celler henholdsvis i 2D, 3D eller begge dyrkningsbetingelser. Sammenligning af forbindelser identificeret som rammer i de to forskellige cellelinier i det mindste i en af ​​dyrkningsbetingelserne, var der nogle forbindelser, der syntes at være selektiv for BT-474-celler over MCF-10A-celler (data ikke vist). Men som 3D dyrkningsbetingelser forventes at mere præcist afspejler tumor arkitektur, vi fokuseret på de forbindelser, der var hits under begge 2D og 3D dyrkningsbetingelser i tumorceller, men kun under 2D dyrkningsbetingelser i normale celler, hvilket tyder på fordelagtige virkninger på tumorceller i 3D-kulturer. Disse hits inkluderet molekylært målrettede forbindelser mod EGF-receptorer, såsom gefitinib og lapatinib, og det bredspektrede kinase inhibitor dasatinib.

Dosis respons eksperimenter blev derefter udført for at bekræfte resultaterne af den primære screening og til at identificere EC50-værdier , den koncentration, hvor forbindelsen reducerer cellelevedygtigheden med 50%, for de valgte forbindelser på hver celletype dyrket i 2D og 3D (tabel 1, figur 2). I MCF-10A-celler, blev resultaterne af den primære screening bekræftet for lapatinib, gefitinib, og dasatinib (tabel 1, figur 1A); under 3D betingelser, de MCF-10A-celler var relativt ufølsomme over for disse forbindelser (EC50 5 uM). De MCF-10A-celler dyrkes som 2D monolag igen udstillet EC50-værdier 5 uM efter behandling med lapatinib eller dasatinib. Som i den primære screening, BT-474 celler påvist følsomhed (EC50 10 uM) under begge dyrkningsbetingelser for disse forbindelser (tabel 1, figur 2A), og dermed en selektivitet for BT-474-celler over MCF-10A-celler blev observeret under 3D dyrkningsbetingelser, med EC50-værdien for lapatinib 1 uM i BT-474 celler og 9,8 uM i MCF-10A-celler (tabel 1). De beregnede EC50-værdier for gefitinib og dasatinib var lidt over 5 uM (6-8 uM), som kan være på grund af den anden kilde til forbindelser, der anvendes for de bekræftende dosis-respons-assays sammenlignet med den primære skærm (NCI ADC bibliotek versus LC Labs; NCI bibliotek format giver forbindelse anvendelse til kun primær screening).

A blev koncentrations-respons-kurver dannet fra BT-474 eller MCF-10A-celler, der er og behandles i tre eksemplarer med lapatinib, gefitinib, eller dasatinib som beskrevet i Materialer og metoder, samt procent levedygtighed blev beregnet ud fra luminescens aflæsninger repræsenterer ATP indhold og normaliseret til bærerbehandlede kontrol celler. B, koncentration-respons-kurver blev genereret fra BT-474 eller MCF-10A-celler, der er behandlet og i tre eksemplarer med vinblastin eller vinorelbin. Alle kurver er repræsentative data fra mindst to eksperimenter udført i tre eksemplarer.

mikrotubulus målrettet agenters vinblastin og vinorelbin også havde scoret som positive “hits” i vores primære skærm, demonstrerer svag selektivitet for BT-474-celler over MCF-10A-celler under 3D dyrkningsbetingelser. De opnåede med vinblastin og vinorelbin i den primære screening resultater blev ikke umiddelbart bekræftet i dosis-respons undersøgelser, dog (tabel 1, figur 2B). Mens vinblastin gjorde udvise større selektivitet for BT-474 celler, især når dyrkes som 3D-kulturer, EC50 værdier, vi observerede var alle 5 uM (tabel 1, figur 2B, venstre panel). I koncentration-respons-eksperimenter, vinorelbin var faktisk et hit i BT-474 celler, men ikke i MCF-10A-celler dyrket i 3D (tabel 1, figur 2B, højre panel). Men under 2D dyrkningsbetingelser, vi observeret, EC50-værdier 5 pM for begge cellelinier, selvom vi ikke identificere vinorelbin som et “hit” for MCF-10A-celler i den primære skærm. For at konstatere, om uregelmæssigheder skyldes permeabilisering problemer, vi har også bekræftet, at små fluorescerende farvestofmolekyler, af lignende størrelse til mange lægemidler, kan faktisk trænge ind sphæroidkernen (data ikke vist).

Tilsammen vores undersøgelser viser, at det er muligt at identificere tumor-selektive forbindelser ved at anvende en strategi, der anvender information fra både 2D og 3D cytotoksicitet skærme. På grund af det faktum, at vores proof-of-concept studie involverer et bibliotek, der består af kendte bioaktive forbindelser kan de observerede forskelle i følsomhed mellem normale og cancer epitelceller ikke nødvendigvis være stor nok til at sikre, at de ville være nyttige i en HTS indstilling. En fordomsfri skærm med en større små-molekyle-bibliotek vil sandsynligvis give forskellige og potentielt mere informative resultater. Også, og som det fremgår af vores opfølgende undersøgelser, en traditionel HTS der tester forbindelser ved en enkelt koncentration kan tynget af falsk positive og falsk negative og kræver omfattende opfølgning test. Et nyt paradigme, kvantitative HTS (qHTS), genererer koncentration-respons kurver for testforbindelser i et enkelt forsøg, og vil sandsynligvis afhjælpe disse problemer og kunne være en metode til en hurtig screening af nye anti-cancer-forbindelser [19].

Co-kultur modeller af normal vs. kræftceller udviser forskellige narkotika følsomheder i 3D vs 2D

for yderligere at forbedre vores screeningsmetoder, vi søgte at afgøre, om humane cancerceller dyrket som 3D co -kulturer med støtte celler såsom fibroblaster og endotelceller kunne vise sig mere nyttige til at identificere målrettede (og generelt mindre toksiske) forbindelser. Vi antager, at co-dyrkning af tumorceller med fibroblaster og endotelceller kan påvirke mikromiljøet af 3D kultur og dermed påvirke lægemiddelfølsomhed. Tumormikromiljøet, herunder stromale faktorer såsom fibroblaster og endotelceller, spiller en vigtig rolle i tumorudvikling og metastase-dannelse [20]. I normalt væv, er epitelceller adskilt fra stromaet ved interaktion med basalmembranen. I co-kulturer beskrevet heri, BT-474 celler interagerede direkte med fibroblaster og endotelceller, som kan observeres i avancerede brystcancere som invasiv duktal carcinom [6], og disse dyrkningssystemer kan derfor bedre efterligne tumormikromiljøet af avancerede cancere . Mange forskere udnytte laminin-rige basalmembran udvundet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom (Matrigel) for at fremme væksten af ​​celler i 3D [3], [5], eller i xenograftmodeller, men på bekostning af dette reagens vil være uoverkommelige for en HT-skærm og kan potentielt forstyrre visse assay udlæsninger. Således er vores model, der udnytter humane fibroblaster og endotelceller til at understøtte væksten af ​​tumor epitelceller i 3D blev udviklet som en omkostningseffektiv og praktisk alternativ.

Vi udnyttet vores model system til at sammenligne co-kulturer indeholdende tumor celler til co-kulturer mangler tumorceller. BT-474-cellelinien blev co-dyrket i 2D eller 3D (figur 3A, øverst til venstre og højre, henholdsvis) med normale humane fibroblaster og normale humane endotelceller (BT-474 + HF + HE). Interessant vi observeret, at i løbet af co-dyrkning i 3D, celletyperne gentagne gange selv-samlet til en struktur, hvor BT-474 tumorceller omgivet en kerne af fibroblaster og endotelceller. Disse tumor-celle indeholdende co-kulturer blev sammenlignet med 2D eller 3D (figur 3A, nederst til venstre og højre, henholdsvis) co-kulturer kun indeholder de normale humane fibroblaster og endotelceller (HF + HE). De CD31-positive endotelceller optrådte som fartøj-lignende formationer i HF + HE kulturer ligner hvad der tidligere er rapporteret i 3D co-kultur med hud fibroblaster og HUVEC’er [21].

A, immunfluorescerende billeder af fikseret og farvet 2D (venstre paneler) og faste, snittet og farvet 3D (højre paneler) co-kulturer farvet for den endotelcelle markør CD31 (grøn), fibroblast-rige protein vimentin (rød), og alle cellernes kerner (blå),

barer,

200 mikron. De øverste fleste paneler er BT-474 + HF + han co-kulturer, podet med 1500 BT-474 + 750 fibroblaster + 750 endotelceller per brønd. De nederste paneler er HF + han co-kulturer, podes med 750 fibroblaster + 750 endotelceller. B, skematisk af de fire-koncentrationen screening protokol i BT-474 + HF + HE og HF + HE celler dyrket i 3D eller 2D. C, Z ‘værdier genereret fra en eller to plader med 96 brønde, der er, inkuberes og behandles som beskrevet for skærmen for 2D BT-474 + HF + HE celler (øverst til venstre panel), 2D HF + HE-celler (øverst til højre panel), 3D BT-474 + HF + HE celler (nederst til venstre panel), 3D HF + HE-celler (nederst til højre panel).

skærmen på BT-474 + HF + HE og HF + HE-kulturer blev udført over fire forskellige koncentrationer af NCI ADC bibliotek, hvilket resulterer i slutkoncentrationer på 100, 10, 1 og 0,1 pM (figur 3B) i brønde. På grund af det store antal plader med 96 brønde, der kræves til screening ved fire forskellige koncentrationer, blev mere automatisering udnyttet end i det forrige skærmbillede af monotypic BT-474 og MCF-10A-cellekulturer. For at sikre, at analysen var robust nok til halvautomatisk screening blev Z ‘værdier beregnes for både co-dyrkningsbetingelser i 2D og 3D for at kvantificere statistiske reproducerbarhed assay baseret på midlerne til den maksimale og minimale signaler modtaget i hver brønd på tværs af flere plader. Denne standard beregning foretages for at sikre, at hver brønd afgiver en tilsvarende udgang (kemiluminescens indikerer ATP indhold og dermed levedygtigheden for denne skærm) således, at når der tilsættes forbindelser, et fald i kemiluminescens sandsynligvis er et resultat af forbindelsernes virkning på cellelevedygtighed og ikke blot variation på tværs af de enkelte brønde. Vi observerede Z ‘værdier større end 0,7 på tværs af alle co-dyrkningsbetingelser (figur 3C), hvilket viser en fremragende ydelse for high-throughput screening.

Resultaterne fra co-kultur skærm blev analyseret ved anvendelse af en to- trinvis fremgangsmåde. Først hits blev defineret som forbindelser der giver levedygtighed 50% på nogen af ​​de fire testede koncentrationer, i nogen af ​​de dyrkningsbetingelser. Med et så lavt niveau af stringens, 57 af de 89 forbindelser blev fundet som “hits” i den primære screening (data ikke vist); igen en forståelig resultat baseret på arten af ​​biblioteket. For det andet blev koncentrationsresponskurver genereret for hver forbindelse under hver kultur tilstand, og EC50-værdier blev tildelt eventuelt. Vi minerede EC50 data for at identificere forbindelser, der viste større toksicitet mod cancercellelinjer co-kulturer (BT-474 + HF + HE) end de normale celler co-kulturer (HF + HE), når de dyrkes i 3D, med det rationale, vores langsigtede mål er at bruge disse kulturer til at identificere nye anti-tumor lægemidler med selektiv toksicitet mod tumorvæv, mens besparende normale væv. Tolv forbindelser udviste større selektivitet for 3D BT-474 + HF + HE celler end de 3D HF + HE-celler (tabel 2), herunder endnu en gang en række forbindelser, der er målrettet receptortyrosinkinaser eller mikrotubuli.

Vi fulgte op den primære co-kultur skærm med en sekundær koncentration-respons assay for at bekræfte de tolv hits anført i tabel 2. forbindelserne blev håndplukket fra master biblioteket plader forberedt til skærmen, og anvendes til at udføre koncentration-respons-eksperimenter i samme tidsforløb (48 timer af behandlingen). Mikrotubulus-targeting forbindelser udviste en temmelig flad kurve over testede koncentrationer, men den relative styrke af lægemidler på de forskellige co-kulturer blev verificeret i de sekundære assays (figur 4). [25].